מחקר זה נתמך על ידי את קוריאה במכון למדע וטכנולוגיה מחקר מגזר גרנט (2E27513), את גבוהה ערך מוסף מזון טכנולוגיה פיתוח התוכנית (IPET) ממומן על ידי משרד החקלאות, המזון לענייני כפרי (315067-03).

הערה: הניסוי כולו חייב להתבצע בתוך מעבדה מבודד נקי ומתוחזק על 20 ° C עם אבק נמוך ועם צמצום זיהום במהלך תולעת וטיפול חיידקי. למטרה זו, יש לבצע ניסויים תחת הלהבה של מנורת אלכוהול או שימוש ספסל נקי.
 1. תחזוקה של C. elegans, ביצה ההכנה לבחינה כימי <ol><li>שמור על C. elegans N2 (var. בריסטול) על צלחת אגר NGM נמאס לחיות e. coli OP50 ב- 20 ° C 12 , 13.</li>
	<li>הכן גיל-מסונכרנות ביצים באמצעות אקונומיקה פתרון טיפול 5 או הזמן ביצה הנחת בשיטה 6 , 14 , 15- 
	הערה: לפני הכנת ביצה, המעיל המכילות etoposide NGM לצלחת עם חום-לא פעיל e. coli OP50 כמפורט להלן. חום-לא פעיל E. coli OP50 משמש כדי למזער את הפעילות המטבולית של e. coli 6 , 16.</li>
</ol> 2. הכנת להשבית חום e. coli OP50 להזנה C. elegans במהלך מבחן רעילות <ol><li>להכין 500 mL שמרים זוגי טריפטון (DYT) בינוני כפי שמתואר בטבלה 1, לחסן מושבה בודדת של e. coli OP50 תרבותי אגר לוריא-Bertani (LB) צלחת 5.</li>
	<li>דגירה של e. coli OP50 ב חממה חזק עבור 14 h ב 37 ° C ו- 150 סל ד.</li>
	<li>לאחר צנטריפוגה למשך 30 דקות-3,220 x g ו- 20 ° C, הסר כל supernatant בינוני DYT ולהוסיף תערובת מראש של 25 מ ל S-buffer 250 µL של 1 מ' MgSO 4, 25 µL של כולסטרול 5 מ"ג/מ"ל (מומס באתנול). כל הפתרונות הללו בדרך סטרילית.</li>
	<li>Resuspend החיידק ומעבירים אותם אל צינור פלסטיק חד פעמיות 50-mL-</li>
	<li>עבור החום-איון, דגירה של resuspended e. coli OP50 באמבט מים למשך 30 דקות ב- 65 מעלות צלזיוס</li>
	<li>מגניב עד לטמפרטורת החדר וחנות ב 4 ° C עד השימוש. זה ניתן לאחסן עד לחודש אחד.</li>
</ol> 3. הכנת דימתיל סולפוקסיד NGM צלחות המכיל או של 1% או 750 מיקרומטר Etoposide <ol><li>הכן שני בקבוקי זכוכית נקי 200 מ ל. להוסיף 0.6 גר' NaCl, 0.5 גר' peptone, 3.4 גרם אגר, 195 מ ל מים מזוקקים, ואת של פגים בקבוק אחד. להוסיף הבקבוק הריק אחרים של פגים.</li>
	<li>בקבוקים אוטוקלב שני אלה למשך 15 דקות-121 מעלות צלזיוס, ואז ארגע הבקבוקים באמבט מים למשך 30 דקות ב- 55 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להוסיף 0.2 מ של 1 מ' CaCl 2, 0.2 מ"ל של כולסטרול 5 מ"ג/מ"ל, 0.2 מ של 1 מ' MgSO 4 ו- 5 מ של 1 מ' KPO 4 (כל הפתרונות הם סטריליים) ומערבבים אותם לאחר מכן על ידי בחישה מגנטית על פלטה בגיל 55 מעלות צלזיוס</li>
	<li>לחלק המדיום NGM מעורבים שני בקבוקים באותו אמצעי אחסון (100 מ ל כל אחד). לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד בקבוק אחד, לערבב אותו שוב באמצעות של בחישה מגנטית. לאחסן את הבקבוק השני באמבט מים בטמפרטורה 55 ° C עד השלב הבא. Aliquot 3 מ"ל של המדיום המכיל דימתיל סולפוקסיד כל 35 x 10 מ מ 2 פטרי. יכול להיות עשוי לוחיות המכילות דימתיל סולפוקסיד NGM 33 כ שלב זה.</li>
	<li>לערבב את הבקבוק השני באמצעות ערבוב מגנטי את, להוסיף 1 מ"ל של 75 מ מ etoposide (מניות מומס דימתיל סולפוקסיד), מערבבים שוב, חזור על הפעולות aliquot (שלב 3.4). כ 33 etoposide (750 מיקרומטר)-המכיל לוחות NGM יכול להיעשות מתוך שלב זה. 
	הערה: ב מתואם הקודם נייר 6, בדקנו 0, 250, 500 ו-1000 מיקרומטר של etoposide. על סמך נתונים אלה, בחרנו את מיקרומטר 750 במינון etoposide? בעיתון הזה.</li>
	<li>מגניב למטה את הצלחות NGM המכילות חומר כימי לטמפרטורת החדר על ידי השארת אותם בטמפרטורת החדר במשך כ-3 שעות, ואחסן אותם ב 4 ° C עד שימוש. 
	הערה: במקרה של כימיקלים רגישים לאור, לחסום את האור כדי למזער את הריקבון אור-induced. 
	הערה: לחלופין, לעשות צלחת NGM נורמלי בלי כימיקלים על הביצה הנחת assay, אשר יכול להתבצע באמצעות שני תנאים שונים טיפול כימי כפי שמתואר להלן.</li>
	<li>µL להוסיף 100 של חום-לא פעיל e. coli OP50 (כפי שמתואר בסעיף 2), מפוזר על כל צלחת NGM. מאפשרים לילה יבש בתוך חממה C. elegans ב- 20 ° C עבור בדיקה כימית</li>
