אנו מודים שיר Renjie (Core cytometry זרימת מרכז Wadsworth) לקבלת סיוע בניתוח תא והלן ג&#39;ונסון (Wadsworth מרכז בעלי חי היסטופתולוגיה Core) להכנת קטעי פרפין. אנו מודים לד&quot;ר ריצ&#39;רד א קול (Core המיקרוסקופי אור מרכז Wadsworth) לקבלת סיוע במיקרוסקופיה confocal ואוסף תמונה. ברצוננו להודות אנדי נטלי (צילום Wadsworth מרכז ואיור) לקבלת סיוע עם אנימציות. MDJ נתמך על ידי קרן מחקר מדעי החיים, הווארד יוז רפואי במכון (HHMI) מלגה. SA נתמך על ידי מלגת Wadsworth מרכז-בריאות מחקר בע&quot;מ הבתר ביצוע עצמית. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקי NIH HD061916 וGM082978.

בעלי חיים שוכנו בתנאים קונבנציונליים, ספציפיים לפתוגן חופשיים וטופלו בהתאמה מלאה לטיפולו של מרכז Wadsworth המוסדי בעלי החיים ושימוש הנחיות ועדה (IACUC). 1. Gavage האוראלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) עומס Gavage עכבר של בחירה עם אנטיגן חיידקים או מריבית באמצעות 22 G-x1.5 ב. מחט האכלה בוטה קצה (פופר המדעי, ניו הייד הפרק, ניו יורק). כרכי משלוח לא יעלו על 400 μl לעכבר. </li></ol> 2. בידוד של תאי PP עבור cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על ידי 2 CO חנק, על פי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש בהנחיות ועדה (IACUC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הבטן עם אתנול 70% או פולידין לפני הניתוח. בצע laparotomy סטנדרטי שכרוך אחת חתך (סנטימטר 1) באמצעות מספרי כירורגיות כיתה לאורך קו אמצע ההתחלה על 1.5 סנטימטרים מהבסיס של כלוב הצלעות. לחשוף את כלחלל itoneal ולזהות cecum. גוזז מעי הדק מסוף בצומת ileal-cecal ועדינות להסיר את המעי בשלמותו. הקפד לא hyperextend רקמת המעי כפי שהוא מוצא מחלל הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המעי הדק על מצע של מגבות נייר רטובות או Kimwipes. הרטב את המעי דק בעדינות עם מלח למניעת התייבשות רקמות. חזותי לזהות PPS הבודד הנמצא בצד אנטי mesenteric של המעי (איור 1). בדרך כלל, עכבר אחת יש 5-10 PPS הגלוי שמופצים באופן שווה מהתריסריון (פרוקסימלי) לאילאום (דיסטלי). בממוצע, עכברים 4 יניבו 23 PPS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים מעוגלים ניתוח, PPS הבודד עדינות בלו ולמקם אותם בתמיסת המלח המאוזנת של האנק הקר (HBSS). הערה, המספריים צריכים להיות ממוקמים עקומה כלפי מעלה מעל PP ואז בעדינות להחיל את הרקמות. הבלו רק PP (לא surrounding רקמות) והעברה לHBSS הקר. הערה: כל incubations וצעדי צנטריפוגה מנקודה זו והלאה בסעיף 2 שצריכים לעשות ב 4 ° C כדי לשמר כדאיויות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת PPS לבינוני 5 מיליליטר טחול דיסוציאציה ודגירה במשך 15-20 דקות על 37 מעלות צלזיוס בזמן נענע בחוזקה ב 250 סל&quot;ד. זמן דגירה ארוכה יותר יהיה השפעה שלילית על כדאיויות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפיק השעית תא בודדה, PPS מקום במסננת סטרילי (autoclaved) 70 מיקרומטר ניילון רשת סלולרית ולטחון בכוח את הרקמה לרשת באמצעות הבסיס של בוכנה ממזרק 1 סמ&quot;ק. לחלופין, PPS כריך בין שתי שקופיות זכוכית החלבית סטריליים מיקרוסקופ (autoclaved במעטפות) ולטחון בעדינות רקמות בתנועה קדימה ואחורה. השתמש פיפטה העברה סטרילי להעביר השעית התא לתוך צינור 5 מ&quot;ל פלקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף EDTA לריכוז סופי של 1 מ&quot;מ להשעית התא. דגירה על נדנדה ל5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעית תא למזוג דרך מסננת תא שנייה 70 מיקרומטר כדי להסיר אגרגטים סלולריים נותרים או פסולת רקמות. איסוף תאים בצינור 15 או 50 מיליליטר חרוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים כפופים לצנטריפוגה העדינה (5 דקות ב 500 XG). תאי supernatant ו resuspend למזוג בחיץ זרימה, שהוא נאגר מלוח פוספט (PBS) המכיל 1% עגל בסרום עוברי (FCS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את מספר תא וכדאיות, לדלל את התאים 1:10 לtrypan כחול וחזותי לבדוק תאים באמצעות מיקרוסקופ אור וhemocytometer. לחלופין, רוזנת דלפק תא (Invitrogen) או מכשיר דומה ניתן להשתמש כדי למנות מספרים סלולריים ואת הכדאיות באופן אוטומטי. החל עם 20-25 PPS, פרוטוקול זה אמור להניב&gt; 2.5 x 10 6 תאים בסך הכל. זה משווה ל ~ 0.8-1.2 x 10 6 תאים לכל עכבר. </li></ol> תיוג נוגדן של תאים לזרימת cytometry &lt;תחילת ol = &quot;11&quot;&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר תאים (10 5 לטובים) לתוך בארות של צלחת תחתונה 96-גם עגולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת כפוף לצנטריפוגה העדינה (5 דקות ב1000 XG), וsupernatant מזוג ידי ההיפוך בעדינות את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים במאגר בלוק Fc ולדגור על קרח במשך 15 דקות. אמנם יש מספר החוצצים לחסום FC הזמינים מסחרי (למשל חולדה אנטי עכבר CD16/CD32, BD Biosciences), אנחנו פשוט להשתמש במדיום בילה מעכברוש תא B היברידומה (ATCC 2.4.G2) שמפרישה 1 IgG חד שבטי כנגד עכברי Fcγ קולטנים לצעד זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת כפוף לצנטריפוגה העדינה (5 דקות ב1000 XG) כאמורים לעיל, וsupernatant מזוג ידי ההיפוך בעדינות את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נוגדני fluorophore-מצומדות ישירות למתלים סלולריים בדילול רצוי, ולדגור על קרח למשך 30 דקות עם נדנדה רציפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת כפוף לצנטריפוגה העדינה (5 דקות ב1000 XG), ומזוגsupernatant ידי ההיפוך בעדינות את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם 100 μl של חיץ זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צלחת ב1000 XG למשך 5 דקות, וsupernatant מזוג ידי ההיפוך בעדינות את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend חיץ 