אנו מודים ריאטה תרופות על מתן CDDO-DFPA. אנו גם להכיר את התמיכה של ג'יין, לי כיסא זיידמן בחדשנות סרטן בילדים (ג'ון Letterio). עבודה זו נתמכה על ידי משרד ההגנה [W81XWH-12-1-0452]; יוזמת המחקר אנג'י פאולר המתבגר ויאנג של סרטן מבוגרים, בכל מקרה מקיף במרכז לחקר הסרטן; ופרס קלהאן בוגר מלומד עבור מצב Hsi-ג'ו ווי מקרן F.J. קלהאן.

כל מחקרים בוצעו בהתאם הליכים שאושרו על-ידי את Case Western Reserve הספר לרפואה של אוניברסיטת של אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש.
1. מכינים תאים דנדריטים הנגזרות מח העצם (BMDCs)
<ol><li>לעקר את כל מכשירי הניתוח באמצעות autoclaving, לבצע את הניסוי ב- class II בטיחות ביולוגית ארון עם נהלי בטיחות הופקעו.</li>
	<li>המתת חסד C57BL/6 עכברים בגיל 8-10 שבועות באמצעות CO2 קאמרית. הנח את העכבר על לוח ויבתר ולשטוף עם 70% אתנול. לסלק עצמות השוקה-שוקית, עצם הירך באמצעות מספריים כירורגיים ולמקם אותם עם 70% אתנול בצלחת תרבות 10 ס מ.</li>
	<li>השתמש להבים כירורגי, מלקחיים לנתח רקמות משם ככל האפשר על המכסה של 10 ס מ תרבות מאכל ובידוד tibias ועצמות ירך כדי למקם אותם עם 70% אתנול בצלחת תרבות 6 ס מ.</li>
	<li>השתמש להבים כירורגי כדי לקצץ בשני הקצוות של tibias ועצמות ירך. השתמש 3 מ"ל PBS במזרק 3 מ עם מחט 23 גרם לרוקן את התוכן של מח מקצה אחד של עצמות כדי צינור חרוטי המכיל 12 ml PBS. חזור על שלב 3 x בכל קצה של עצמות.</li>
	<li>Centrifuge התליה תא ב g x 300 במשך 5 דקות.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא עם 1 מ"ל ACK מאגר lysing במשך 5 דקות להסיר תאי דם אדומים.</li>
	<li>להוסיף 9 מ ל PBS לדלל מאגר lysing ACK, צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בינונית תרבות 10 מ"ל (RPMI-1640 פלוס -גלוטמין, 10% FBS, חומצת אמינו שאינן הכרחיות 1% (100 x), 10 מ מ HEPES, 50 ננומטר β-mercaptoethanol ו- 5% פניצילין/סטרפטומיצין). הערה: רמת אנדוטוקסין חייב להיות פחות מ 0.1 האיחוד האירופי/מ ל FBS.</li>
	<li>לעבור התליה תא דרך מסננת תא 40 μm לקחת 20 µl תא השעיה, לערבב עם µl 80 של trypan כחול כדי לספור את מספר תאים חיים על-ידי שימוש cytometer.</li>
	<li>התאם מספר תאים לעונה 1 פרק 106 תאים למ"ל ng/ml 15 GM-CSF, 10 ננוגרם למ"ל IL-4.</li>
	<li>צלחת 3 מ"ל של עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל בבאר בכל צלחת 6-ובכן, דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 95% הלחות בחממה2 CO. הערה: תאי מח העצם של עכבר אחד הוא סביב 3-5 x 107 תאים, המציין כי זה יכול להיות ממוקם 2 כדי 3 צלחות 6-. טוב.</li>
	<li>ביום 3, הסר כל 3 מ ל תרבות בינוני מכל קידוח, להוסיף PBS טריים 2 מ"ל כל היטב, ואז בעדינות מערבולת את הצלחת כדי להבטיח הסרת כל התאים שאינם מחסידי.</li>
	<li>החלף בינוני תרבות טריים 3 מ ל 15 ננוגרם למ"ל GM-CSF ו 10 ננוגרם למ"ל IL-4 כל היטב. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 95% הלחות בחממה2 CO.</li>
	<li>יום 5, ישירות להוסיף עוד 3 מ"ל טריים תרבות בינוני עם 15 ננוגרם למ"ל GM-CSF ו 10 ננוגרם למ"ל IL-4 מכל קידוח. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, ו- 95% הלחות בחממה2 CO. הערה: הנפח הכולל כל היטב זה עכשיו 6 מ.</li>
	<li>יום 7, לשים את הצלחת על קרח במשך 10 דקות. בעדינות pipette המדיום תרבות בבאר כל מכך באופן רופף-כנצרות BMDCs כמו iDCs לתוך ההשעיה. הערה: המקרופאגים חסיד עדיין מחוברים לצלחת. טמפרטורה נמוכה ובעדינות ההליכים הם המפתח כדי למנוע DC הפעלה להשפיע עוד ניסויים.</li>
	<li>Centrifuge התליה תא ב g x 300 במשך 5 דקות, resuspend טריים בינונית תרבות לניסויים נוספים. הערה: BMDCs יכול להיות מזוהה עם התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית נוגדן CD11c על ידי cytometry זרימה, הראנו את האסטרטגיה שלנו חסימה של BMDCs לניסויים נוספים באיור1.</li>