</ol> 4. מדידה של C. elegans צמיחה <ol><li>העברה גיל-מסונכרנות C. elegans ביצים לצלחת NGM בתוספת 1% דימתיל סולפוקסיד או 750 etoposide מיקרומטר.</li>
	<li>Incubate. C. elegans באינקובטור ב 20 מעלות צלזיוס במשך 4 ימים. לצפות את התולעים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, לקחת תמונות מיקרוסקופיים כל יום. בדרך כלל 20 X הגדלה (1 עדשה המטרה X 2 X זום הגדלה, 10x עדשה מגדילה) מתאים התצפית צמיחה של C. elegans. גם לקחת תמונה מיקרוסקופית של מיקרומטר הבמה המיקרוסקופ עבור הכיול גודל התולעת. 
	הערה: משפיע רעב הבדיקה רעילות. לכן, להאכיל עם מספיק חיידקים או להתאים את שהועברו C. elegans ביצה מספרים בהתחלה. להתבונן עד 3 ימים כדי לא לכלול את האפשרות של הרעבה.</li>
	<li>למדוד את אורך הגוף של C. elegans שטופלו דימתיל סולפוקסיד או etoposide בכל נקודה בזמן שימוש בתוכנה ImageJ. 
	הערה: עבור כל אחת מהמידות לדוגמה, תולעים 50 מספיקים לניתוח סטטיסטי.
	<ol><li>, ImageJ, פתחו את התמונה מיקרומטר הבמה מיקרוסקופ (&#39; קובץ &#39; &#8594; &#39; פתח &#39;). 
		הערה: התמונה מיקרומטר ואת תולעת תמונות (שלב 4.2) חייב להיות ההגדלה אותו.</li>
		<li>גרור שורה של מיקרומטר 1,000 מיקרומטר כיול התמונה על-ידי שימוש &#39; קו ישר &#39; כלי.</li>
		<li>לחץ &#39; ניתוח &#39; &#8594; &#39; לקבוע קנה מידה &#39; קלט 1000 ומיקרומטר לתוך &#39; ידוע מרחק &#39; תיבת ו &#39; יחידת אורך &#39; תיבה, בהתאמה. בדוק &#39; Global &#39; ולחץ על &#39; אישור &#39;.</li>
		<li>פתח את התמונות תולעת (&#39; קובץ &#39; &#8594; &#39; פתוח &#39;). ציירו קו לאורך התכונה של כל תולעת באמצעות &#39; קו ביד חופשית &#39; בכלי. לקבל נתוני האורך הגוף על-ידי לחיצה על &#39; ניתוח &#39; &#8594; &#39; מידה &#39;.</li>
		<li>חזור על שלבים אלה עבור תולעים 50-</li>
	</ol></li></ol> 5. C. elegans ביצה הנחת Assay <ol><li>Incubate גיל-מסונכרנות ביצים על NGM צלחת המכיל דימתיל סולפוקסיד או etoposide עבור 64 h (לפני הלידה הראשונה) עד השלב למבוגרים צעירים בגיל 20 מעלות צלזיוס 
	הערה: זה אופציונליים לשימוש התולעים מן הניסויים מדידה לצמיחה. זה נוח לעשות את המדידה צמיחה, ביצה assay הנחת ביחד.</li>
	<li>5 להעביר תולעים בוגרות כדי NGM חדש הצלחות ללא כימיקלים (מצב 1, טיפול כימי בתוך תקופה מסוימת של זמן, מביצים לשלב צעירים למבוגרים) או בצלחת NGM חדש המכיל את רעלני כימי זהה (מצב 2, חשיפה מתמשכת של כימיקלים דרך התקופה הכוללת ניסויית), ואז דגירה אותם עבור ה 24 
	הערה: מומלץ לבצע ושכפול באמצעות לוחות NGM 3-5 עבור כל טיפול; משכפל אלה ניתן להשתמש לשם ניתוח סטטיסטי.</li>
	<li>להעביר לצלחת NGM חדש כפי שתואר לעיל, לספור את מספר ביצים כל יום. לספור את התולעים זחל, מת, ולא היו פנימי הצוהרבעריכת</li>
	<li>חזור על שלבים אלה עד התולעים להטיל ביצים יותר אין, בדרך כלל תוך 5 ימים.</li>
	<li>לחשב את מספר הביצים זיון לכל תולעת של כל צלחת, לסכם ערכים אלה כל יום במשך 5 ימים לקבוע את המספר הכולל של ביצים זיון. 
	הערה: לא לכלול את מספר תולעים זחל ועד פנימי בקעו מן החישוב.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Blomme, E. A., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicology+strategies+for+drug+discovery:+present+and+future.">Toxicology strategies for drug discovery: present and future.</a> Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).</li><li>Lilienblum, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+methods+to+safety+studies+in+experimental+animals:+role+in+the+risk+assessment+of+chemicals+under+the+new+European+Chemicals+Legislation+(REACH).">Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH).</a> Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).</li><li>Honnen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+powerful+alternative+model+organism+to+promote+research+in+genetic+toxicology+and+biomedicine.">Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine.</a> Arch. Toxicol. , (2017).