400 μl קיבעון, אשר מורכב מ300 μl של חיץ זרימה ו100 μl של paraformaldehyde 1% בPHEM חיץ (60 צינורות מ&quot;מ, 25 מ&quot;מ, HEPES 10 mM EGTA, 4 מ&quot;מ MgCl 2 בשעה 6 pH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי נושא לזרום cytometry באמצעות FACSCalibur או שווה ערך. נתח את התוצאות באמצעות גרסה הסלולרית Quest Pro תוכנת 5.2. </li></ol> 3. הכנת Cryosections PP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מראש של אוסף רקמות, להוסיף חיתוך טמפרטורה אופטימלי מתחם (אוקטובר) ל7x7x5 תבניות בסיס פלסטיק מ&quot;מ. כמו כן להכין ברכה של חנקן נוזלי (מ&quot;ל&gt; 750) בדלי דיואר או קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר ולבצע laparotamy, כפי שתואר לעיל. הסרת מעי ומניח על מגבות נייר רטובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אללבודד PPS לcyrosectioning, לחתוך קטעי 0.5 סנטימטר רוחביים של מעי דק המכילים PP אחת ורקמת העברה לצלחת פטרי המכילה PBS. לשטוף בעדינות לומן של מגזרים אלה עם PBS על מנת להסיר שאריות צואה לא רצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קטעי רקמת מעי אנכי בתוך תבניות בסיס המכילות אוקטובר לטבול את התבניות בחנקן נוזלי ולאפשר לרקמה להקפיא לחלוטין (1-2 דק &#39;). הצבע של אוקטובר ישתנה מברור ללבן כאשר הרקמה קפוא לחלוטין. . לקירור הדרגתי יותר (לדוגמה, כדי להפחית את הפיצוח של אוקטובר), עובש לטבול באמבט של isopentane המקורר עם אדי חנקן נוזליים שים לב: יש להרכיב משקפי בטיחות מתאימים בעת עבודה עם חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תבניות בסיס קפואות מהחנקן הנוזלי באמצעות מלקחיים ולאפשר את התבנית לחמם בטמפרטורת חדר רק מספיק זמן (~ 10-15 שניות) כדי לאפשר את הקצוות של בלוק אוקטובר כדי לרכך. אז כדי להסיר את החסימה מקפואה של אוקטוברהעובש, היפוך העובש ולחץ בעדינות על הגב כדי להוציא את הגוש על פיסת 4 4 x סנטימטר נקיה של רדיד אלומיניום. מייד עוטף את הרקמה בנייר הכסף ומניח בשקית דגימה שכותרתו מאוחסן בחנקן נוזלי או בקרח יבש. לחלופין, להעביר את הרקמות במקפיא (&lt;-20 ° C). השתמש ברקמות תוך שבוע, אחרת את אובניים יהפוך פריך. </li></ol> Cryosectioning <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryosection הרקמות באמצעות יקה CM3050S cryomicrotome או שווה ערך. טמפרטורת החדר בcryostat צריכה להיות מוגדרת -21 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתור לסעיפים 12-14 שמיקרומטר בעובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף חלקים על פישר SuperFrost שקופיות מיקרוסקופ זכוכית פלוס (או שווה ערך) ולבדוק חזותיים באמצעות מיקרוסקופ אור רגיל בעצמה נמוכה. אם חלקים מרובים עוברים נאספו בשקופית, לוודא שהם התקבצו יחדיו ליישומי מכתים במורד זרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות לאהוא מחליק בטמפרטורת חדר ובשקופית תיבה, באופן אידיאלי, להשתמש בם בתוך ימים ספורים. </li></ol> תיוג נוגדן של Cryosections וניתוח מיקרוסקופיה confocal <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות לטבול באצטון (או מתנול) בצנצנת רקמות מכתימות או מדפים עבור 2 דקות. דגירה ממושכת עלולה לגרום לרקמות להתנתק מהשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות לצנצנת מכתימה חדשה ולשטוף 3 פעמים עם PBS-T (1X PBS עם 0.05% Tween-20) ל3 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקיף את החלקים עם עט הידרופובי ImmEdge. זה יבטיח כי יישארו מרותקים ריאגנטים ונוגדנים לאזור זה במהלך incubations. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת שקופיות בחיץ בלוק (2% סרום עיזים בPBS) למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתא humidified, מוגנות מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת שקופיות עם חיץ בלוק Fc (ראה לעיל) למשך 10 דקות בשעת 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובל את השקופיות בPBS-T ואזור יבש סביב סעיפים באמצעות Kimwipes או רקמות סופגות אחרות.יש להיזהר שלא לגעת בחלקי הרקמה בפועל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי רקמות ריבוד עם פתרון עיקרי נוגדן ודגירה במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס בתא humidified. נוגדן ראשוני מדולל בדרך כלל במאגר הבלוק לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל. השימוש בנוגדנים עיקריים שכותרת-ישירות רצוי, כי ניתן לשלב עד שלושה נוגדנים ישירות בשלב זה. נוגדנים שכותרת-ישירות גם לבטל את הצורך בצעדי דגירת נוגדנים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפים מחליקים 3 פעמים (5 דקות כל אחת) על ידי טבילה בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם, שקופיות אינקובטורים דרושות עם נוגדנים משניים רלוונטיים למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתא לחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפים מחליקים 3 פעמים (5 דקות כל אחת) על ידי טבילה בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת שקופיות במשך 4 דקות בparaformaldehyde 1% בחיץ PHEM, כפי שתוארו לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את שקופיות עם PBS לדקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזור יבש סביב סעיפים באמצעות Kimwipes או אחר לספוגרקמת אוזן גרון. יש להיזהר שלא לגעת בחלקי הרקמה בפועל. באמצעות פיפטה או טפטף, מניח בעדינות טיפה להאריך בינוני זהב הרכבה ישירות על הסעיף. החל coverslip זכוכית על ההרכבה הבינונית לטפל כדי למנוע בועות. השתמש בנייר סופג כדי לספוג כל מדיום הרכבה עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם coverslips לשקופיות מיקרוסקופ עם לק המסחרי ולאפשר לאוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפו בשקופיות עם ליקה TCS SP5 confocal מיקרוסקופ או שווה ערך. </li></ol>

