המחברים מבקשים להודות ליוני מידלטון לאספקת ה זני faecalis והדרכה עם תרבות חיידקים. ג elegans סופקו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי NIH משרד תוכניות תשתית מחקרית (P40 OD010440).

1) הכנה של צמיחת מדיה נמטודות (NGM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את 50 צלחות, להוסיף 1.5 גרם NaCl, 8.5 אגר ultrapure גרם, וpeptone 1.25 גרם לLflask 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 487.5 מ&quot;ל של DH 2 O לבקבוק. מערבולת בעדינות לתערובת, ולכסות את הפתח של בקבוק עם פיסת נייר אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הפתרון על ידי מעוקר ב תנאים סטנדרטיים (121 psi, 120 מעלות צלזיוס, 20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הפתרון לקירור ל -45 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתרון, להוסיף את הדברים הבאים לפי סדר: כולסטרול μl 500 ממיליליטר פתרון מניות (מומס באתנול) 5 מ&quot;ג / 1, 500 מ &#39;μl CaCl 2, 500 1 ז μl MgSO 4, וחיץ 4 12.5 מיליליטר KPO (54.15 גרם KH PO 4 ו17.8 גרם K 2 HPO 2 4 ב 500 מ&quot;ל של DH 2 O) כפי שמתואר ב18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בטפטפות סטריליים, להוסיף 10 מ&quot;ל של תמיסה אגר לכל צלחת פטרי קלקר 60 מ&quot;מ. לאפשר לתקשורת כדי לחזק בovern טמפרטורת החדרight. </li></ol> 2) הכנת מרק א &#39;ב&#39; coli מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעשות חמש 100 מ&quot;ל תרבויות, להוסיף 5.0 גרם של Bacto tryptone, 2.5 תמצית שמרים גרם, 5.0 גרם NaCl לכוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף סטרילי מים, מזוקקים לנפח סופי של 500 מ&quot;ל. מחממים את הפתרון על צלחת חמה, תוך כדי ערבוב, עד שהמומסים שנמסו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 100 מ&quot;ל של מרק B לחמישה בקבוקי זכוכית (לפחות 200 מ&quot;ל נפח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את פתרונות על ידי מעוקר ב תנאים סטנדרטיים (121 psi, 120 ° C, 20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרשה B מרק להתקרר לטמפרטורת חדר לפני השימוש. </li></ol> 3) מתזמן ג צלחות תחזוקת elegans <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שנתן לייבוש צלחות NGM בטמפרטורת חדר למשך שבוע אחד לפחות, לחסן תרבות מרק 100 מ&quot;ל ב &#39;אחד עם כמה מושבות של א&#39; coli (OP50). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול E. תרבות coli על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחד או שתיים טיפות פיפטה (כ 10081; L) של OP50 תרבות על מרכז כל צלחת NGM. צלחות נערמים מכסה בצד בדרך כלל למעלה. כאשר pipetting (זריעה), להתחיל על ידי pipetting התרבות לצלחת בתחתית הערימה. דרך עבודה שלך כל ערימה. נסה לא לעבור את הצלחות לאחר זריעה, כי זה חשוב שהתרבות לא להתקרב מדי לשולי הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר צלחות זרע לייבוש בטמפרטורת חדר במשך שבוע אחד לפחות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות זורעים מאוחסנות (הפוך) בכלי פלסטיק אטומים בטמפרטורת חדר. </li></ol> 4) שמירה על ג elegans זנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על מדושן ג מניות elegans, השתמשו תולעת לבחור לעבור שלוש L4s או מבוגרים הרה להולדת לחדשה, זורעי NGM צלחת כל 3-4 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות חנות (הפוך) רצוי בתוך חממה ב 15-22 ° C. תרבויות במבחנים שתוארו היו מאוחסנות בטמפרטורה של 20 ° C. ג elegans פיתוח הוא טמפרטורה תלויה. כmaintenaNCE עולה טמפרטורה, זמן בין שלבי התפתחות יורד. </li></ol> 5) הכנת הסויה אגר (TSA) א &#39;tryptic faecalis תרבות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את 50 צלחות, למדוד 500 מ&quot;ל של מים סטריליים, מזוקקים לתוך בקבוק ומביא לרתיחה, תוך בחישה, על פלטה חמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 גרם של האבקה אגר TSA לבקבוק ולאפשר פתרון לפזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את פתרונות על ידי מעוקר ב תנאים סטנדרטיים (121 psi, 120 ° C, 20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הפתרון לקירור ל -45 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בטפטפות סטריליים, להוסיף 10 מ&quot;ל של תמיסה אגר לכל צלחת פטרי קלקר 60 מ&quot;מ. לאפשר לתקשורת כדי לחזק בטמפרטורת חדר למשך לילה. </li></ol> 6) הכנת מרק סויה א tryptic (TSB) faecalis תרבות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך 250 צינורות תרבות, למדוד 500 מ&quot;ל של מים סטריליים, מזוקקים לתוך בקבוק וחם על פלטה חמה תוך כדי ערבוב. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 גרם של אבקה אגר TSB לבקבוק ולאפשר את האבקה להמסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את פתרונות על ידי מעוקר ב תנאים סטנדרטיים (121 psi, 120 ° C, 20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר פתרון ללהתקרר לטמפרטורת חדר, ולאחר מכן טפטפת לתוך 2 מ&quot;ל, 5 מבחנות מ&quot;ל סטרילי. </li></ol> 7) הכנה של מוח לב עירוי (BHI) מדיה, עם סטרפטומיצין, לE. תרבות faecalis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד 500 מ&quot;ל של מים סטריליים, מזוקקים לתוך בקבוק ומביא לרתיחה, תוך בחישה, על פלטה חמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 26 גרם של מדיום BHI לבקבוק ולאפשר הפתרון להמסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את פתרונות על ידי מעוקר ב תנאים סטנדרטיים (121 psi, 120 ° C, 20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון יאפשר לקירור ל -45 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות טכניקה סטרילית, להוסיף 0.5 מ&quot;ל של פתרון מניות סטרפטומיצין 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ומערבולת לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של הפתרון לכל צלחת פטרי קלקר 60 מ&quot;מ. </li><li&gt; תקשורת לביסוס בטמפרטורת חדר למשך לילה אפשר. צלחות חנות (הפוך) בשעת 4 ° C ועד כמה שעות לפני השימוש. </li></ol> 8) שמירה על E. זני faecalis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על א מניות faecalis, השתמשו בלולאת סטרילי לפס בודדות על מושבות (TSA) אגר סויה נפרדת צלחות tryptic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבויות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. צלחות חנות (הפוך) בתיק או בקופסה אטום בטמפרטורת חדר במשך כמה שבועות. </li></ol> 9) הכנת א &#39; צלחות faecalis עבור assay EIW <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן תרבות 2 מיליליטר TSB עם מושבה של א &#39; faecalis ודגירת הלילה בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה μl 20 של א &#39; תרבות faecalis אל מרכז צלחת BHI, סטרפטומיצין מוכן, ודגירת הלילה בשעה 37 ° C. </li></ol> 10) הכנת א &#39; צלחות coli עבור assay EIW (לוחות בקרה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן B-100 מיליליטר אחתרבות ה עם מושבה של א &#39; coli OP50 ו דגירה הלילה על 37 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה μl 20 של תרבות OP50 אל מרכז צלחת NGM unseeded ולאפשר את צלחות זרע לייבוש בטמפרטורת חדר למשך לילה. </li></ol> 11) ביצה ב assay תולעת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק 15 - 20 מבוים-L4 ג elegans (איור 1) על גבי מרכז מדשאה של חיידקים על BHI סטרפטוקוקוס-E. מוכן faecalis צלחת. היזהר שלא להעביר הרבה OP50 לצלחת BHI. בחר את אותו המספר של L4s לשליטת NGM-OP50 צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות עבור 40 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון אקונומיקה 20%. מערבבים אקונומיקה מסחרית (6.0% נתרן היפוכלוריט) עם הנפח המתאים של מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 טיפות של μl פתרון אקונומיקה לעשרה מקומות שונים על מכסה פלסטיק (של תולעת או צלחת חיידקים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות איסוף תולעת, תולעת להעביר אחד לכל טיפת אקונומיקה. מערבולת בעדינות את קצהלבחור בטיפת אקונומיקה כדי לוודא את התולעת יש לשטוף בסוף בחרו (לאשר על ידי הצגת אגל תחת מיקרוסקופ לנתח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לציפורן לפזר לכ -10 דקות או עד התולעים נפתחו בסערה, לגרש את הביצים (איור 2). היזהר שלא להעביר את הביצים מהצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח, לספור את הביצים בכל טיפה של אקונומיקה. </li></ol>