</li><li>Hunt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+model+in+toxicity+testing.">The C. elegans model in toxicity testing.</a> J. Appl. Toxicol. 37 (1), 50-59 (2017).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+the+topoisomerase+inhibitor,+etoposide,+in+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans+and+3T3-L1+normal+murine+cells.">Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells.</a> Environ. Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li><li>Imanikia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+comet+assay+to+assess+the+genotoxicity+of+environmental+pollutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorooctane+sulfonate+exposure+causes+gonadal+developmental+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans+through+ROS-induced+DNA+damage.">Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage.</a> Chemosphere. 155, 115-126 (2016).</li><li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+screening+platform+for+the+rapid+assessment+of+chemical+disruption+of+germline+function.">A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function.</a> Environ. Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li><li>Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lead+phytochemicals+for+anticancer+drug+development.">Lead phytochemicals for anticancer drug development.</a> Front. Plant Sci. 7, 1667 (2016).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+topoisomerase+inhibitor,+daurinol,+suppresses+growth+of+HCT116+cells+with+low+hematological+toxicity+compared+to+etoposide.">A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide.</a> Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293 (2011).</li><li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin/IGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal.">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> J. Vis. Exp. (27), e1152 (2009).</li><li>Weimer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-Glucosamine+supplementation+extends+life+span+of+nematodes+and+of+ageing+mice.">D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice.</a> Nat. Commun. 5, 3563 (2014).</li><li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK/sirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension.">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).</li><li>Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+assessment+of+germline+chemical+toxicity+using+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J. Vis. Exp. (96), e52445 (2015).</li><li>Hahm, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+maximum+velocity+correlates+with+healthspan+and+is+maintained+in+worms+with+an+insulin+receptor+mutation.">C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation.</a> Nat. Commun. 6, 8919 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+spreading+and+toxicity+of+prion-like+proteins+using+the+metazoan+model+organism+C.+elegans.">Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (95), e52321 (2015).</li><li>Schmidt, B. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+acute+and+developmental+neurotoxicity+screening:+an+overview+of+cellular+platforms+and+high-throughput+technical+possibilities.">In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities.</a> Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+drug+toxicity+using+3D+spheroids+constructed+from+an+immortal+human+hepatocyte+cell+line.">Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line.</a> Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