<ol>
	<li>Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA's+complex+roles+in+immunity+and+mucosal+homeostasis+in+the+gut.">Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut.</a> Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).</li><li>Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissue.">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue.</a> Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).</li><li>Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+intestinal+homeostasis+and+disease.">Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease.</a> J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).</li><li>Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GALT:+organization+and+dynamics+leading+to+IgA+synthesis.">GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis.</a> Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).</li><li>Iwasaki, A., Kelsall, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+distinct+Peyer's+patch+dendritic+cell+subsets+and+their+recruitment+by+chemokines+macrophage+inflammatory+protein+(MIP)-3alpha,+MIP-3beta,+and+secondary+lymphoid+organ+chemokine.">Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine.</a> Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).</li><li>Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+dendritic+cells.">Mucosal dendritic cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).</li><li>Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer's+Patch+Dendritic+Cells+Sample+Antigens+by+Extending+Dendrites+Through+M+Cell-Specific+Transcellular+Pores.">Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores.</a> Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).</li><li>Lelouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+and+dead+cells+are+internalized+by+a+unique+subset+of+Peyer's+patch+dendritic+cells+that+express+lysozyme.">Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme.</a> Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).</li><li>Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+toxin+induces+migration+of+dendritic+cells+from+the+subepithelial+dome+region+to+T-+and+B-cell+areas+of+Peyer's+patches.">Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).</li><li>Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA+possesses+intrinsic+modulatory+properties+stimulating+mucosal+and+systemic+immune+responses.">Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses.</a> J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).</li><li>Kelsall, B. L., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+dendritic+cells+are+present+in+the+subepithelial+dome+and+T+cell+regions+of+the+murine+Peyer's+patch.">Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch.</a> J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).</li><li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer's+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells.">Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer's+patches+in+adult+mice.">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקולים מקבילים להכנת PP הכנות תא בודדות לזרימת ניתוח וcryosections cytometric ופונקציונלי לimmunostaining. שני שיטות לשחזור ומאוד נגישים, ובלבד cytometer זרימה וcryostat זמינים. לחוקרים בפעם הראשונה אותו יש לציין כי בהשוואה לטחול, תשואות סלולריות הכוללות מPPS הן דלות יחסית. עם זאת, הפרוטוקול שמתארים בדרך כלל תשואות בין 0.8-1.2 10 6 תאי PP כלל x מעכבר אחת. סולם למעלה הוא אפשרי, למרות שאנחנו בדרך כלל לא יותר מ 20-25 ברכה PPS, משום שמניסיוננו, צבירה מתרחשת ותשואות סלולריות (וכדאיות) ירידה במידה רבה. מצד השני, אנחנו לא ממליצים להשתמש בפחות מ 15 PPS עבור פרוטוקול זה, כמסה קריטית יש צורך לבצע את התאים בהצלחה בהליך הבידוד כולו. אם כדאיויות תא מקסימליים היא בעדיפות לזרם פונקציונלימבחנים, אנו ממליצים שמדגם קטן של תאים מבודדים יהיה נתון למכתים יודיד propidium כדי לאפשר gating יותר מדויק ברכת הקיימא של תאים מסך אוכלוסיית תאי PP. לבסוף, יש לציין כי השיטה שלנו היא נוחה לתא מיון יישומים אם משנה תא מסוים הוא רצוי להעברת מאמצת או בניתוח מבחנה, למשל. האוסף של PPS לcryosectioning הוא פשוט יחסית, למרות שבפועל החתך של רקמות PP יכול להיות מאתגר. זה הכרחי, למשל, שרקמות PP כראוי מכוונות בתבניות (כלומר בניצב לבסיס של העובש) כדי להבטיח שסעיפים הרוחביים האמיתיים מתקבלים. אנו מציעים רקמות PP Snap-מקפיאות ולאחר מכן להעמיד את cryosections להחשת fixatives כמו אצטון או מתנול לשמר תגובתיות נוגדנים (&quot;antigenicity&quot;), למרות שהחשנו תוצאת fixatives בירידה בresol הסלולרית ומשנה הסלולר הכלליתution. אם שימור antigenicity אינו מדאיג במיוחד, אז אנחנו ממליצים על השימוש בקישור ההדדי fixatives כמו paraformaldehyde (PFA), תוצאה שבשימור טוב יותר של מבנים תאיים ומשנה הסלולר. אכן, PFA ניתן להשתמש כדי לתקן רקמות לפני cryosectioning. פשוט לטבול PPS נחתך טרי בכמויות עצומות של 4% PFA ל&gt; 2 שעות, לשטוף רקמות עם PBS להסיר מקבע עודף, לאזן רקמות בסוכרוז (15%) אם רוצה, ולאחר מכן להטביע באוקטובר, כמתואר לעיל. רקמה אז יכולה להיות cryosectioned, אבל חייבת להיות חסומה בפתרון גליצין (0.1 מ &#39;ב PBS במשך 15 דקות) כדי להרוות תגובתי PFA שיורים לפני immunostaining. לבסוף, בשעה שתארנו פרוטוקולים לתיוג immunofluorescent של cryosections PP, אותם סעיפים אלה ניתנים לאימונוהיסטוכימיה (IHC) באמצעות ערכות IHC זמינות מסחרי (למשל מעבדות וקטור, Burlingame, ע&quot;א). לIHC, חיוני לכלול peroxidase חסימה או quencהינג צעד בפרוטוקול, כperoxidases אנדוגניים הוא תופעה שכיחה מאוד ברירית המעי. אחרים ציינו כי לIHC, זלוף לב של העכברים עם paraformaldehyde 4% ב PBS משפר שימור רקמות. לסיכום, אנו מספקים פרוטוקולים מקבילים ומשלימים לניתוח הכמותי ופונקציונלי של תאי PP Murine, כולל הלימפוציטים וDCs. הכנת השעיות תא בודדות מאפשרת כמותית ותפקודית בניתוח מבחנה מסוגי התאים העיקריים בPPS, בעוד immunolabeling של cryosections מספקת מידע בנוגע ללוקליזציה של סוגי תאים ספציפיים, כמו גם אינטראקציות תא סלולרי שקיימות באתר. המגבלה העיקרית של שתי הגישות הללו היא שלא מייצג הדמיה &quot;בזמן אמת&quot; של אינטראקציות PP תא סלולרי. לעת עתה לפחות, PPS הוכיח אטום להדמית intravital, טכניקה שגרמה למהפכה בהבנה של הלימפוציטים dynamics בבלוטות הלימפה היקפיות. עד שהמחסומים הטכניים המגבילים הדמית intravital של PPS הם להתגבר, הפרוטוקולים מפורטים במאמר זה להכנת PP הכנות תא בודדות לcryosections PP לimmunostaining זרימת ניתוח וcytometric ופונקציונלי יישאר האמצעי העיקרי של חקירה והבנה של הפונקציות החיסוניות של משנה ספציפי -אוכלוסיות של תאים בPPS, אתרים אינדוקטיביים העיקריים של רקמות הלימפה מעיים הקשורים.

הטלאים של Peyer (PPS) הם אגרגטים מאקרוסקופיות של זקיקי הלימפה מאורגנים נוכחיים לאורך המעי הדק של בני אדם ועכברים (איור 1), ומהווים את האתרים העיקריים שבו תגובה חיסונית ברירית הם יזמו נגד אנטיגנים תזונתיים, חיידקי commensal, פתוגנים של חיידקים, וחיסונים דרך פה 1-4. בניגוד לרקמות הלימפה היקפיות אחרות כגון הבלוטות הלימפה mesenteric, PPS חסר lymphatics הביא. כאמורות, תגובות חיסוניות בהסתגלות PPS מונעות בתגובה לאנטיגנים הנגזרים מלומן המעי. הדגימה של אנטיגנים luminal מושגת על ידי האפיתל זקיק המשויך (Fae), אשר מורכב משני enterocytes ותאי אנטיגן דגימה הידועים כתאי M. מתחת Fae, באזור הכיפה תת אפיתל (SED), נמצאת רשת של תאים דנדריטים (DCS) מתערבים עם מקרופאגים, תאי B, ותאי T מסוג CD4 + 5-9. במרכזו של כל אחד follicl ימפואידית PPדואר הם תאי דנדריטים זקיקים (FDCs) ומרכז התא B עשיר מרכזי נבטי, מוקף באזורים עשירים בinterfollicular תא T. דגימת האנטיגן ע&quot;י תוצאות PPS בפיתוח + plasmablasts IgA B הסלולרי ותאי CD4 + מפעיל וזיכרון שזרע propria lamina הסביבה ולספק חסינות למגוון רחב לפולשים ריריים. לנתח את האירועים החיסוניים המורכבים הקשורים לאנטיגן דגימה, עיבוד, והצגה בPPS הוא משימה מרתיעה, בהתחשב בעובדה שתאי PP מהווים רק חלק זעיר מכלל תאי הלימפה ברירית מעי. כדי לסייע באפיון במבחנה של תאים בסביבה זו, אנו מספקים פרוטוקול להכנה כלל תאי PP עכבר לזרימת ניתוח cytometric ופונקציונלי, כמו גם פרוטוקול להכנת PP cryosections למיקרוסקופיה וimmunohistology immunofluorescence. הפרוטוקול שלנו לבידוד, אפיון, וimmunostaining של mousדואר תאי PP הוא לא רומן כשלעצמה, כפי שמעיד עובדה שיש אזכורים רבים שראשיתה יותר מ 25 שנים המצטטים את הטכניקות הללו 5,6,9-11. במקום זאת, הפרוטוקול שלנו מספק שיטה יעילה (ויזואלי) לחוקרי איסוף PPS בפעם הראשונה. את הטכניקות שבם הן שולט בקלות וללא קושי תנבנה מספר גדול של תאים עם&gt; 90% כדאיויות תא. פרוטוקול cryosectioning מניב חלקים סדרתיים לשעתקו מאוד אידיאלי המתאימים מכתימה immunofluorescence והדמית confocal. יתר על כן, הפרוטוקול שלנו משלים את שני מאמרים יופיטר אחרונים אחרים. הראשון, על ידי פוקודה ועמיתיו, מתאר את השימוש במבחני הלולאה ileal גבעול להעריך את הספיגה של חיידקים פתוגניים על ידי תאי PP M 12. השני, על ידי Geem ועמיתיו, מתאר את הבידוד והאפיון של DCS ומקרופגים מרירית מעי העכבר, אך אינו כולל באופן מפורש PPS מהניתוח שלהם 13.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריט </td><td> חברה </td><td> חתול. # </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> מתחם אוקטובר </td><td> רקמה-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 7x7x5 תבניות בסיס מ&quot;מ </td><td> Fisherbrand </td><td> 22-363-552 </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge עט </td><td> מעבדות וקטור </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost פלוס שקופיות </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4951 </td><td></td></tr><tr><td> אדג&#39; Rite Blade </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4280L </td><td></td></tr><tr><td> אנטי עכבר CD11c-PE </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td> אנטי עכבר CD45R/B220-APC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553092 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD3 מאוס-FITC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 561798 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי עכבר CD4-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553652 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי עכבר CD8-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553032 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD19 מאוס-PercP </td><td> BioLegend </td><td> 115531 </td><td></td></tr><tr><td> הפתרון של האנק המלח המאוזן (HBSS) בלי אדום פנול </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 14175-079 </td><td></td></tr><tr><td> מסננת תא 70 מיקרומטר </td><td> BD פלקון </td><tד&gt; 352350 </td><td></td></tr><tr><td> בינוני דיסוציאציה טחול </td><td> טכנולוגיות תאי גזע </td><td> 7915 </td><td></td></tr><tr><td> סרום עיזים </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-072 </td><td></td></tr><tr><td> Fc בלוק </td><td> ATCC 2.4.G2 </td><td> HB-197 </td><td> מפקחים מתקבלים מ2.4.G2 שורת התאים </td></tr><tr><td> מספריים מעוגלים </td><td> FST </td><td> 14061-09 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> ליקה </td><td> 3050S </td><td></td></tr><tr><td> FACS Calibur </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> דלפק סלולרי רוזנת </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hematoxylin </td&gt; <td> ריצ&#39;רד אלן </td><td> 7211 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin </td><td> ריצ&#39;רד אלן </td><td> 71304 </td><td></td></tr><tr><td> פורמלין </td><td> Starplex מדעי </td><td> 3661 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טבלת 1. ריאגנטים וציוד המשמשים במחקר זה. </td></tr></tbody></table>

isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches

הטלאים של Peyer (PPS) הם רכיבים בלתי נפרדים מרקמות הלימפה מעיים הקשורים (גאלט) ולשחק תפקיד מרכזי בimmunosurveillance והומאוסטזיס מעיים. אנטיגנים חלקיקים וחיידקים בחלל המעי נדגמים ברציפות על ידי תאי PP ז אפיתל זקיק המשויך (Fae) והועברו לרשת בסיסית של תאים דנדריטים (DCS), מקרופאגים ולימפוציטים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקולים בי PPS Murine הם (אני) ניתק להשעיות תא בודדות ונתון לcytometry הזרימה (ii) שהוכן עבור cryosectioning וimmunostaining. עבור cytometry זרימה, PPS הם מכאני ניתק ולאחר מכן מסונן דרך 70 מיקרומטר ממברנות ליצור השעיות תא בודדות ללא תאי אפיתל ופסולת גדולים. החל עם 20-25 PPS (מארבעה עכברים), שיטה מהירה ולשעתק זו מניבה אוכלוסייה&gt; 2.5 x 10 6 תאים עם&gt; 90% כדאיויות תא. לcryosectioning, טריPPS ly המבודד שקוע בטמפרטורה בינונית אופטימלי חיתוך (אוקטובר), Snap-קפוא בחנקן נוזלי, ולאחר מכן נותח באמצעות cryomicrotome. קטעי רקמה (5-12 מיקרומטר) הם אוויר יבשים, קבועים עם אצטון או מתנול, ולאחר מכן נתונים לimmunolabeling.

ניתוח cytometric זרימת השעיות monodisperse של תאי PP כלל מגלה הבחנה ברורה בין הכנות סלולריות טובות וגרועות. בהכנות סלולריות טובות עם מעל 80% כדאיות, הרוב המכריע של תאים להדגים פיזור גבוה קדימה (FSC), חיווי של נפח תא גבוה, ופיזור נמוך צד (SSC), חיווי של גרעיניות נמוכה של תאים (איור 2 א). בניסוי זה, אנחנו גם מוכנים מכוון &quot;הכנת תא מסכנת&quot; על ידי דוגרי תאי PP במהלך שלבי הבידוד בטמפרטורת חדר (במקום על קרח), ובשלב האחרון, דגירת תאים עם PBS בתוספת 1% FCS (במקום PHEM מאגר). בהכנות הסלולריות המסכנות האלה, רוב תאי התערוכה FSC הנמוך והגבוה SSC והם מחוץ לשער R1 המצוין (איור 2 ב &#39;). תאים אלה כנראה עוברים אפופטוזיס ו / או נימק. איור 3 מדגים את השימוש בקוקטייל של עד ארבע דינוגדני fferent fluorophore-מצומדות חד שבטיים להיפלות בין מגוון של סוגי תאים בתא בודדה השעיות PP. תיוג עם מקבץ של בידול (CD) סמני CD19 ולחשוף B220 שתאי B מהווים ~ 60% מהאוכלוסייה בתא המגודרת PP (איור 3 א). תת תאי T ספציפי אפשר למנות בקלות על ידי תיוג כפול עם נוגדנים כנגד CD3 CD4 ו( איור 3B) או CD3 וCD8 (האיור 3C). CD4 + ותאי T CD8 + מהווים 23% ~ ו ~ 9%, בהתאמה של תאי PP כלל. DCS תת כותרת CD11c + (האיור 3D) וCD103 + (לא מוצג) גם אפשר למנות בשיטה זו. CD11c + DCS לתרום לכ 8% מהאוכלוסייה המגודרת המוחלטת, שהיא שווה בערך 10000 DCS לPP. זה בדיוק מסכים עם מספר DCS נצפה על ידי אחרים 14. בקרב אוכלוסיית CD11c + + B220. תוצאות דומות מתקבלות כאשר תאי PP נאספים מC57B / 6 עכברים (איור 3E). הכנות &quot;עניות&quot; סלולריות יכולות להוביל לתוצאות מטעות מאוד, בעיקר משום שתאים מתים או גוססים נוטים לקשור נוגדנים אינם ספציפי. כפי שמוצג באיור 4, האוכלוסייה של תאים שמכתימים חיובי עבור סמן תא B (B220) ואת סמני תאי T (CD3, פנל; CD4, לוח ב &#39;) עשויים להשתנות על ידי יותר מ 3-קפל שבין טוב ו הכנת תא רעה. איור 4 מראה ייצוג יתר של + B220 וCD3 + תאים הכפולים חיובי (לוח א &#39;), כמו גם B220 + B תאי CD4 + ותאי T תאים כפולים חיוביים (לוח ב&#39;) בהכנות סלולריות עניות. כאמור, הפער בB היחסי וכמות תאי ה T בטוב מול עניים נובע מחייב הלא ספציפי של נוגדנים עשוי למות תאים. הפרוטוקול שלנו גם מוכיח כי cryosections PP עכבר ניתן לניתוח היסטופתולוגיות, כמו גם immunolabeling. איור 5 משווה צביעת H &amp; E של פרפין העכבר PPS (פנלי A, B) וחתכים קפואים (הלוח &#39;ג). בעוד סעיפי פרפין מספקים רזולוציה גבוהה יותר ברמה התאית, כאשר מוכתמים על ידי H &amp; E, האזורים הבהירים וכהים של מרכזים הנבטיים PP הם בקלות רבה יותר מסומנים בסעיפי cryosection (איורי 5A-C). cryosections H &amp; E-מוכתם שימושי להשוואת Side-by-צד עם cryosections immunolabeled. Cryosection PP אופייני מוכתם נוגדנים אנטי CD3 לתייג תאי T, הנוגדנים נגד CD11c להדגיש DCS ונוגדנים אנטי-B220 כדי להדגיש תאי B מוצג באיור 6. <img src="/files/ftp_upload/50167/50167fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1. patc של העכבר Peyerהס. תמונה של מעי דק עכבר נכרת טרי עם שלוש PPS