</ol>2. איפיון TolDC ג'ין ופרופיל חלבון
<ol><li>צלחת ml 2 של עונה 1 פרק 106 BMDCs/ml לכל באר היטב 6-צלחת עם תרבות במדיום נוכחות או היעדרות של 100-400 nM CDDO-DFPA עבור המקננת h 1-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 95% הלחות בחממה2 CO. הערה: CDDO-DFPA, triterpenoid סינתטי, מהווה גורם גרעיני (נגזר erythroid 2) - כמו - 2 פקטור (Nrf2) משרן והמעכב הפקטור הגרעיני-κB (NF-κB). להחיל סוכנים אחרים עבור אינדוקציה של TolDCs מתוך iDCs, כגון IL-10, ויטמין D3, דקסמתזון או מפרץ 11-7085, ולשנות את שלב זה כדי תנאי האופטימלי עבור כל סוכן.</li>
	<li>להוסיף 10 או 100 ננוגרם למ"ל של LPS עבור המקננת 4-24 שעות כדי לגרום mDCs (זמן הדגירה היא שונה בשל מדידה mRNA או חלבון).</li>
	<li>בעדינות pipette המדיום תרבות בבאר כל ולקצור התליה תא באמצעות פיפטה 1 מ"ל. צנטריפוגה-300 גרם x עבור 5 דקות לאסוף את התאים ואת תגובת שיקוע, בהתאמה.</li>
	<li>לנתח את ליגנדים משטח של כדורי תא ידי cytometry זרימה, כגון ליגנדים מופחתים: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL או מעכבות ליגנדים: PD-L1, PD-L2, ILT3, ILT4.</li>
	<li>לבודד את הרנ א מ כדורי תא ולנתח את ה-RNA ודוגמאות supernatant עבור ציטוקין פרופיל, גנים וחלבונים הרמות על ידי PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR) ואליסה, בהתאמה. הערה: לדוגמה, ציטוקינים דלקתיים: TNF-α, IFNγ, ציטוקינים EDN-1, IL-6, IL-12, ו- IL-23 או אנטי דלקתיות: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1, הו-1.</li>
</ol>3. להעריך את תפקוד TolDCs במבחנה , In Vivo
<ol><li>
תא T התפשטות Syngeneic Assay
	<ol>
<li>לעקר את כל מכשירי הניתוח באמצעות autoclaving, לבצע את הניסוי ב- class II בטיחות ביולוגית ארון עם נהלי בטיחות הופקעו.</li>
		<li>להכין מאגר MACS באמצעות 0.5% אלבומין שור (BSA) ו- 2 מ מ EDTA 500 מ"ל PBS. לעקר את המאגר על-ידי סינון דרך מסנן 0.2 µm. הערה: לשמור על המאגר על הקרח במהלך הניסוי הבא.</li>
		<li>כדי להשיג CD4+ T תאים, המתת חסד OT-II T-cell קולטן (TCR) העכברים הטרנסגניים בגיל 8-10 שבועות באמצעות CO2 קאמרית. הנח את העכבר על לוח ויבתר ולשטוף עם 70% אתנול. לבודד את הטחול מהצד השמאלי של הבטן באמצעות מספריים כירורגיים וחדים.</li>
		<li>הכניסו את הטחול עם 2 מ"ל PBS לצלחת תרבות 6 ס מ ולהשתמש האחורי של דחיפה-מקל של מזרק 3 מ"ל מינצ הטחול על-ידי העברת מסננת תא 40 μm.</li>
		<li>לאסוף את ההשעיה תא צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.</li>
		<li>Resuspend בגדר תא ב- 400 μl מאגר מקינטוש.</li>
		<li>להוסיף 100 μl של CD4+ תא T ביוטין-נוגדן קוקטייל ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. הערה: קוקטייל הנוגדן נקשר על סוגי תאים אחרים מלבד CD4+ T תאים, כגון CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, אנטי-MHC class II, טר-119, TCRγ/אלפא.</li>
		<li>הוסף μl 300 MACS מאגר μl 200 של חרוזים אנטי ביוטין (טבלה של חומרים) ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.</li>
		<li>מקום חיבר העמודה של הספירות פרומגנטי (טבלה של חומרים) ומסנן הכנה להפרדות צבע ביחד על המגנטי שדה, לשטוף אותו עם 3 מ"ל של מאגר מקינטוש.</li>
		<li>מוסיפים 9 מ של מקינטוש מאגר התאים ואת צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.</li>
		<li>Resuspend בגדר תא ב- 3 מ"ל של מאגר MACS, החל על העמודה. לאסוף זרימה דרך CD4 המכיל+ T תאים.</li>
		<li>לשטוף את העמודה עם עוד 3 מ"ל של מקינטוש מאגר ולאסוף גם את הזרימה דרך.</li>
		<li>כדי להשיג DCs פאן הטחול, המתת חסד C57BL/6 עכברים בגיל 8-10 שבועות באמצעות CO2 קאמרית. הנח את העכבר על לוח ויבתר ולשטוף עם 70% אתנול. לבודד את הטחול מהצד השמאלי של הבטן באמצעות מספריים כירורגיים וחדים. הכניסו את הטחול לצלחת תרבות 6 ס"מ המכילה 2 מ"ל של פתרון collagenase D (2 מ"ג/מ"ל collagenase D מומס HBSS המכילים סידן, מגנזיום).</li>