במאמר זה, אנו מתארים את ההערכה רעילות של כימיקלים ב- C. elegans, נמטודות, באמצעות etoposide כדוגמה toxicant. למטרה זו, השתמשנו בשני תנאים ניסיוני. במערכה הראשונה, C. elegans גדלו על etoposide המכיל לוחות מביצים על הבמה למבוגרים צעירים, ואז התולעים הורשו להטיל ביצים על צלחות NGM רגילה ללא כימיקלים. במערכה ה...

הערכה רעילות חיוני עבור הפיתוח של תרופות, בריאותיים, cosmeceuticals, כמו גם את הערכת הסיכונים של רעלנים סביבתיים שונים. המודל מכרסמים הוא אחת ממערכות הפופולרי ביותר ויוו ניסיוני במחקר זה רעלים; לחלופין, ללא מידע יונקים אורגניזמים כגון C. elegans גם בשימוש נרחב. מודלים להערכה רעילות Non-מידע יונקים מועילים בגלל לא רק בעלי חיים סוגיות אתיות אבל גם שמתאים להם והתועלת בהתחשב משתלמת, לתחזוקה בקלות שמאפשר, מהירות ואת הפארמצבטית1,2 3, ,4.
C. elegans, קרקע סביב התולעת נוצלה כחיה מודל בחקר ביולוגיה וכימיה בסיסי ויישומי שונים. . זה באורך של 1 מ מ, תולעים נימיות שקוף, אשר פשוט נשמר ב מוצק או נוזלי תולעים נימיות צמיחה מדיה (NGM) נמאס את הנבג החיידק Escherichia coli OP50 C. elegans יש מחזור חיים קצר, והוא N2 פראי-סוג C. elegans מטילה כ 300 ביצים. לכן, זה בקלות הופץ כדי לשמש חומרים ניסיוניים3,4,5. C. elegans גם כבר בשימוש נרחב במחקרים רעילות של הרבה סמים, מזהמים סביבתיים6,7,8,9.
משום תרופות נגד סרטן רבות למקד במהירות חלוקת תאים סרטניים, הם יכולים גם לפגוע במהירות חלוקת תאים נורמליים כגון מח העצם, אפיתל המעי, התאים זקיק השיער. לדוגמה, תרופות מעכבות טופואיזומראז למקד את תהליך שכפול ה-DNA של תאים סרטניים; לכן, גם מונעים במהירות חלוקת תאים נורמליים. כל היצורים החיים יש topoisomerases, אלה טופואיזומראז מעכבי ככל הנראה השפעה סביבתיות אקולוגיות6,10,11. לכן, פלטפורמה הערכה רעילות התרופה באמצעות חיית מודל הוא יקר עבור שניהם הפיתוח של תרופות ושל הערכת סיכונים סביבתיים.
במאמר זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים מפורט כדי לבדוק הרעילות של etoposide, אשר הוא סוכן נגד סרטן קליני הזה טופואיזומראז מטרות II, כמו כימי רעיל דגם C. elegans. לענין זה, נתאר את שיטת המדידה לגודל הגוף ואת המספר הכולל של ביצים זיון ב- C. elegans שטופלו etoposide.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Affymetrix, USA</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans&lt;/em&gt; N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Wild type</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma, USA</td><td>C3045</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma, USA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli &lt;/em&gt;OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Sigma, USA</td><td>E1383</td><td></td></tr><tr><td>Image J software (ver 1.4)</td><td>Natinoal Institute of Health, USA</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Microscope camera</td><td>Jenopitk, Progress Gryphax, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Merck, USA</td><td>107213</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;times; 10 mm Petri dish</td><td>SPL Life Sciences, South Korea</td><td>10035</td><td></td></tr><tr><td>90 &amp;times; 15 mm Petri dish</td><td>SPL Life Sciences, South Korea</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Nikon, Japan</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring the effect of chemicals on the growth and reproduction of caenorhabditis elegans