גלוי (חצים לבנים). את PPS מופיע כשלפוחית ​​מבנים דמויים (5 5 מ&quot;מ) בצד אנטי mesenteric של serosa המעי. <img src="/files/ftp_upload/50167/50167fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. תאי PP סה&quot;כ נותחו על ידי cytometry זרימה. השעית monodisperse של תאי PP כלל היה נתון לcytometry זרימה באמצעות BD FACSCallibur. () דוגמה להכנת תאים טובה. רוב התאים להדגים פיזור גבוה קדימה (FSC), חיווי של נפח תא גבוה, ופיזור נמוך צד (SSC), חיווי של גרעיניות נמוכה של תאים. תאים אלה נמצאים בארגזים בR1. תאים עם FSC הנמוך והגבוה SSC, ממוקם מחוץ לשער R1, נחשבים מת או גוסס תאים. (ב &#39;) דוגמה להכנת תא מסכנת, שברוב התאים נמצאים מחוץ לשערR1 בשל FSC הנמוך והגבוה SSC. <img src="/files/ftp_upload/50167/50167fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. ניתוח נציג זרימה cytometric של לימפוציטים PP. השעיות Monodisperse של תאי PP כלל מודגרות עם נוגדנים עיקריים fluorophore-מצומדות ולאחר מכן נתונה לcytometry זרימה. () תיוג CD19 וB220 של תאי B PP. (BC)-תיוג כפול של אוכלוסיות תאים כלל עם CD3 CD4 ו( B) או CD8 (ג&#39;) למנות את תת תאי T ספציפי. (ד) כפול תיוג של אוכלוסיות תאים כלל ל( סמן התא B) B220 וCD11c (סמן DC). (ה) השוואה B220, CD3 , CD4, וצביעת CD11c על תאי PP מBALB / ג ועכברי C57B / 6. <img src="/files/ftp_upload/50167/50167fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. נתונים מטעים זרימת cytometry כתוצאה מהיערכות סלולרית PP עניה. (פנלים משמאל) וטובים (פנלים נכונים) הכנות סלולריות PP עניות הוכתמו (A) נוגדנים ל B220 וCD3 לבדל אוכלוסיות תאי B ו-T, או (ב) נוגדנים לB220 וCD4 לבדל את תאי B מקבוצת משנה של תאי T. יש בדרך כלל מעט מאוד תאים של תאים שמכתימים חיובי עבור CD4 B220 וCD3 או, כפי שמוצגים בלוחות השמאל. לעומת זאת, בהכנות סלולריות עניות תאים כפולים חיוביים מהווים כמעט 20% מהתאים בסך הכל. ראה טקסט לפרטים נוספים בנוגע למה שמהווה הכנת תא &quot;עניים&quot;. <img src="/files/ftp_upload/50167/50167fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. סעיפי PP דואר מוכתם הנציג H &amp;. פרפין מוטבע-סעיפים (א, ב) או cryosections (C) של ileal PPשלו היו מוכתם בH &amp; E ודמיין ידי מיקרוסקופ אור. הערה כי האזורים הבהירים וכהים של זקיקי הלימפה הנתחמים בקלות בcryosections, בהשוואה לסעיפי פרפין. קיצורים: V, villous; Fae, אפיתל זקיקים הקשורים; SED כיפה, תת אפיתל; זקיק LF, הלימפה. <img src="/files/ftp_upload/50167/50167fig6.jpg" alt="איור 6" /> איור 6. תיוג Immunofluorescent של cryosections PP Murine. טרי לחתוך קטעי רקמה של עכבר אחת PP היו אוויר יבש, אצטון קבוע, ומוכתמים ב() נוגדנים FITC-מצומדות אנטי CD3 לתייג תאי T באזורים-הזקיקים בין ו propria lamina; (ב) הנוגדנים PE-מצומדות אנטי CD11c להדגיש DCS בSED, וכן (ג) נוגדנים APC-מצומדות אנטי B220 כדי להדגיש תאי B (ד &#39;) o מורכבת.f תמונות בלוחות חשמל המופק באמצעות תוכנת פיג&#39;י. סרגל קנה מידה הוא ~ 100 מיקרומטר.

Watch this Scientific Journal Video about Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches at JoVE.com

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer&#039;s Patches

יש התעניינות הולכת וגובר בהבנת הפונקציות החיסוניות של אוכלוסיות מסוימות של תאים בתיקונים של Peyer (PPS), אתרים אינדוקטיביים העיקריים של רקמות הלימפה מעיים כרוכות בכך. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מקבילים להכנת PP הכנות תא בודדות לניתוח cytometric זרימה וcryosections PP לimmunostaining.

וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

isolating-immunostaining-lymphocytes-dendritic-cells-from-murine

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

32.4K Views.  New York State Department of Health. יש התעניינות הולכת וגובר בהבנת הפונקציות החיסוניות של אוכלוסיות מסוימות של תאים בתיקונים של Peyer (PPS), אתרים אינדוקטיביים העיקריים של רקמות הלימפה מעיים כרוכות בכך. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מקבילים להכנת PP הכנות תא בודדות לניתוח cytometric זרימה וcryosections PP לimmunostaining.

Video: Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

הדור וסימון של Murine מח עצם הנגזרות תאים דנדריטים עם nanocrystals Qdot ללימודי מעקב

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

הערכת התפתחותם של תאי Murine Plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של Peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות Hematopoietic

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

במבחנה הדור של תאי דנדריטים Murine Plasmacytoid מנפוצים הלימפה אבות באמצעות מערכת מזין AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...