		<li>להזריק 1 מ"ל collagenase D לפתרון הטחול פעמיים עם מזרק 1 מ"ל, מחט 25 גרם. לחתוך הטחול לחתיכות קטנות עם מספריים קטנות.</li>
		<li>לנער, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 25 דקות.</li>
		<li>להוסיף 500 μl של 0.5 M EDTA בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. הערה: השלבים של 3.1.13-3.1.14 הם קריטיים להגדלת היבול של בקרי תחום.</li>
		<li>כעת להשתמש האחורי של דחיפה-מקל של מזרק 3 מ"ל מינצ slurry את הטחול על-ידי העברת מסננת תא 40 μm ולאסוף התליה תא על-ידי צריך שתוציאו ב g x 300 במשך 5 דקות.</li>
		<li>Resuspend בגדר תא ב- 350 μl של מקינטוש מאגר, 50 μl של ה-FcR חסימת ריאגנט μl 100 של פאן הדנדריטים תאים ביוטין-נוגדן קוקטייל ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הערה: נוגדן קוקטייל נגד אנטיגנים זה אינם מבוטאים על-ידי בקרי.</li>
		<li>לשטוף את התאים על-ידי הוספת 9 מ של מאגר MACS, צנטריפוגה ב g x 300 במשך 5 דקות.</li>
		<li>Resuspend בגדר תא ב- 800 μl MACS המאגר ולהוסיף 200 μl של אנטי ביוטין חרוזים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.</li>
		<li>חזור על השלבים של 3.1.9-3.1.11 כדי לאסוף DCs.</li>
		<li>לשטוף עמודה עם עוד 3 מ"ל של מקינטוש מאגר פעמיים, גם לאסוף את הזרימה דרך.</li>
		<li>לפנק את 2 x 105 Dc/ml נוכחות או היעדרות של 100-400 nM CDDO-DFPA ב C ° 37 עבור 1 מר בנפרד, תווית CD4+ תאי T (1 x 107/ml) עם 1 μM CFSE ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, לשטוף עם PBS , והתאם את עוצמת הקול כדי להשיג ריכוז סופי 2 x 106 T תאים/מ ל....</li>
		<li>בשלב הבא, בצלחת 96-ובכן, בשיתוף תרבות 100 μl של התאים הדנדריטים שטופלו באותו אמצעי אחסון של CD4 התווית על-ידי CFSE+ T תאים, שניהם שנאסף על השלבים שלעיל כדי לקבל 1:10 יחס. עכשיו להוסיף 100 ננוגרם למ"ל אובלבומין (פשוט) פפטיד 323-329 לכל טוב, למדוד עוצמת CFSE של תאי T על ידי cytometry זרימה לאחר 2-3 ימי דגירה. הערה: את מספרי הטלפון הנייד ואת יחס של DCs ו- T תאים מוטבו מן העבודה הקודמת שלנו37.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
זירוז פסיבית EAE באמצעות הזרקת BMDCs פעמו עם מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (ש א) (35-55)
	<ol>
<li>צלחת ml 2 של עונה 1 פרק 106 BMDCs/ml לכל טוב טוב 6-צלחת בינונית-תרבות ב נוכחות או היעדרות של 100-400 nM CDDO-DFPA עבור המקננת 1שעות.</li>
		<li>להוסיף 10 ng/ml של LPS עבור ומוכנסות 24 שעות.</li>
		<li>להוסיף 100 μg/ml של ש. א. (35-55) עבור ומוכנסות 4 שעות.</li>
		<li>לקצור את הבולם תא, צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.</li>
		<li>Resuspend בגדר תא עם PBS ולספור את התאים.</li>
		<li>Subcutaneously להזריק μl 200 2 x 106 תאים עכברים C57BL/6 נקבה בת 8-10 שבועות (100 μl לתוך כל רגל).</li>
		<li>ביום של הזרקת BMDC ו- 48 שעות. מאוחר יותר, להזריק 200 ng של שעלת רעל (PTX) כל עכבר.</li>
		<li>חזור על צעדים 3.2.6-3.2.7 פעם בשבוע, למשך 4 שבועות רצופים.</li>
		<li>להעריך את הסימפטומים הקליניים של EAE מדי יום באמצעות הקריטריונים הסטנדרטיים37 (0.5-רפוי הזנב, הזנב 1-צליעה, חולשה של הגפיים האחוריות 2 בינוני, חולשה של הגפיים האחוריות 3-חמור, שיתוק גפיים הינד 4-שלמה, 5-quadriplegia או אדעך המדינה, 6-מוות).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל זה עשוי לשמש reproducibly ליצירת iDCs, לאחר מכן להבדיל אותם לתוך TolDCs, אנו מציעים כי זה ניתן להחיל כדי להעריך את היכולת של סוכנים היעד מולקולריים חדשים כדי לעודד את TolDC פנוטיפ. כפי שמתואר בדו ח זה, עקבנו רצף שבו קודם ניתחנו ביטוי TolDC של ליגנדים פני השטח על ידי cytometry זרימה, ואח?...

תאים דנדריטים (Dc) הם חלק אינטגרלי של מערכת החיסון המולדת, היו ראשית גילה, מאופיין על ידי ראלף שטיינמן, כהן Zanvil בשנת 1973 כמו הצגת אנטיגן מקצועיים ראשי תאים1. DCs הוכחו לשחק תפקיד חשוב בהפעלת מערכת החיסון על ידי הצגת אנטיגנים מעובד על תאי T ותאי B באמצעות קומפלקסים histocompatibility הגדולות (MHC) באיברים הלימפה משני כדי לקשר את מולדת ומערכות החיסון מסתגלת2. המערכת החיסונית יונקים, יש לפחות שתי קטגוריות של בקרי קבוצת מחשבים אשר תוארו מיאלואידית DCs ו- plasmacytoid בקרי קבוצת מחשבים (שיתפקדו)3. תאים מיאלואידים DCs, ידוע גם בשם DCs קונבנציונאלי (cDCs), מאופיינים על ידי הביטוי של CD11c, ניתן להבחין כמו בקרי קבוצת מחשבים (iDCs) לא בוגר חוץ גופית בתוך מח העצם ובתאים או ומונוציטים דם היקפיים באמצעות פקטור גרנולוציט-מקרופאג-המושבה-מגרה (GM-CSF) ו- IL-4 במאתר או מין אנושי, בהתאמה4.
הפעלת 'סכנה' אותות, כגון פתוגן-הקשורים לתבניות מולקולרית (PAMP) או נזק-הקשורים דפוסי מולקולרית (רטיבות), יניעו ההבשלה iDCs לכיוון immunogenic DCs בתור בוגר בקרי קבוצת מחשבים (mDCs) דרך מחייבות קולטנים שונים של זיהוי תבנית DC משטח5. Immunogenic Dc נוסף פריים התפשטות תא T נאיבי ובידול דרך קולטנים upregulation של MHCII2, ליגנדים costimulatory (CD80, CD86 ו- CD40)6, ציטוקינים מגשרים מסיסים אחרים7. מפל של המתווך הפרו דלקתיים הפקה של Dc Immunogenic חיוני עבור תא T בתיווך ציטוקין בידול. לדוגמה, IFN-γ ו- IL-12 נחוצים Th1 בידול8 ו- IL-1, IL-6, ו- IL-23 הם קריטיים עבור תמים קיטוב תא T לכיוון תאי Th179. למרות DCs בוגרת מגיבים אנטיגנים זרים, הפעלת DC לא מבוקרת על ידי העצמי-אנטיגנים עלול לגרום סובלנות אבלציה ולטפח התפתחות מחלות אוטואימוניות על ידי יצירת autoreactive T תאים אשר הפעלת מוביל הרס רקמות10 .
דיווחים אחרונים סיפקו ראיות ברורות של DC פלסטיות, ומעוררות את יכולתם לתקשר ברמזים שונים בתוך microenvironment רקמות שלהם וכדי להבדיל לערכות אפקטור ברורים/DC מדכא. המתווכים אנטי-דלקתי, כגון IL-1011, TGF-β12והו-113 הוכחו לשחק תפקיד חשוב בדיכוי המערכת החיסונית על ידי גרימת tolerogenic בקרי קבוצת מחשבים (TolDCs). TolDCs אלה לרכוש פונקציות רגולטוריות, לדכא את תא T התפשטות14. יתר על כן, העדר גירוי משותף על-ידי בקרי ואת הייצור של מגשרים אנטי דלקתיות של TolDCs לתרום אינדוקציה של הרגולציה ותאי T (Tregs) והן גם ביעילות לעכב Th1 והן Th17 בידול והתרחבות15. אחרי שני עשורים, הפוטנציאל הטיפולי של TolDCs דווח על ידי מספר חוקרים. במחקרים אלה, הממשל של לשעבר-vivo המופקים סימפטומים פתולוגיים TolDCs לא רק יושבחו במודלים פרה שונה של מחלות אוטואימוניות16 אבל גם הוביל את הפיתוח של רגישות המערכת החיסונית בחולי17 ,18. מעניין, היום הטיפול TolDCs נחשב כמו גישה חלופית או משלים עבור מחלות אוטואימוניות בניסויים קליניים מספר, כולל מסוג 1 סוכרת19, דלקת מפרקים שגרונית20, 21, טרשת נפוצה (MS)22,23,24, ו- מחלת קרוהן25.
ישנם מגוון של פרוטוקולים נועדה לפתח TolDCs, מספר מעבדות דיווחו על שיטות הדור, אפיון פנוטיפי של TolDCs. שיטות אלה ניתן לייצר reproducibly TolDCs במבחנה אבות hematopoietic, לשמור אותם על stably tolerogenic המדינה ויוו26,27,28,29. ניתן להמיר את iDCs TolDCs על ידי חשיפה שונים immunomodulatory סוכנים תרופתי או ציטוקינים אנטי דלקתיות. לדוגמה, ויטמין D3 הוא סוכן תרופתי ידוע ידוע אל להגדיל ייצור IL-10, לדכא את הפרשת IL-12 מ- Dc, ובכך להגביר את הפונקציה לדיכוי המערכת החיסונית שלהם30. יתר על כן, כאשר DCs חשופים לגירויים דלקתי חזק, כגון lipopolysaccharides (LPS), מספר סוכנים תרופתי כגון דקסמתזון31, rapamycin32קורטיקוסטרואידים33 הוכחו כדי לעודד פנוטיפ TolDC על-ידי הפחתת ביטוי משטח DC CD40, CD80, CD86 ו- MHCII34. IL-10 ו- TGF-β הן רוב: לימודי ציטוקינים אנטי דלקתיות לזירוז DC סובלנות35 , חשיפה והמצוות הן של ציטוקינים אלה הוכחו לגרום פנוטיפ tolerogenic ב Dc36.
מאז tolerogenic ש-DC מוגדרת על-ידי מאפיינים פונקציונליים ולא על ידי סמנים פנוטיפי, שם הוא נהדר צריך לפתח שיטה עקבית של אפיון הסלולר ופונקציונליים של TolDCs. יתר על כן, נוהל קפדני ועקבית יש ליצור את אפיון פנוטיפ tolerogenic DC והערכת עקבי אם אנחנו רוצים ביעילות, reproducibly להשוות את היכולת של סוכנים חדשים כדי לעודד את פנוטיפ TolDC ב מעבדה. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט עם שיטות שלב אחר שלב כדי לבודד את iDCs של אבות hematopoietic של עכברים וכדי לאחר מכן לנתח את היעילות של סוכנים חדשים תחת הערכת היכולת שלהם להמיר iDCs TolDCs, מתן של חזקים אפיון פנוטיפי פונקציונלי של TolDCs גם במבחנה וגם בתוך vivo. תיאור זה כולל שיטה משוכללת כדי לאפיין את TolDCs על ידי שלהם ליגנדים משטח, ציטוקינים בפרופיל פונקציות לדיכוי המערכת החיסונית במבחנה. אנו מספקים גם דוגמה של שיטה כדי לחקור את היישום טיפולית פוטנציאל של אלה TolDCs במודל של ניסויים פרה-קליניים של MS, ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE). פרוטוקול הוקמה זה יסייע החוקרים להעריך את היכולת של סוכנים חדשים כדי לקדם את אינדוקציה של TolDCs, יקל על המאמץ להרחיב את היקף הפיתוח טיפוליות TolDC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CDDO-DFPA (RTA-408)</td>
			<td>Reata Pharmaceuticals</td>
			<td>in house synthesis</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse GM-CSF</td>
			<td>Peprotech Inc.</td>
			<td>315-03</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-4</td>
			<td>Peprotech Inc.</td>
			<td>214-14</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS)</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>L2880</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>516732</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3097</td>
			<td>EAE induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG (35&#8211;55) peptide</td>
			<td>21stCentury Biochemicals</td>
			<td>in house synthesis</td>
			<td>EAE induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 plus L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD80</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557227</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD86</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555665</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated PD-L1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>124307</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated MHCII</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-112-388</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated CD11c</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340544</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched PE</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-091-835</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched APC</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-091-836</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423801</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan dendritic cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309626</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309588</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309626</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309588</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>A2058</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase D</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>11088858001</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin (OVA) peptide 323&#8211;329</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>O1641</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01168134_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-12a TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00434165</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DY419-05</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse EDN-1 ELISA</td>
			<td>RayBiotech</td>
			<td>ELM-EDN1-1</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00443258</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse TNF-&#945; Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MTA00B</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00446190</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>M6000B</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-23a TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01160011</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-23 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DY1887-05</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm99999154_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01288386_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01178820_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Heme Oxygenase 1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13248</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8226</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad Inc.</td>
			<td></td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and functional characterization of murine tolerogenic dendritic cells

מערכת החיסון פועלת על ידי שמירה על איזון הדוק בין תיאום תגובות נגד אנטיגנים זרים, שמירה על מצב שאינו מגיב נגד אנטיגנים העצמי, כמו גם אנטיגנים נגזר מאורגניזמים commensal. שיבוש הומאוסטזיס החיסון הזה יכול להוביל לדלקת כרונית להתפתחות של מחלת חיסון עצמי. תאים דנדריטים (Dc) הם תאים אנטיגן מקצועיים של מערכת החיסון המולדת הכרוכה בהפעלתו תמים T תאים ליזום תגובות מערכת החיסון כנגד אנטיגנים זרים. עם זאת, ניתן להבחין DCs גם לתוך TolDCs שפועלים כדי לשמר ולקדם את תא T סובלנות וכדי לדכא את התאים אפקטור תורמים להתפתחות של תנאים או דלקת אוטואימונית או כרונית. ההתקדמות האחרונה בהבנה שלנו של TolDCs מרמז כי DC סובלנות יכולה להיות מושגת על ידי להתכוונן מצבם בידול. תופעה זו הובילה לצמיחה אדירה בפיתוח טיפולים TolDC רבים כשל חיסוני נגרמת בשל לפרוץ סובלנות המערכת החיסונית. להצלחה בלימודים במודלים מאתר פרה מחלת חיסון עצמי יש נוספת לאמת את התועלת immunotherapeutic של TolDCs בטיפול של הפרעות אוטואימוניות. היום, TolDCs הפכו כלי immunotherapeutic מבטיח במרפאה עבור החזרתו של רגישות המערכת החיסונית בהפרעות חיסוניים שונים על ידי מיקוד תגובות אוטואימוניות פתוגניים תוך השארת חיסון הגנתי ללא פגע. למרות מגוון של אסטרטגיות הוצע על ידי מעבדות מרובים כדי לגרום TolDCs, יש אין עקביות באפיון של פנוטיפ הסלולר ופונקציונליים של תאים אלה. פרוטוקול זה מספק מדריך צעד אחר צעד להתפתחות של מח עצם-derived DCs במספרים גדולים, שיטה ייחודית המשמשת כדי להבדיל אותם לתוך TolDCs עם triterpenoid סינתטי 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic חומצה-difluoro-propyl-אמיד (CDDO-DFPA), של טכניקות השתמשו כדי לאשר פנוטיפ שלהם, כולל ניתוחים של חיוניות חתימות מולקולרית של TolDCs. לבסוף, אנו מראים שיטה להערכת הפונקציה TolDC על-ידי בדיקת שלהם לדיכוי המערכת החיסונית בתגובה במבחנה וב -vivo במודל של פרה של טרשת נפוצה.

בידול ובחירה של BMDCs:
מח עצם ובתאים היו תרבותי שלם בינוני RPMI בנוכחות GM-CSF ו- IL-4 כדי להתמיין iDCs במשך 7 ימים (איור 1 א'). יום 1, התאים היו קטנים בגודלם, הראו מורפולוגיה כדורית. כביסה עם PBS לפני ההחלפה של בינוני טריים יום 3 עזר...

Watch this Scientific Journal Video about Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells at JoVE.com

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפתח, איפיון תאים דנדריטים tolerogenic (TolDCs), להעריך את השירות immunotherapeutic שלהם.

פיתוח ואפיון פונקציונאלי של תאים דנדריטים מאתר Tolerogenic

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

development-functional-characterization-murine-tolerogenic-dendritic

Research

JoVE Journal

Medicine

10.5K Views.  Case Western Reserve University. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפתח, איפיון תאים דנדריטים tolerogenic (TolDCs), להעריך את השירות immunotherapeutic שלהם.

Video: Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are associated with obesity, though the precise underlying mechanisms that contribute to the disease are currently being delineated.2,3 Several small animal models of obesity have been developed and are employed in a variety of studies.4 A critical component to these experiments involves the collection of regional and/or total animal fat content data under varied conditions.
Traditional experimental methods available for measuring fat content in small animal models of obesity include invasive (e.g. ex vivo measurement of fat deposits) and non-invasive (e.g. Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA), or Magnetic Resonance (MR)) protocols, each of which presents relative trade-offs. Current invasive methods for measuring fat content may provide details for organ and region specific fat distribution, but sacrificing the subjects will preclude longitudinal assessments. Conversely, current non-invasive strategies provide limited details for organ and region specific fat distribution, but enable valuable longitudinal assessment. With the advent of dedicated small animal X-ray computed tomography (CT) systems and customized analytical procedures, both organ and region specific analysis of fat distribution and longitudinal profiling may be possible. Recent reports have validated the use of CT for in vivo longitudinal imaging of adiposity in living mice.5,6 Here we provide a modified method that allows for fat/total volume measurement, analysis and visualization utilizing the Carestream Molecular Imaging Albira CT system in conjunction with PMOD and Volview software packages.

Fat content analysis is routinely conducted in studies utilizing murine obesity models. Emerging methods in small animal CT imaging and analysis are providing for longitudinal detail rich fat content analysis. Here we detail step by step procedures for performing small animal CT imaging, analysis, and visualization.

פילוח ומדידה של כמויות השומן מודלים השמנת יתר Murine באמצעות קרני רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and standardized not only for the study of allo-rejection but also between syngeneic strains for examining mechanisms of ischemia-reperfusion injury after lung transplantation. Although the application of the rat and other large animal model 2 contributed significantly to the elucidation of these studies, the scope of those investigations is limited by the scarcity of knockout and transgenic rats. Due to no effective therapies for obliterative bronchiolitis, the leading cause of death in lung transplant patients, there has been an intensive search for pre-clinical models that replicate obliterative bronchiolitis. The tracheal allograft model is the most widely used and may reproduce some of the histopathologic features of obliterative bronchiolitis 3. However, the lack of an intact vasculature with no connection to the recipient's conducting airways, and incomplete pathologic features of obliterative bronchiolitis limit the utility of this model 4. Unlike transplantation of other solid organs, vascularized mouse lung transplants have only recently been reported by Okazaki and colleagues for the first time in 2007 5. Applying the basic principles of the rat lung transplant, our lab initiated the obliterative bronchiolitis model using minor histoincompatible antigen murine orthotopic single-left lung transplants which allows the further study of obliterative bronchiolitis immunopathogenesis6.

Obliterative bronchiolitis is the key impediment to the long-term survival of lung transplant recipients and the lack of a robust preclinical model precludes examining obliterative bronchiolitis immunopathogenesis. Unlike other solid organ transplants, vascularized mouse lung transplantation has only recently been developed. Here we show our independently developed obliterative bronchiolitis model after murine orthotopic single-lung transplantation.

פיתוח Bronchiolitis סותם במודל Murine של השתלת ריאות Orthotopic

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133<sup&gt; +</sup&gt; תאי גזע סרטני משוערים מלנומה

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have been developed to facilitate the study of the molecular and cellular pathophysiology of this disease. In this manuscript we describe specific techniques for the quantification and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus and ascending aorta. The advantage of this procedure is that it provides an accurate measurement of the cross-sectional area and total volume of the lesion, which can be used to compare atherosclerotic progression across different treatment groups. This is possible through the use of the valve leaflets as an anatomical landmark, together with careful adjustment of the sectioning angle. We also describe basic staining methods that can be used to begin to characterize atherosclerotic progression. These can be further modified to investigate antigens of specific interest to the researcher. The described techniques are generally applicable to a wide variety of existing and newly created dietary and genetically-induced models of atherogenesis.

We describe procedures to quantify and characterize atherosclerotic lesions in mouse models using precision sectioning of the aortic sinus and ascending aorta combined with histochemical and immunohistochemical analysis.

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

בידוד ואפיון פונקציונלי של אדם חדרית שריר לב מדוגמאות כירורגי טריות

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

הערכה של קובץ מצורף סרטן השחלות אליפטית ופלישה של תאי mesothelial בזמן אמת

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

תפוקה אפיון גבוה של תאי גזע בוגרי תכנון הנדסי למשלוח גורמים טיפוליים לאסטרטגיה הגנה עצבית

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The approach allows unbiased identification and functional characterization of individual colorectal afferents. Extracellular recordings of propagated action potentials (APs) that originate from one or a few afferent (i.e., single-fiber) receptive fields (RFs) in the colorectum are made from teased nerve fiber fascicles. The colorectum is removed with either the pelvic (PN) or lumbar splanchnic (LSN) nerve attached and opened longitudinally. The tissue is placed in a recording chamber, pinned flat and perfused with oxygenated Krebs solution. Focal electrical stimulation is used to locate the colorectal afferent endings, which are further tested by three distinct mechanical stimuli (blunt probing, mucosal stroking and circumferential stretch) to functionally categorize the afferents into five mechanosensitive classes. Endings responding to none of these mechanical stimuli are categorized as mechanically-insensitive afferents (MIAs). Both mechanosensitive and MIAs can be assessed for sensitization (i.e., enhanced response, reduced threshold, and/or acquisition of mechanosensitivity) by localized exposure of RFs to chemicals (e.g., inflammatory soup (IS), capsaicin, adenosine triphosphate (ATP)). We describe the equipment and colorectum&#8211;nerve recording preparation, harvest of colorectum with attached PN or LSN, identification of RFs in the colorectum, single-fiber recording from nerve fascicles, and localized application of chemicals to the RF. In addition, challenges of the preparation and application of standardized mechanical stimulation are also discussed.

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

באפיון פונקציונלי מבחנה של עכבר המעי הגס מביא Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

הכנה<em&gt; במבחנה</em&gt; אפיון ממוגנטים miR-modified לתאי אנדותל

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...