הערכה רעילות חיוני להבנת השפעת כימיקלים על היצורים החיים בתחומים במדעי הביולוגיה בסיסי ויישומי. קרקע ללא מידע יונקים עגול תולעת, Caenorhabditis elegans, הוא אורגניזם מודל ערך מחקרים הרעלים בשל הנוחות שלה חוסר סוגיות אתיקה בעלי חיים לעומת מערכות בעלי חיים יונקים. ב פרוטוקול זה, מתואר הליך מפורט הערכה רעילות של כימיקלים C . elegans. תרופה נגד סרטן קליני, etoposide, אשר מטרות טופואיזומראז האדם השני, מעכב שכפול ה-DNA של תאים סרטניים אנושיים, נבחרה כמודל בדיקה כימית. גיל-מסונכרנות C. elegans ביצים נחשפו דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) או etoposide ולאחר מכן הצמיחה של C. elegans נוטרה כל יום במשך 4 ימים על ידי התצפית סטריאו מיקרוסקופ. המספר הכולל של ביצים זיון של C. elegans שטופלו דימתיל סולפוקסיד או etoposide נספר גם באמצעות המיקרוסקופ סטריאו. טיפול Etoposide מושפע באופן משמעותי את הצמיחה ואת רבייה של C. elegans. על ידי השוואה של המספר הכולל של ביצים זיון של תולעים עם טיפול שונה תקופות של כימיקלים, אפשר לפתור אותה כי הרבייה רעילות של כימיקלים על רבייה C. elegans הוא הפיך או בלתי הפיך. פרוטוקולים אלה עשוי להיות שימושי עבור שני בפיתוח של תרופות שונות, הערכת סיכונים של חשיפה לרעלים סביבתיים.

הטיפול etoposide (24-96 h) מפגר באופן משמעותי את הצמיחה של C. elegans. לאחר h 96 של דגירה, תולעים שטופלו etoposide גדלה 0.86 מ מ אורך הגוף, ואילו התולעים שטופלו הרכב גדל 1.04 מ"מ (איור 1). פיגור גדילה נצפתה גם ככל הנראה תחת השגחה סטריאו מיקרוסקופ (איור 2). התחלנו ל...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

פרוטוקול בסיסי כדי להעריך את הרעילות של כימיקלים חיית מודל, Caenorhabditis elegans, מתואר. השיטה זו נוח ושימושי עבור הפיתוח של תרופות כמו גם באשר הערכת הסיכונים של מזהמים סביבתיים שונים.

מדידת אפקט של כימיקלים על גדילה, רבייה של Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

measuring-effect-chemicals-on-growth-reproduction-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

16.8K Views.  Korea Institute of Science and Technology. פרוטוקול בסיסי כדי להעריך את הרעילות של כימיקלים חיית מודל, Caenorhabditis elegans, מתואר. השיטה זו נוח ושימושי עבור הפיתוח של תרופות כמו גם באשר הערכת הסיכונים של מזהמים סביבתיים שונים.

