עבודה זו נוסדה על ידי מכון קירי, פריז, צרפת. האלונקה מכאנית תוכננה על ידי דמיאן Cuvelier (Institut קירי) ומיוצרת על ידי GREM (Mecanique-grem.com). הדפוסים על PDMS פותח על ידי עמאר Azioune (אוניברסיטה השנייה בורדו).

1. פסיבציה של PDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי חתיכה של PDMS כ 35 מ&quot;מ x 20 מ&quot;מ מגיליון שהוכן מראש (למשל, GelPak, כפי שמופיע בטבלה של חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החלק העליון ושכבות מגן התחתונה של פלסטיק (במידת צורך) ולהשתמש בפינצטה כדי למקם את PDMS בפלסטיק (לא תא התרבות שטופלה) צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את PDMS עם אתנול 70% למשך 5 דקות על הכתף ב30 תנודות / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את פני השטח על ידי זורם אוויר על זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאיר עם UV העמוק (λ = 180 ננומטר) במשך 5 דקות במרחק מנורות UV של כ -5 ס&quot;מ (ראה גיליון חומרים למנורת התייחסות; פרמטרים ישתנו למנורות שונות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 200 μl של פתרון EDC / NHS עבור כל PDMS חתיכה (זה חייב להיות מוכן רק לפני השימוש בגלל תגובתיות של הפתרון דועכת בעניין של שעות). עבור 1 מיליליטר של 0.05 M MES + 0.5 חיץ M NaCl ב-pH 6.0, להוסיף 11.5 מ&quot;ג sulfo-NHS ו19.2 מ&quot;ג של EDC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברPDMS גיליונות מצלחת פטרי למכסה של צלחת פטרי, שלא היה מוארת. זה יבטיח כי הסביבה של PDMS מאוד הידרופובי ולהקל על השלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פתרון EDC / NHS ודגירה של 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף EDC / NHS עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פתרון PLL-G-PEG (0.5 מ&quot;ג / מיליליטר בHEPES pH 10 מ&quot;מ 8.6) ו דגירה מהשעה 3 בלילה בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את PLL-G-PEG עם מים. PDMS פסיבציה (פונקציונליות עם PLL-G-PEG) יכול להיות מאוחסן במשך כמה ימים ב 4 ° C. </li></ol> 2. דפוסים של PDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח דף PDMS ולמקם אותו על photomask קוורץ סינטטי הנושא את microfeatures לדפוסים (ראה איור 1). הנח את צד PDMS הנושא את PLL-G-PEG מול צד הכרום של photomask. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאיר למשך 7 דקות באמצעות photomask במרחק מנורות UV של כ -5 ס&quot;מ.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף מים על המסכה + PDMS ולקלף את PDMS לאט את המסכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם פתרון פיברונקטין ב50 מ&quot;ג / מיליליטר במאגר HEPES ב-pH 8.6 במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. אפשר להשתמש באחרים חלבוני ECM, אבל אלה לא נבדקו עם פרוטוקול זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף עם PBS. </li></ol> 3. הרכבה ההתקנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר PDMS פסיבציה בעבר על מכשיר המתיחה (ראה דיון לפתרון בעיות). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צד אחד של PDMS לחלק הקבוע מהאלונקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הצד השני לחלק הנייד של האלונקה ללא הידוק רב מדי של גיליון PDMS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך מלבן של PDMS (22 מ&quot;מ x 19 מ&quot;מ) בדקירת PDMS עבה וחתך מלבן אחר בתוך כדי שתהיה בריכה (או מסגרת) שיישמר על התאים ותקשורת (ראה איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף גריז סיליקון תחת זה PDMS בריכה ולמקם אותו על גבי גיליון PDMS ליצור medium שמירה על בריכה. הגריז יאפשר הגלישה של הבריכה מעל גיליון PDMS במהלך מתיחה. </li></ol> 4. דפוסי התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את התאים מ50% בקבוק תרבות confluency עם Versene. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאי resuspend אותם בריכוז של 200,000 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של השעיה תא בבריכה (ראה דיון לפרטים נוספים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התאים להיקשר לדפוסים ל10-30 דקות (תלוי בסוג התא, הרשתית-1 תאים ייקחו 10 דקות ותאי הלה 20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשטוף את התאים הצפים עם מדיום equilibrated (לאזן בינוני בחממה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התאים התפשטו לכמה שעות על הדפוסים (RPE-1 יצטרך לפחות 2 שעות; תאי הלה יצטרכו 3 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת coverslip על גבי הבריכה כדי למנוע דליפת אידוי ובינוני במקרה הפסקות PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את המכשיר על מיקרוסקופ הפוכה ולהתחיל הדמיה. הימנע משימוש באוב טבילת שמןjectives כפי שהוא לא יעבוד בשל בעיות מיקוד. </li></ol> 5. מתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את בורג micrometric תוך תיקון מיקום הבמה בx-, (בעיקר x) y-, וציר ה-z. מיקום הבמה צריך להיות מתוקן כדי לנטרל את הרחבת PDMS ואובדן המיקוד. (ראה &quot;במתיחה&quot; הפסק בדיון). </li></ol>

<ol>
	<li>Vogel, V., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+force+and+geometry+sensing+regulate+cell+functions.">Local force and geometry sensing regulate cell functions.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).</li><li>Terenna, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+mechanisms+redirecting+cell+polarity+and+cell+shape+in+fission+yeast.">Physical mechanisms redirecting cell polarity and cell shape in fission yeast.</a> Curr. Biol. 18 (22), 1748-1753 (2008).</li><li>Guillot, C., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+epithelial+tissue+homeostasis+and+morphogenesis.">Mechanics of epithelial tissue homeostasis and morphogenesis.</a> Science. 340 (6137), 1185-1189 (2013).</li><li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+control+of+morphogenesis+by+Fat/Dachsous/Four-jointed+planar+cell+polarity+pathway.">Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway.</a> Science. 336 (6082), 724-727 (2012).</li><li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+cell+mechanics,+cell-cell+interactions,+and+proliferation+on+epithelial+packing.">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Curr. Biol. 17, 2095-2104 (2007).</li><li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+and+anisotropy+of+cortical+forces+orienting+Drosophila+tissue+morphogenesis.">Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.</a> Nat. Cell Biol. 10, 1401-1410 (2008).</li><li>Mitrossilis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+single-cell+response+to+stiffness.">Real-time single-cell response to stiffness.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (38), 16518-16523 (2010).</li><li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchison, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels.">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 12, 1783-1790 (2007).</li><li>Fink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=External+forces+control+mitotic+spindle+positioning.">External forces control mitotic spindle positioning.</a> Nat. Cell. Biol. 13 (7), 771-778 (2011).</li><li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning.">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).</li><li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Th&#233;ry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+micropatterns:+A+direct+printing+protocol+using+deep+Uvs.">Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep Uvs.</a> Methods Cell Biol. 97, 133-146 (2010).</li><li>Azioune, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+method+for+high-throughput+surface+patterning+of+deformable+substrates.">Robust method for high-throughput surface patterning of deformable substrates.</a> Langmuir. 27 (12), 7349-7352 (2011).</li><li>Carpi, N., Piel, M., Azioun, A., Cuvelier, D., Fink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+on+silicon+elastomer+(PDMS)+with+deep+UVs.">Micropatterning on silicon elastomer (PDMS) with deep UVs.</a> Protoc. Exch. , (2011).</li><li>Sinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+respond+to+mechanical+stress+by+rapid+disassembly+of+caveolae.">Cells respond to mechanical stress by rapid disassembly of caveolae.</a> Cell. 144 (3), 402-413 (2011).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

למרות שטכניקה זו נעשתה שימוש פעמים רבות ונבדקה ביסודיות, ישנם מספר שלבים קריטיים שיכול להוביל לניסוי נכשל. אודות PDMS: לעבודה זו, GelPak, גיליון דק PDMS זמין מסחרי, היה בשימוש. לחלופין ניתן להטיל גיליונות PDMS ישירות מתערובת PDMS. אנו ממליצים להשתמש GelPak כי זה שחזור יותר, ופחות סביר לשבור לעומת PDMS בהתאמה אישית. אודות המכשיר: מכשיר המתיחה בשימוש בפרוטוקול זה תוכנן &quot;בבית&quot;, אבל אפשר גם ליישם את טכניקת micropatterning על אלונקות זמינות מסחרי כמו FlexCell. אפשרויות מותאמות אישית שנעשו הן מגוונות יותר והרבה יותר זולות. הרכבה המכשיר: ההרכבה של PDMS יכולה להוביל לשבירה. זה גם קל כדי להפוך אותו ואין שום דרך לדעת באיזה צד הואאשר. אם PDMS הוא הידק יותר מדי, הוא הופך להיות קצר יותר וזה יכול להוביל לשבירה (כמו המתח יהיה גדול יותר עבור אותו המרחק של מתיחה). ודא שהברגים הם הידקו או גיליון PDMS יגלוש בהקדם המתיחה מתחילה או בשלב מאוחר יותר במהלך הניסוי היטב. הוספת התאים: לניתוק התאים ממצע התרבות, עדיף להשתמש EDTA 0.02% ב-PBS ולא טריפסין. באמצעות EDTA יאפשר rebinding מהיר יותר של התאים בדפוסים. כאשר תאים מתווספים PDMS, הם חייבים להיות מופרדים היטב אחד מהשני על מנת להשיג תאים בודדים מחייבים לדפוס. ברגע שהם נמצאים בהשעיה, פיפטה כמה פעמים עם טיפ μl 200, זה ישבור את אגרגטים. כ -200,000 תאים יש להוסיף על גבי משטח 4 סנטימטר 2 על מנת שיהיה מחייב לכל תבנית. השתמש בנפח קטן כל כך התאים ליפול במהירות על גבי המשטח. אם אין מספיק תאים, מ &#39;כל דפוסים יישארו ריקים. התאים המצורפים שאינם חייבים להיות סמוקים החוצה על ידי הסרת תקשורת ברגע שמספיק תאים מחויבים לדפוסים. הזמן עד שהסומק יכול להשתנות בין סוגי תאים אך 15 דקות היא בדרך כלל מספיק לתאים להתחיל מצרפים לדפוסים. אם התאים נשארים לצרף ליותר מדי זמן, דפוסים יהיו תפוסים על ידי 2 או יותר תאים. צעד זה מתואר ב13. במהלך הקטע: להיות זהיר במיוחד, תוך מתיחה, כדי להימנע מאיבוד מעמדו של האזור של עניין. ואכן, במתיחה, PDMS יהפוך רחב יותר, ואת מיקום הבמה צריך להיות וסידרה כדי לפצות. שילוב של ממונע בקרת התקנים ותוכנות מתיחה של השלב ניתן לפתח כדי לפצות באופן אוטומטי לאפקט הזה 14. האלונקה הידנית הפשוטה ותכליתית שהוצגה כאן ניתן לשדרג על מנת להשיג פיצוי אוטומטי מסוג זה. פו PDMSol יכול לדלוף אם גריז סיליקון לא הונח כראוי סביב פני השטח. ודא שההגדרה היא חתומה כראוי על ידי לשים את PBS בפנים וצופה לכל דליפה לפני תאי ציפוי על זה. האלונקה שלנו מאפשרת מתיחה של כ -30%, אבל אלונקות מעוצבות אישית עלולות לאפשר לדרגה גבוהה יותר של מתיחה. היזהר כגבוה יותר המתח, גבוה יותר הוא הסיכון לשבירת שכבת PDMS. מגבלות: אחת המגבלות העיקריות בטכניקה המוצגת כאן הוא חוסר מתיחה / destretching האוטומטי קל באמצעות מנוע. אף על פי כן, זה אפשרי להתאים את מפעיל במקום בורג micrometric ידני. יישום זה, יחד עם תיכנות מסוימות של שליטת מיקרוסקופ יכול להרשות לפיצוי בגין עקירת מדגם במהלך מתיחה. חסרון נוסף הוא הקושי שיש הדמיה ברזולוציה גבוהה, משום שבאמצעות טבילת מטרות נפט בתנועות duces של המצע הרך כאשר המטרה נעה מהר מדי. זה ניתן לפתור באמצעות מים (אבל אז אידוי הוא בעיה עבור ניסויים לטווח ארוך) או שמן מאוד נזיל. שינויים ויישומים עתידיים: בשיתוף פעולה עם Yanlan מאו וניק Tapon מסרטן מכון המחקר (לונדון, אנגליה), שפיתחנו גרסה אחרת של את האלונקה שמאפשרת לשתי שכבות של PDMS על גב אחד את השני, עם המדגם להיות באמצע, כדי לצבוט ולמתוח את כל הרקמות.

התאים המרכיבים את רקמות באורגניזמים גבוהים יותר כפופים למתחים מכאניים וכוחות המתיחה מגיעים גם מהסביבה החיצונית או מהתאים המקיפים את 1,2. תאים חייבים להסתגל ולהתנגד לכוחות הללו על מנת לשמור על שלמות רקמה. כוחות כאלה הם גם חשובים עבור המורפוגנזה רקמות במהלך 3,4 פיתוח. החלת כוחות מכאניים על תאים בתרבית היא דרך לחקות את מה שעלול לקרות ברקמה, אבל עם שליטה כמותיים ועצמאית של צורת התא ו5,6 עיוות תא. לשם כך, עשויות לשמש במספר טכניקות. אפשר ללחוץ על התאים (התא כולו או חלק ממנו), למשל באמצעות AFM או נגזרי 7,8 או למתוח את מצע התאים גדלים על. השיטה המתוארת במאמר זה מדגימה כיצד למתוח מצע מטוס מצופה בתאים. טכניקה זו פותחה במקור כדי להעריך את התפקיד של כוחות המופעלים על מ &#39;תאי יונקים itotic 9. תאי mitotic להישאר מחוברים למצע דרך סיבי הכחשה ומותחים את הקרום שהפעילו כוח על אלה סיבים, אשר בתורו עורר את הסיבוב של ציר mitotic. העניין של שילוב micropatterns דבק ומתיחה הוא להשיג שליטה עצמאית של כוחות וצורה של תאים בודדים. זה למשל אפשר למתוח תא ביצה לצורה עגולה איזוטרופיים בצורה מושלמת, תוך מתיחת uniaxial מוחלת. אם התאים אינם קלועים בmicropatterns, uniaxial מתיחת תוצאות בהתארכות תא, עם רוב התאים שיש ציר ארוך מיושר עם ציר המתיחה. קשה לאחר מכן להפריד את ההשפעה של יישור ציר זמן ואת ההשפעה של המתיחה מוחלת על התאים. המכשיר מתאים לכל הדמיה תא חי, הכולל מיקרוסקופ פלואורסצנטי לשגות זמן רב, וניתן להוסיף תרופות במהלך הניסוי. שיטת micropatterning יובס העמוקה 10תואר בפירוט בAzioune et al. 11 דפוסים על PDMS תוארו בAzioune et al. 12 הווה מתיחת פרוטוקול הוא גרסת וידאו של קארפי et al. 13

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GelPak</td>
			<td style="width:71px;">GelPak</td>
			<td style="width:119px;">PF-60-X4</td>
			<td style="width:167px;">Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Silicon grease</td>
			<td style="width:71px;">GE Bayer Silicones</td>
			<td style="width:119px;">Baysilone-Paste</td>
			<td>This one is biocompatible</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Stretching device</td>
			<td style="width:71px;">GREM m&#233;canique</td>
			<td style="width:119px;">Stretcher 2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3450</td>
			<td>Stable 6 months at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">56485</td>
			<td>Protect from humidity</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)</td>
			<td style="width:71px;">SurfaceSolutions (Zurich)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Synthetic Quartz photomask</td>
			<td style="width:71px;">Toppan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Take standard binary photomask in Quartz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stretching micropatterned cells on a pdms membrane

כוחות מכאניים המופעלים על תאים ו / או רקמות לשחק תפקיד מרכזי בתהליכים רבים. פיתחנו מכשיר למתוח תאים מצופים בpolydimethylsiloxane קרום (PDMS), תואם עם הדמיה. טכניקה זו ניתנת לשחזור ותכליתי. קרום PDMS ניתן micropatterned כדי להגביל את התאים או רקמות לגיאומטריה ספציפית. הצעד הראשון הוא להדפיס micropatterns על הממברנה PDMS עם טכניקת UV עמוקה. קרום PDMS מותקן אז על אלונקה מכאנית. תא חייב על גבי הקרום עם גריז ביולוגית כדי לאפשר גלישה במתיחה. התאים הם זורעים ואפשרו להפיץ לכמה שעות על micropatterns. המדגם יכול להיות מתוח וunstretched מספר פעמים עם השימוש בבורג micrometric. זה לוקח פחות מדקה כדי להחיל את המתיחה לכל אורכו (בסביבות 30%). הטכניקה המוצגת כאן אינה כוללת מכשיר ממונע, אשר הוא הכרחי עבורpplying מחזורי מתיחה חוזרים ונשנים במהירות ו / או בשליטת מחשב מתיחה, אבל יכול להיות מיושם זה. מתיחה של תאים או רקמות יכולות להיות עניין לשאלות הקשורות לכוחות תא, בתגובת תא ללחץ מכאני או המורפוגנזה רקמות. מצגת וידאו זה יראה איך להימנע מבעיות אופייניות שעלולות להתעורר כאשר אתה עושה את זה סוג של ניסוי פשוט לכאורה.

<html> הטכניקה שהוצגה בפרוטוקול וידאו זה אפשר את היישום של כוחות על סיבי ההכחשה של תאי יונקים mitotic. ואכן, במהלך חלוקת תא, בשלב mitotic, תאי יונקים לחזור לקחת את הצורה של כדור ולהשאיר מאחור כבלים אקטין דקים מוקפים בקרום אשר מחוברים למצע. כבלים אלו (סיבי הכחשה), הם הזיכרון של הגיאומטריה התא לפני שהוא הולך לחטיבה. ביצוע micropatterns עם UV העמוק דרך photomask על סרט דק PDMS (איור 1) אפשר שליטה הגיאומטרית של הידבקות תא. על ידי מתיחת המצע בתחילת metaphase, חלק מסיבי הכחשה אלה התרחקו מהגוף התא, וכתוצאה מכך כוחות מכאניים מוחלים על הקורטקס של התא mitotic (איור 3). כוחות אלה הוצגו למשול את הכיוון של ציר הציר 9. <html> gure 1 &quot;עבור: תוכן width =&quot; 6in &quot;עבור: src =&quot; / files/ftp_upload/51193/51193fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51193/51193fig1.jpg &quot;width =&quot; &quot;/&gt; 600px איור 1. סינתטית קוורץ Photomask נושאת תכונות micropatterns. &#160; א) photomask אופייני המשמש לדפוסי UV עמוקים. זוהי מסכת ינארי סנטימטר 10 10 ס&quot;מ X והתכונות הן בדרך כלל של כ -20 מיקרומטר רחב לדפוסי תא בודדים, עם רזולוציה submicron. ריבועים גלויים על ידי עין בלתי מזוינת הם בגודל של שדה המיקרוסקופ אובייקטיבי 10X מבט. הפיצוץ מראה את התכונות המתאימות לדפוסי תא בודדים (כאן דיסקים). תכונות הן שקופות כדי לאפשר יובס עמוק לעבור. B) PDMS מוחל על photomask תוך הימנעות היווצרותן של בועות בזהירות. צד PDMS פסיבציה הוא במגע עם הצד המתכתי של photomask. Micropatterns יודפס בכל רחבי PDMS.g1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51193/51193fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51193/51193fig2.jpg" width="600px" /> איור 2. הבריכה. &#160; בריכת PDMS מוחלת על גיליון PDMS. גריז מכסה היקפי קרקעית הברכה. הקיבולת של הבריכה היא כ 2 מיליליטר של תקשורת. הבריכה מלאה במדיום התרבות (כאן מים עם העמסה מופיעים בצהוב). כדי למנוע אידוי, coverslip ניתן להוסיף על גבי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51193/51193fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51193/51193fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51193/51193fig3.jpg" width="600px" /> <strong&gt; איור 3. עיוות של תא מתוח. ניגוד שלב תמונות של תא הרשתית-1 micropatterned על משטח PDMS) לפני המתיחה. התא מצופה על תבנית סגלגלה. כדי להשיג זאת, הדפוסים נעשה עם PDMS להיות מתוח במהלך הרושם של דפוסי סיבוב דרך photomask. משמש photomask מתפרק (חתיכת המסכה היא כ -1.5 סנטימטר קוטר). כדי להימנע מפירוק מסיכה, השתמש דפוס סגלגל על photomask ולהדפיס אותו על גיליון PDMS unstretched. ב) לאחר המתיחה. המצע נמתח כגון הדפוס הופך למעגל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51193/51193fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane at JoVE.com

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

כתב יד זה מציג טכניקה כדי להחיל או לשחרר כוחות על תאים או רקמות חסיד באמצעות מתיחה חד כיווני.

מתיחת תאי micropatterned בממברנה PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

stretching-micropatterned-cells-on-a-pdms-membrane

Google

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.2K Views.  Institut Curie.  כתב יד זה מציג טכניקה כדי להחיל או לשחרר כוחות על תאים או רקמות חסיד באמצעות מתיחה חד כיווני. 

Video: Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

משטחים micropatterned לחקר אינטראקציות חומצה היאלורונית עם תאים סרטניים

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

ויזואליזציה שיפור ניתוח כמותי של השפעות התרופה באמצעות תאים micropatterned

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

פלטפורמה חדשני מתיחה עבור יישומים בתאים והרקמות mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

הארה תהודת אנרגיה העבר לחקר שינויי קונפורמציה בחלבונים בממברנה שבאו לידי ביטוי בתאי יונקים

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell number. While researchers commonly reference their seeding density this does not necessarily indicate the actual number of cells that have adhered to the material in question. This is particularly the case for materials, or scaffolds, that do not cover the base of standard cell culture well plates. This study investigates the initial attachment of human mesenchymal stem cells seeded at a known number onto electrospun poly(&#949;-caprolactone) yarn after 4 hr in culture. Electrospun yarns were held within several different set-ups, including bioreactor vessels rotating at 9 rpm, cell culture inserts positioned in low binding well plates and polytetrafluoroethylene (PTFE) troughs placed within petri dishes. The latter two were subjected to either static conditions or positioned on a shaker plate (30 rpm). After 4 hr incubation at 37&#160;oC, 5% CO2, the location of seeded cells was determined by cell DNA assay. Scaffolds were removed from their containers and placed in lysis buffer. The media fraction was similarly removed and centrifuged &#8211; the supernatant discarded and pellet broken up with lysis buffer. Lysis buffer was added to each receptacle, or well, and scraped to free any cells that may be present. The cell DNA assay determined the percentage of cells present within the scaffold, media and well fractions. Cell attachment was low for all experimental set-ups, with greatest attachment (30%) for yarns held within cell culture inserts and subjected to shaking motion. This study raises awareness to the actual number of cells attaching to scaffolds irrespective of the stated cell seeding density.

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&amp;#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

אופטימיזציה של קובץ מצורף של תאי גזע mesenchymal האדם על פולי (ε-caprolactone) חוטים electrospun

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Transfection גן לתאי ספרואיד על צלחות micropatterned תרבות להשתלת תאים גנטיות-שונה

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

טכניקת microfluidic Genipin הפקדת לתרבות מורחבת של כלי דם micropatterned השרירים Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

בנייה של גיליונות מודולרי Hydrogel לאדריכלות סלולרית 3D המוקטן מאקרו micropatterned

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper presents a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device capable of generating water/oil/water double emulsions using a coaxial flow focusing geometry that can be fabricated entirely using soft lithography. Similar to emulsion devices using glass capillaries, double emulsions can be formed in channels with uniform wettability and with dimensions much smaller than the channel sizes. Three dimensional flow focusing geometry is achieved by casting a pair of PDMS slabs using two layer soft lithography, then mating the slabs together in a clamshell configuration. Complementary locking features molded into the PDMS slabs enable the accurate registration of features on each of the slab surfaces. Device testing demonstrates formation of double emulsions from 14 &#181;m to 50 &#181;m in diameter while using large channels that are robust against fouling and clogging.

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Microfluidic double emulsions generation typically involves devices with patterned wettability or custom-fabricated glass components. Here we describe the fabrication and testing of an all polydimethylsiloxane (PDMS) double emulsion generator that does not require surface treatment or complicated fabrication processes, and is capable of producing double emulsions down to 14 &#181;m.

זוגי אמולסיה דור שימוש בהתקן זרימת פוקוס Co-הצירית polydimethylsiloxane (PDMS)

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, and translation of findings is often poor. Thus, there is ample opportunity for alternative experimental approaches. Here we present an approach in which human cells are isolated from human anterior cruciate ligament tissue remnants, expanded in culture, and used to form engineered ligaments. Exercise alters the biochemical milieu in the blood such that the function of many tissues, organs and bodily processes are improved. In this experiment, ligament construct culture media was supplemented with experimental human serum that has been &#39;conditioned&#39; by exercise. Thus the intervention is more biologically relevant since an experimental tissue is exposed to the full endogenous biochemical milieu, including binding proteins and adjunct compounds that may be altered in tandem with the activity of an unknown agent of interest. After treatment, engineered ligaments can be analyzed for mechanical function, collagen content, morphology, and cellular biochemistry. Overall, there are four major advantages versus traditional monolayer culture and animal models, of the physiological model of ligament tissue that is presented here. First, ligament constructs are three-dimensional, allowing for mechanical properties (i.e., function) such as ultimate tensile stress, maximal tensile load, and modulus, to be quantified. Second, the enthesis, the interface between boney and sinew elements, can be examined in detail and within functional context. Third, preparing media with post-exercise serum allows for the effects of the exercise-induced biochemical milieu, which is responsible for the wide range of health benefits of exercise, to be investigated in an unbiased manner. Finally, this experimental model advances scientific research in a humane and ethical manner by replacing the use of animals, a core mandate of the National Institutes of Health, the Center for Disease Control, and the Food and Drug Administration.

We present a model of ligament tissue in which three-dimensional constructs are treated with the human exercise-conditioned serum and analyzed for collagen content, function, and cellular biochemistry.

טיפול של רצועות ליגמנט עם תרגיל ממוזג בסרום: רקמות תרגום הנדסה דגם

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...