<ol>
	<li>Horvitz, H. R., Chalfie, M., Trent, C., Sulston, J. E., Evans, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+and+octopamine+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Serotonin and octopamine in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 216, 1012-1014 (1982).</li><li>Sawin, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans [dissertation]. , (1996).</li><li>Trent, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetic and behavioral studies of the egg-laying system of Caenorhabditis elegans [dissertation]. , (1982).</li><li>Chase, D. L., Koelle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+RGS+protein+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic analysis of RGS protein function in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Enzymol. 389, 305-320 (2004).</li><li>Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg-laying+defective+mutants+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 104, 619-647 (1983).</li><li>Weinshenker, D., Garriga, G., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+pharmacological+analysis+of+neurotransmitters+controlling+egg+laying+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic and pharmacological analysis of neurotransmitters controlling egg laying in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 15, 6975-6985 (1995).</li><li>Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+alternative+behavioral+states+by+serotonin+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans.</a> Neuron. 21, 203-214 (1998).</li><li>Bany, A., Dong, M., Koelle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+cellular+basis+for+acetylcholine+inhibition+of+Caenorhabditis+elegans+egg-laying+behavior.">Genetic and cellular basis for acetylcholine inhibition of Caenorhabditis elegans egg-laying behavior.</a> J. Neurosci. 23, 8060-8069 (2003).</li><li>Dempsey, C. M., Mackenzie, S. M., Gargus, A., Blanco, G., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+(5HT),+fluoxetine,+imipramine+and+dopamine+target+distinct+5HT+receptor+signaling+to+modulate+Caenorhabditis+elegans+egg-laying+behavior.">Serotonin (5HT), fluoxetine, imipramine and dopamine target distinct 5HT receptor signaling to modulate Caenorhabditis elegans egg-laying behavior.</a> Genetics. 169, 1425-1436 (2005).</li><li>Leung, M. C., Williams, P. L., Bennedetto, A., Au, C., Helmcke, K. J., Aschner, M., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology.">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology.</a> Toxicol. Sci. 106, 5-28 (2008).</li><li>Mylonakis, E., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+and+flies+as+genetically+tractable+animal+models+to+study+host-pathogen+interactions.">Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions.</a> Infect. Immun. 73, 3833-3841 (2005).</li><li>Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , (2005).</li><li>White, J., Southgate, E., Thomson, N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system.">The structure of the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314, 1-340 (1986).</li><li>Desai, C., Garriga, G., McIntire, S. L., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+pathway+for+the+development+of+the+Caenorhabditis+elegans+HSN+motor+neurons.">A genetic pathway for the development of the Caenorhabditis elegans HSN motor neurons.</a> Nature. 336, 638-646 (1988).</li><li>Garsin, D. A., Sifri, C. D., Mylonakis, E., Qin, X., Singh, K. V., Murray, B. E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+model+host+for+identifying+Gram-positive+virulence+factors.">A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10892-10897 (2001).</li><li>Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhmurium+proliferates+and+establishes+a+persistent+infection+in+the+intestine+of+Caenorhabditis+elegans.">Salmonella typhmurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans.</a> Curr. Biol. 10, 1539-1542 (2000).</li><li>O'Quinn, A. L., Wiegand, E. M., Jeddeloh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+pseudomallei+kills+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+using+an+endotoxin-mediated+paralysis.">Burkholderia pseudomallei kills the nematode Caenorhabditis elegans using an endotoxin-mediated paralysis.</a> Cell. Microbiol. 3, 381-393 (2001).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">Genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Harvey, S. C., Shorto, A., Orbidans, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+genetic+analysis+of+life-+history+traits+of+Caenorhabditis+elegans+in+stressful+environments.">Quantitative genetic analysis of life- history traits of Caenorhabditis elegans in stressful environments.</a> BMC Evol. Biol. 8, 15 (2008).</li><li>Harvey, S. C., Orbidans, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+eggs+are+not+equal:+the+maternal+environment+affects+progeny+reproduction+and+developmental+fate+in+Caenorhabditis+elegans.">All eggs are not equal: the maternal environment affects progeny reproduction and developmental fate in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 6, e25840 (2011).</li><li>Klass MR, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span.">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing. Dev. 6, 413-429 (1977).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

השלבים הקריטיים ביותר בביצוע assay זה בהצלחה הם: 1) באמצעות מניות מדושנות של ג elegans, 2) culturing סוגים בודדים של חיידקים בצלחת assay, 3) זיהוי מדויק מבוים L4 תולעים לחשיפה לE. faecalis, 4) שמירה על זמן החשיפה לE. faecalis עקבי בכל הניסויים ו 5) הלבנת זמן שלא יעלה על עשר דקות כדי למ...

Caenorhabditis elegans, תולעת עגולה מיקרוסקופית, נטול חיים, היא אורגניזם מודל משמש באופן מסורתי כדי ללמוד תהליכים התפתחותיים ואיתות תא בגלל האנטומיה שלו שקופה, הפיתוח מאופיין היטב, מלא ברצף הגנום, דור בזמן הקצר, וההומולוגיה גנטית לבני אדם . לאחרונה, ג elegans הפך אורגניזם מודל בתחום הרעלים סביבתיים ומולדת חסינות 10, 11. תולעי hermaphroditic דישון עצמי האלה הפכו לבגרות מינית בתוך שנים עד שלושה ימים מיום הבקיעה מן הביצה. במהלך מחזור החיים שלו, ג elegans עובר דרך ארבעה שלבי זחל (L1-L4), לפני שהגיע לבגרות. אחד המבודד אנדרוגינוס יכול לייצר, בממוצע, 300 צאצאים בתוך שלושה ימים של פוריות שיא. בreproductively הבוגר ג elegans הרמפרודיטים, ביצים מופרות נשמרות בתוך הרחם במשך כמה שעות לפני שהניחו.מספר הרגיל של ביצים מאוחסנות ברחם בכל זמן נתון (בשיא פוריות) הוא 12 בין עשרה לחמש עשר. מספר הביצים ברחם הוא פונקציה של שניהם בקצב ייצור של ביצה והשיעור של הנחת ביצה. ביצים מופרות הם גורשו מן הרחם על ידי התכווצות שרירי פות של שישה עשר מסודרים סביב הפתיחה של הפות 13. motorneurons הרמפרודיט הספציפי (HSN של) וסינפסה VC motorneurons על שרירי פות המשפיעים התכווצות שרירים ובכך הטלה התנהגות 5,7,13,14. גירוש של ביצים מהרחם מתרחש עקב פעילות מתואמת של נוירונים ושרירים. תרבויות מעבדה של ג elegans גדלים בדרך כלל בדיאטה של nonpathogenic חיידקי Escherichia OP50. בסביבה הטבעית, ג elegans בא במגע עם מגוון רחב של מקורות מזון, כגון חיידקים פתוגניים, שיכול להיות מזיק. בעת חשיפה לחומרים מזיקים בהסביבה, ג elegans לשמור על ביצים עד שהסביבה הופכת להיות חיובית יותר. יש להניח שימור ביצה זו הוא מאמץ כדי להגן על הצאצאים שלהם. בביצה זה בתולעת (EIW) assay, ג elegans חשוף לחיידקים פתוגניים פוטנציאל, אנטרוקוקוס faecalis, שנמצא בסביבה. חשיפה לצורות פתוגניים של א &#39; faecalis יכול לגרום לדלקת מעיים מתמשכת ואף למוות בג elegans 15. חשיפה לצורות אחרות של חיידקים פתוגניים הוכח להשפיע שימור ביצת 16,17, עם זאת ההשפעה לא לכמת. בנוסף, ההשפעה של מתינות פתוגניים זנים של E. faecalis, זנים שאינם קטלניים באופן מיידי, על התנהגות הטלת ביצים לא נחקרו. מבחני EIW כרוכים לספור את מספר הביצים נשמרים ברחם של ג elegans 4. למרות שג elegansהם שקופים, ביצים מצטברות ברחם יכולות להיות קשים לכמת בבעלי חיים בשלמותה. Assay EIW כרוך הלבנת ההרה המבוגר ג elegans שנחשפו לחיידקים לתקופה קצובה של זמן. פתרון אקונומיקה ממסים את הציפורן החיצונית עוזב את הביצים מאחור. את הביצים הן שבירה להשפעות של אקונומיקה בשל הנוכחות של קליפת ביצה מגן. אחרי הלבנה, אחד היא בקלות רבה תוכל לספור את מספר הביצים ששוחררו מהרחם של התולעים על הלבנת. Assay תאר הוא שיטה פשוטה וזולה, ומהירה לכמת את מספר הביצים ברחם בזמן אחד, ובכך לכמת את ההשפעות של א &#39; faecalis בשייר ביצה. assay זה יכול לשמש כדי לכמת את ההשפעה של סוגים אחרים של חיידקים, רעלים סביבתיים או תרופות בשייר ביצה. assay זה גם יש לו הפוטנציאל לשמש כמסך לpathogenicity חיידקים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2472">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Agar, ultrapure</td>
			<td style="width:191px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">10906</td>
			<td style="width:1791px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Bacto Peptone</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Bacto Tryptone</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Brain Heart Infusion dehydrated medium</td>
			<td style="width:191px;">Carolina Biological Supply</td>
			<td style="width:119px;">781781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:371px;">C. elegans, N2 strain</td>
			<td style="width:191px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:371px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:191px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">A11470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Culture plates for C. elegans</td>
			<td style="width:191px;">Tritech Research Inc.</td>
			<td style="width:119px;">T3308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Culture plates for E. faecalis</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific-Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">E. coli (OP50)</td>
			<td style="width:191px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">E. faecalis strains</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>
			all strains grew at 44.5 &#186;C and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified&#160;dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars&#160;(arabinose, mannitol, methyl-&#945;-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed&#160;presumptive identification of all E. faecalis strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP&#160;and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains&#160;were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Microscope</td>
			<td style="width:191px;">Motic</td>
			<td style="width:119px;">SMZ 168B</td>
			<td>any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:191px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">236950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">211768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:191px;">Acros</td>
			<td style="width:119px;">61180-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the effects of bacteria on c. elegans behavior using an egg retention assay

התנהגות הטלת ביצי סי אלגנס מושפעת רמזים סביבתיים כגון osmolarity 1 ורטט 2. בהיעדר המוחלט של מזון ג elegans גם יחדל הטלת ביצים ולשמר את ביציות מופרות ברחם 3 שלהם. עם זאת, ההשפעה של מקורות שונים של מזון, בעיקר חיידקים פתוגניים ובעיקר אנטרוקוקוס faecalis, על התנהגות הטלת ביצים לא מאופיינת היטב. ביצה בתולעת assay (EIW) הוא כלי שימושי כדי לכמת את ההשפעות של סוגים שונים של חיידקים, במקרה זה א faecalis, על התנהגות הטלת ביצים. מבחני EIW כרוכים לספור את מספר הביצים נשמרים ברחם של ג elegans 4. Assay EIW כרוך הלבנת מבוימת, הרה המבוגר ג elegans כדי להסיר את העור המת ולהפריד את ביצי עודפים מבעלי החיים. לפני הלבנת, תולעים חשופים לחיידקים (או כל סוג של אות סביבתית) לתקופה קצובה של זמן. אחרי הלבנה, אחד היא בקלות רבה תוכל לספור את מספר ביצי עודפים בתוך הרחם של התולעים. ב assay זה, גידול בשייר כימות ביצה לאחר E. ניתן למדוד את חשיפת faecalis בקלות. Assay assay EIW הוא התנהגות שעשויה לשמש מסך לפוטנציאל חיידקים פתוגניים או הנוכחות של רעלים סביבתיים. בנוסף, assay EIW עשוי להיות כלי למסך לתרופות המשפיעות על נוירוטרנסמיטר איתות מאז התנהגות הטלת ביצים היא מווסתת על ידי נוירוטרנסמיטרים כגון סרוטונין ואצטילכולין 5-9.

assay זה מאפשר לכמת את מספר הביצים נשמרות בתוך ג elegans לאחר החשיפה לE. faecalis. L4 מבוים תולעים (מאופיין בחלל פתוח שקוף מעל הפות שלהם, איור 1) נחשפו לE. faecalis דרך הבגרות. לאחר ארבעים שעות של חשיפה לE. faecalis, הלבנת בוצעה. כציפורן התפוררה בטיפת אקונומיקה, את...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay at JoVE.com

מדידת ההשפעות של חיידקים על התנהגות C. Elegans באמצעות בדיקת שימור ביציות | ביולוגיה | וִידֵאוֹ

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

ביצה בתולעת assay (EIW) הוא שיטה יעילה לכמת-הטלת התנהגות. שינויים בנחת ביצה יכולים להיות תגובה התנהגותית של האורגניזם המודל<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; לחומרים מזיקים סביבתיים כגון אלה המיוצרים על ידי חיידקים פתוגניים.

מדידת ההשפעות של חיידקים על<em&gt; ג Elegans</em&gt; התנהגות באמצעות Assay שימור ביצה

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

measuring-effects-bacteria-on-c-elegans-behavior-using-an-egg

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Ecology

Behavior

SCIENTISTS IN ACTION

17.0K Views.  Fairleigh Dickinson University. ביצה בתולעת assay (EIW) הוא שיטה יעילה לכמת-הטלת התנהגות. שינויים בנחת ביצה יכולים להיות תגובה התנהגותית של האורגניזם המודל Elegans Caenorhabditis לחומרים מזיקים סביבתיים כגון אלה המיוצרים על ידי חיידקים פתוגניים.

Video: Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

יישום של C. elegans Assay ניוון Neuron דופמין עבור אימות של מחלת פרקינסון גנים אפשריים

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח על מדיה מוצק

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of aging suggests a role for mtDNA mutations, which can alter bioenergetics homeostasis and cellular function, in the aging process 3. A wealth of evidence has been compiled in support of this theory 1,4, an example being the mtDNA mutator mouse 5; however, the precise role of mtDNA damage in aging is not entirely understood 6,7.
Observing the activity of respiratory enzymes is a straightforward approach for investigating mitochondrial dysfunction. Complex IV, or cytochrome c oxidase (COX), is essential for mitochondrial function. The catalytic subunits of COX are encoded by mtDNA and are essential for assembly of the complex (Figure 1). Thus, proper synthesis and function are largely based on mtDNA integrity 2. Although other respiratory complexes could be investigated, Complexes IV and II are the most amenable to histochemical examination 8,9. Complex II, or succinate dehydrogenase (SDH), is entirely encoded by nuclear DNA (Figure 1), and its activity is typically not affected by impaired mtDNA, although an increase might indicate mitochondrial biogenesis 10-12. The impaired mtDNA observed in mitochondrial diseases, aging, and age-related diseases often leads to the presence of cells with low or absent COX activity 2,12-14. Although COX and SDH activities can be investigated individually, the sequential double-labeling method 15,16 has proved to be advantageous in locating cells with mitochondrial dysfunction 12,17-21.
Many of the optimal constitutions of the assay have been determined, such as substrate concentration, electron acceptors/donors, intermediate electron carriers, influence of pH, and reaction time 9,22,23. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is an effective and reliable electron donor 22. In cells with functioning COX, the brown indamine polymer product will localize in mitochondrial cristae and saturate cells 22. Those cells with dysfunctional COX will therefore not be saturated by the DAB product, allowing for the visualization of SDH activity by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT), an electron acceptor, to a blue formazan end product 9,24. Cytochrome c and sodium succinate substrates are added to normalize endogenous levels between control and diseased/mutant tissues 9. Catalase is added as a precaution to avoid possible contaminating reactions from peroxidase activity 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), an intermediate electron carrier, is used in conjunction with sodium azide, a respiratory chain inhibitor, to increase the formation of the final reaction products 9,25. Despite this information, some critical details affecting the result of this seemly straightforward assay, in addition to specificity controls and advances in the technique, have not yet been presented.

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

The cytochrome c oxidase/sodium dehydrogenase (COX/SDH) double-labeling method allows for direct visualization of mitochondrial respiratory enzyme deficiencies in fresh-frozen tissue sections. This is a straightforward histochemical technique and is useful in investigating mitochondrial diseases, aging, and aging-related disorders.

ויזואליזציה של תפקודי נשימה מיטוכונדריאלי באמצעות ציטוכרום C מונואמין / succinate dehydrogenase (COX / SDH) תיוג פעמיים Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

יצירת סביבות גזיים מוגדרים כדי לחקור את ההשפעות של היפוקסיה על<em&gt; ג elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Assay Explant להערכת התנהגות ניידת של mesenchyme הגולגולת

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

נוגדן מכתים ב<em&gt; ג Elegans</em&gt; שימוש &quot;Freeze-פיצוח&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

מציאה גן בקנה מידה גדולה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; שימוש בספריות האכלת dsRNA ליצור פנוטיפים הפסד של הפונקציה חזקות

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

דגם אנוקסיה רעב לאיסכמיה / reperfusion ב<em&gt; ג elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...