Video: Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Developmental Biology

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Biochemistry

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

וזמינותו תפוקה גבוהה עבור חיזוי של רעילות כימית על ידי אוטומטית פרופילים פנוטיפי של Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Environment

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term effects are very important in judging their consequences in the environment and on human health. In demonstrating long-term influences, effects of chemicals over generations in recent studies provide new insight. Here, we describe protocols for studying effects of chemicals over multiple generations using free-living nematode Caenorhabditis elegans. Two aspects are presented: (1) trans-generational (TG) and (2) multi-generational effect studies, the latter of which is separated to multi-generational exposure (MGE) and multi-generational residual (MGR) effect studies. The TG effect study is robust with a simple purpose to determine whether chemical exposure to parents can result in any residual consequences on offspring. After the effects are measured on parents, sodium hypochlorite solutions are used to kill the parents and keep the offspring so as to facilitate effect measurement on the offspring. The TG effect study is used to determine whether the offspring are affected when their parent is exposed to the pollutants. The MGE and MGR effect study is systematical used to determine whether continuous generational exposure can result in adaptive responses in offspring over generations. Careful pick-up and transfer are used to distinguish generations to facilitate effect measurement on each generation. We also combined protocols to measure locomotion behavior, reproduction, lifespan, biochemical and gene expression changes. Some example experiments are also presented to illustrate the trans- and multi-generational effect studies.

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Trans- and multi-generational effects of persistent chemicals are essential in judging their long-term consequences in the environment and on the human health. We provide novel detailed methods for studying trans- and multi-generational effects using free-living nematode Caenorhabditis elegans.

השימוש באלמרנים לחקר התופעות הטראנס-והרב של מזדורי הרעילות

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

תרבות ו Assay של בקנה מידה גדול מעורב שלב Caenorhabditis אוכלוסיות אלגנים

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Genetics

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use products. Based on their chemical structure and estradiol-like biological properties, they have been classified as endocrine disrupting compounds (EDC). Long-term exposure to EDCs, even at low doses, has been linked to various health defects including cancer, behavioral disorders and infertility, with greater vulnerability indicated during early developmental periods. Cellular and molecular studies with the genetically tractable nematode model Caenorhabditis elegans have demonstrated that exposure to BPA causes apoptosis, embryonic lethality and disruption in the DNA repair mechanisms. We have previously reported that exposure of C. elegans embryos to low doses of different bisphenols decreases fecundity. In addition, we have shown that the effects of exposure during the very early stages of development persist into adulthood as assayed by quantifying habituation behavior, a form of non-associative learning. Here, we provide detailed protocols for embryonic exposure to low-dose EDCs as well as the associated fecundity and anterior touch habituation assays, along with representative results.

Exposure to environmental toxicants can acutely impact development with long-term effects. Detailed protocols are provided to illustrate a strategy using an effective lab model to study the effect of early embryonic exposure to bisphenol A. We provide fecundity and behavioral assays to monitor the effectiveness of our toxicant exposure bio-assays.

השלכות התנהגותיות, הרבייה לטווח ארוך של חשיפה עובריים חשיפה לרעלים במינון נמוך

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

מדידת ההשפעות של חיידקים על<em&gt; ג Elegans</em&gt; התנהגות באמצעות Assay שימור ביצה

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Biology

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a nonmammalian animal model that is widely used as an assay system due to its short lifespan, transparency, cost-effectiveness, and lack of animal ethics issues. In this study, a method was developed to investigate the effects of different bacteria and 3,3'-diindolylmethane (DIM) on the intestinal permeability of C. elegans with a high-throughput image analysis system. The worms were infected with different gut bacteria or cotreated with DIM for 48 h and fed with fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran overnight. Then, the intestinal permeability was examined by comparing the fluorescence images and the fluorescence intensity inside the worm bodies. This method may also have the potential to identify probiotic and pathogenic intestinal bacteria that affect intestinal permeability in the animal model and is effective for examining the effects of harmful or health-promoting chemicals on intestinal permeability and intestinal health. However, this protocol also has some considerable limitations at the genetic level, especially for determining which genes are altered to control illness, because this method is mostly used for phenotypic determination. In addition, this method is limited to determining exactly which pathogenic substrates cause inflammation or increase the permeability of the worms' intestines during infection. Therefore, further in-depth studies, including investigation of the molecular genetic mechanism using mutant bacteria and nematodes as well as chemical component analysis of bacteria, are required to fully evaluate the function of bacteria and chemicals in determining intestinal permeability.

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

This protocol describes how to measure intestinal permeability of Caenorhabditis elegans. This method is helpful for basic biological research on intestinal health related to the interaction between intestinal bacteria and their host and for screening to identify probiotic and chemical agents to cure leaky gut syndrome and inflammatory bowel diseases.

מדידת ההשפעות של חיידקים וכימיקלים על חדירות המעי של האלמרנים

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Caenorhabditis elegans is a powerful model organism used in many research laboratories to understand the consequences of exposure to chemical pollutants, pesticides, and a wide variety of toxic substances. These nematodes are easy to work with and can be used to generate novel research findings, even in the undergraduate biology laboratory. A multi-week laboratory series of authentic, student-driven research projects trains students in a toolkit of techniques and approaches in behavioral measurements, cell biology, and microscopy that they then apply to their projects. One technique in that toolkit is quantifying the percentage of neurons exhibiting neurodegenerative damage following exposure to a chemical toxicant like a pesticide. Young adult C. elegans nematodes can be exposed to different concentrations of commercially available pesticides or other types of toxicants for 2-24 h. Then, undergraduate students can visualize different neuron subtypes using fluorescent-expressing strains of C. elegans. These techniques do not require sophisticated image processing software and are effective at even low magnifications, making the need for expensive confocal microscopy unnecessary. This paper demonstrates how to treat the nematodes with pesticides and how to image and score the neurons. It also provides a straightforward protocol for the microscopy and analysis of neuron morphology. The materials used for this technique are inexpensive and readily available in most undergraduate biology departments. This technique can be combined with behavioral measures like locomotion, basal slowing, or egg-laying to conduct a potentially publishable series of experiments and give undergraduate students an authentic research experience at a very low cost.

Examining the Effect of Pesticides on Caenorhabditis elegans Neurons

Young adult Caenorhabditis elegans nematodes are exposed to different concentrations of commercial pesticides or other toxicants for 2-24 h. Then, different neurons can be visualized using fluorescent-expressing strains. This paper demonstrates how to expose nematodes to pesticides and assess neuron damage.

בחינת ההשפעה של חומרי הדברה על נוירונים Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a powerful model organism used in many research laboratories to understand the consequences of exposure to chemical pollutants, ...

Neuroscience

השבתה מטבולית חיידקית ב Caenorhabditis elegans באמצעות Paraformaldehyde

Methodology to Metabolically Inactivate Bacteria for Caenorhabditis elegans Research

Caenorhabditis elegans is a common model organism for research in genetics, development, aging, metabolism, and behavior. Because C. elegans consume a diet of live bacteria, the metabolic activity of their food source can confound experiments looking for the direct effects of various interventions on the worm. To avoid the confounding effects of bacterial metabolism, C. elegans researchers have used multiple methods to metabolically inactivate bacteria, including ultraviolet (UV)-irradiation, heat-killing, and antibiotics. UV treatment is relatively low-throughput and cannot be used in liquid culture because each plate must be examined for successful bacterial killing. A second treatment method, heat-killing, negatively affects the texture and nutritional quality of the bacteria, leading to the developmental arrest of C. elegans. Finally, antibiotic treatment can directly alter C. elegans physiology in addition to preventing bacterial growth. This manuscript describes an alternative method to metabolically inactivate bacteria using paraformaldehyde (PFA). PFA treatment cross-links proteins within bacterial cells to prevent metabolic activity while preserving cellular structure and nutritional content. This method is high-throughput and can be used in liquid culture or solid plates, as testing one plate of PFA-treated bacteria for growth validates the whole batch. Metabolic inactivation through PFA treatment can be used to eliminate the confounding effects of bacterial metabolism on studies of drug or metabolite supplementation, stress resistance, metabolomics, and behavior in C. elegans.

מחבר זרקור: קידום מחקר Caenorhabditis elegans באמצעות חיידקים שטופלו בפרפורמאלדהיד 

The food source for Caenorhabditis elegans in the lab is live Escherichia coli. Since bacteria are metabolically active, they present a confounding variable in metabolic and drug studies in C. elegans. A detailed protocol to metabolically inactivate bacteria using paraformaldehyde is described here.

מתודולוגיה להשבתה מטבולית של חיידקים למחקר Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a common model organism for research in genetics, development, aging, metabolism, and behavior. Because C. elegans consume a ...

מדידת אפקט של כימיקלים על גדילה, רבייה של Caenorhabditis elegans

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות