המחברים מבקשים להודות לbiolitec המחקר GmbH (Jena, גרמניה) לחביבות לתת לנו ניסוח mTHPC liposomal, עם תודה מיוחדת לסוזנה Grafe וארנו Wiehe לעזרתם ומומחיות טכנית. כמו כן, אנו רוצים להודות לקרסטין ריידי, שנוצר חלק גדול מהתוצאות והיה coresponsible לפרסומו 11. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מSchweizerischer Verein Balgrist, אוניברסיטת ציריך, ציריך Krebsliga כמו גם על ידי מענק מל &#39;וולטר וקרן יוהנה וולף, ציריך, שוויץ ומענק מEuroNanoMed ERA-NET / SNF שוויצרי הקרן הלאומית למדע 31NM30-131004/1. עבודה זו נתמכה גם על ידי תכנית (מאוד מיוחדת לרפואה) לשלד ושרירי אונקולוגיה של ציריך Kanton HSM.

1. השוואה בין הספיגה של mTHPC בנמוכה ביותר בהתאמה וגרורתי HOS ושורות תאי 143B OS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום תרבית תאים המכיל DMEM, Ham F12, וסרום חום מומת עוברי עגל ב4.5:4.5:1 יחס. הערה: ניסוח liposomal של mTHPC נ.ב. היה מומס במים בריכוז סופי של 1.5 מ&quot;ג / מיליליטר mTHPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HOS פלייט 0.2 x 10 6 ותאי 143B / גם ב6 צלחות היטב (triplicates עבור כל תנאי) ולתת לתאים לדבוק לילה. שים לב: המספר צריך להיות מותאם לשורות תאים בודדות. Confluency של 80-90% הוא מתאים ביותר בעת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום למחרת, דגירה התאים עם ריכוז קבוע של mTHPC לתקופות זמן שונה (ספיגה תלויה בזמן), או עם עלייה בריכוזים של mTHPC במהלך פרק זמן קבוע (ספיגה תלויה במינון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם mTHPC עבור p זמן מסויםoints או ריכוזים של mTHPC. שים לב: במחקר זה, הן את HOS ושורות תאי 143B הודגרו עם 0.6 מיקרוגרם / מיליליטר mTHPC עבור 0, 2.5, 5, או 10 שעה, או עם 0, 0.6, 2.5, ו10 מיקרוגרם / מיליליטר mTHPC במשך 5 שעות. פרקי הזמן שיושמו ומינונים עשויים להשתנות תלוי בשורה של התאים המשמשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכור תמיד לעבוד בחושך או בתנאי תאורה מעומעמים כדי למנוע חשיפה לאור ישירה של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה של התאים בתנאים מצויינים, לשאוב את המדיום ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. בשלב הבא, לנתק את התאים עם 0.5 מיליליטר טריפסין / EDTA ולספור את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ניתוק, צנטריפוגה התאים ב XG 400 למשך 5 דקות, לשאוב את המדיום וresuspend תאי PBS לצפיפות סופית של 200,000 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> של ההשעיה התא שהושגה פיפטה 100 μl (כלומר 20,000 תאים) בצלחת 96 היטב ולמדוד את הקרינה של תאים אלה בספקטרופוטומטר הקרינה. ההגדרהשל מדידות הקרינה mTHPC הם: 417 ננומטר לעירור ו652 ננומטר לפליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לחשב את כמות mTHPC המופנם לכל תא, לנרמל את יחידת הקרינה היחסית (RFU) למספר התא ונפח תא כדלקמן: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את עקומת סטנדרט באמצעות ריכוזים שונים של mTHPC ב-PBS 0-4 מיקרוגרם / מיליליטר (מדידות בשלושה עותקים לשימוש). פיפטה של ​​דילול כל 100 μl בצלחת 96 היטב ולמדוד את הקרינה של הבארות תוך שימוש בהגדרות שתוארו בשלב 1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את RFU (המתקבל ל20,000 תאים) על ידי שיפוע העקום הסטנדרטי ליניארי של mTHPC, אשר נותן את הריכוז של mTHPC (במיקרוגרם / מיליליטר) בבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים ריכוז mTHPC זאת על ידי 10 כדי לקבל את הסכום הכולל של mTHPC בבאר אחת (במיקרוגרם, המייצג את ההשעיה תא 100 μl) ולחלק את הערך הזה בנפח של 20,000 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הנפח עם הנוסחה לתחום: (4/3 π x) xr 3. השג את הרדיוס r על ידי מדידת הקוטר של 20 תאים trypsinized תחת מיקרוסקופ, וחלוקת ערך זה על ידי 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, לנרמל את כל הערכים לאלו שהושגו עבור תאי HOS לאחר 10 שעות של דגירה (ספיגה תלויה במינון) או מטופלים עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר mTHPC (ספיגה תלויה בזמן), שנקבעו ל100%. </li></ol> 2. מדידה של phototoxicity של PS במבחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי 3,000 תאים / היטב בצלחת 96 היטב (triplicates עבור כל ריכוז של mTHPC משומש) ולתת להם לדבוק בלילה. כמו כן להכין צלחת 96 היטב נוספת ולטפל בתאים כמתואר בהמשך, אבל אז לשים אותם בצד להדמיה בניגוד שלב. שים לב: המספר צריך להיות מותאם לכל שורת תא בודדת. Confluency של 50-60% בעת הניסוי הוא אידיאלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכור להוסיף את שליטת הרעילות הכהה המתאימה של תאים לכל אחד מריכוזי mTHPC.se הם תאים שיהיה הודגרו בהעדר או הנוכחות של ריכוזים נבחרים של mTHPC, אבל לא יהיה מואר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום למחרת, דגירה התאים עם ריכוזים שונים של mTHPC (0, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.03, 0.075, 0.15, 0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 5, ו10 מיקרוגרם / מיליליטר) בהתאם לשורות התאים ו לשמור אותם בחושך במשך 5 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיין בסעיף 1.3.2 הערה: זמן הדגירה לפני התאורה תלויה בשורת התאים ועל PS בשימוש, ולכן מומלץ לבדוק את הריכוזים שונים ובנקודתי זמן שונות בניסויים נפרדים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה לתקופה הזמן המצוינת, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ולהוסיף בינוניים טרי חדש ללא mTHPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאיר את התאים עם לייזר 652 ננומטר דיודה, ספציפי לספקטרום ספיגת mTHPC (ראה איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הלייזר ל21.88 mW / 2 סנטימטר כוח בגובה של 13.5 dista סנטימטרNCE מהתאים, על מנת לקבל את מנת אנרגיה של 5 J / 2 סנטימטר. להאיר את התאים ל230 שניות. אל להאיר את תאי שליטת רעילות הכהים (עם ובלי mTHPC). שים לב: תמיד להרכיב משקפיים כדי להגן על העיניים מפני אור הלייזר המשמש לעירור של PS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הארה, לשמור על התאים בחושך ב37 º C למשך 24 שעות. בהמשך לכך, להוסיף tetrazolium מסיס במים מגיב (WST-1) (10 μl/100 μl של מדיום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלוש שעות לאחר התוספת של המגיב WST-1, למדוד את הספיגה של בארות בודדות של צלחת 96 היטב ב415 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את אחוז התאים ששרדו, קבע את הממוצע של הערכים שהתקבלו עבור תאי mTHPC שאינו מטופלים עבור כל תנאי ל100% (המוארים כלומר, ללא mTHPC וnonilluminated, ללא mTHPC). </li></ol> 3. הערכה של מספר סלולרי על ידי ספירת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע 20,000 /ll בצלחת 24 גם ולתת להם לדבוק בלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עבור שעה 5 עם mTHPC (0.001, 0.003, 0.15, 0.6, ו1.25 מיקרוגרם / מיליליטר) ולהאיר אותם כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את המדיום, לשטוף את תאי פעם עם PBS, trypsinize אותם ולאסוף אותם על ידי צנטריפוגה ב XG 400 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, לשאוב את המדיום וresuspend התאים 200 μl של מדיום חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים בתא נויבאואר. </li></ol>

<ol>
	<li>Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+cancer.+Basic+principles+and+applications.">Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications.</a> Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).</li><li>Agostinis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+of+cancer:+an+update.">Photodynamic therapy of cancer: an update.</a> CA Cancer. 61, 250-281 (2011).</li><li>D'Adamo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appraising+the+current+role+of+chemotherapy+for+the+treatment+of+sarcoma.">Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma.</a> Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).</li><li>Allison, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meta-analysis+of+osteosarcoma+outcomes+in+the+modern+medical+era.">A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era.</a> Sarcoma. , (2012).</li><li>Anninga, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapeutic+adjuvant+treatment+for+osteosarcoma:+where+do+we+stand.">Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand.</a> Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).</li><li>Bacci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+relapse+in+patients+with+osteosarcoma+of+the+extremities+treated+with+neoadjuvant+chemotherapy.">Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy.</a> Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).</li><li>Briccoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resection+of+recurrent+pulmonary+metastases+in+patients+with+osteosarcoma.">Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma.</a> Cancer. 104, 1721-1725 (2005).</li><li>Milla Sanabria, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+indirect+photodynamic+therapy+effects+on+the+cellular+and+molecular+components+of+the+tumor+microenvironment.">Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).</li><li>Mitra, S., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photophysical+parameters,+photosensitizer+retention+and+tissue+optical+properties+completely+account+for+the+higher+photodynamic+efficacy+of+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin+vs+Photofrin.">Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin.</a> Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).</li><li>Ma, L., Moan, J., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+photosensitizer,+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin,+for+use+in+photodynamic+therapy:+a+comparison+of+its+photobiological+properties+with+those+of+two+other+photosensitizers.">Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers.</a> Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).</li><li>Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTHPC-mediated+photodynamic+therapy+is+effective+in+the+metastatic+human+143B+osteosarcoma+cells.">mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells.</a> Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).</li><li>Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+sensitivity+of+microvascular+endothelial+cells,+fibroblasts+and+tumor+cells+after+in+vitro+photodynamic+therapy+with+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.">Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.</a> Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).</li><li>Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+in+oncology.">Photodynamic therapy in oncology.</a> Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).</li><li>Burch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+canine+osseous+tumors+with+photodynamic+therapy:+a+pilot+study.">Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגוד עניינים.

כדי להשיג cytotoxicity האופטימלי בתגובה לPDT, זה הכרחי כדי לבחור את הגדרות לייזר אור הנכונות ובזמני דגירה. הנהלים שתוארו כאן הם עקביים ויעילים כדי לקבוע ספיגת PS ולכמת cytotoxicity PDT מושרה במבחנה. שימוש באורכי גל הקליטה הספציפי של mTHPC PS, ספיגת PS הסלולרית ניתן לקבוע באופן ישיר, ?...

המצב של היום של טיפול האמנות של אוסטאוסרקומה (OS), גידול עצם עיקרי, כולל שילוב של כימותרפיה adjuvant הניאו וניתוח. משטר טיפול זה גילה עלייה בשיעור ההישרדות של חולים עם מחלה מקומית מכ 20% לפני השימוש בכימותרפיה, כדי כיום בין 60-70% 3, 4. עם זאת, בשני העשורים האחרונים, ההישרדות הכוללת של חולים עם מחלת OS מקומית התייצבה 4, 5. יתר על כן, 30-40% מהחולים האלה להשנות תוך 3 שנים לאחר אבחון וחולים עם מחלה גרורתית ימשיכו להיות הישרדות עניות של 20-30% 4, 6, 7. כדי לשפר את התוצאה של חולים אלה, אסטרטגיות טיפוליות חדשות צריכים להיות מפותחות. טיפול פוטודינמי (PDT), טיפול נגד סרטן ולא רומן, משתמש באור באורך גל מסוים לעירור של photosensiTizer (PS), אשר מצטבר בתאים הסרטניים לאחר הזרקתה למחזור הדם. אור עירור הלייזר של PS מייצר רדיקלים בנוכחות החמצן, אשר לגרום לתגובה ציטוטוקסיות בתאים סרטניים ומוות של תאים. חוץ ממנגנון עיקרי זה, שני PDT נוסף עורר תהליכים ביולוגיים יתרמו לצמיחת גידול מופחתת: PDT גורם להתכווצות כלי דם והיווצרות קרישי דם על נימי הדם הזעיר וגידול, וכתוצאה מכך היפוקסיה מקומית ואנוקסיה בתוך הגידול, מה שמוביל לאוטם גידול. לבסוף, PDT נפצע ותאים סרטניים מתים לעורר תגובה חיסונית מקומית, תכונה ייחודית למדי של PDT. זה כולל את מערכת המשלימה והפעלה של אנטיגן הצגת תאים דנדריטים 8. לכן, תנאים שנוצרו להצגת אנטיגנים סרטניים עם ההפעלה הבאה של תאי הלימפה, מה שמובילים לחסינות ספציפית גידול. עד כה, PDT כבר בשימוש לטיפול בסוגים שונים של גידולים ברקמות רכים וhyperplאסיה של, כגון keratosis actinic, ושטו בארט, גידולי Endobronchial, סרטן שלפוחית ​​השתן, קרצינומה של תאים הבזליים, וטיפול פליאטיבי של סרטן הראש והצוואר 2. הטיפול ידוע לגרום נמק בקנה מידה מקומי, גדול עם מעט תופעות לוואי בלבד, ולכן יש לו הפוטנציאל למיגור רקמת גידול באופן סלקטיבי. למרות יתרונות אלה, היישום של PDT נשאר מבחינה טכנית תובעני יותר מהממשל של תרופות כימותרפיות. על מנת להשיג יעילות מרבית, ריכוז PS, זמן חשיפה לאור וסך העברת אנרגיית אור צריך להיות מותאם. ניתן לעשות זאת בניסויי vivo, אבל, בגלל המספר הגדול היחסי של פרמטרים שצריכים להיות מותאמים, הוא יעיל יותר בהתחלה כדי לקבוע תנאים אופטימליים במבחנה. בניסויים שתוארו להלן, שבדקנו את היעילות במבחנה של PDT באמצעות CHL PS 5,10,15,20-tetrakis (meta-hydroxyphenyl)אורין, מקוצר mTHPC (איור 1 א). mTHPC הוא החומר הפעיל במוצר הרפואי Foscan, אשר משמש כיום במרפאת לטיפול פליאטיבי של סרטן הראש והצוואר. זהו אחד נ.ב. החזק ביותר, גרימת נזק לתאים מסיביים כבר בריכוזים נמוכים, וזה הודגם להיות עדיף על PS האחר במונחים של רקמת חדירה 9, 10. ספקטרום בליעת האור שלו (איור 1) מראה שתי פסגות בולטות, אחד ב417 ננומטר ושני ב652 ננומטר, המשמשות ללוקליזציה רקמות של צבירת PS ולזירוז PDT, בהתאמה. נכון לעכשיו, ניסוח liposomal לmTHPC הוא בפיתוח. כאן, אנו מתארים את הנהלים לכמת את הספיגה של ניסוח liposomal זה, ולבצע PDT בשתי שורות תאי מערכת הפעלה אנושיות; HOS גרורתי הנמוך ותאי 143B גרורתי גבוהים. חלק מהנתונים שהוצגו כאן כבר דיווחו 11 קודם לכן. הגישת דואר המתוארת כאן מאפשרת לנו לחקור את ההשפעה של פנוטיפ גרורתי ביעילות PDT. 143B תאים, הזריקו orthotopically לגפיים האחורי של עכברי SCID חסרים חיסוניים לגרום לגידולי intratibial גרורות ראשוניים, מודל חיקוי המחלה הגרורה האדם באופן הדוק. לכן, בניסויים במבחנה המוצעים הם בצורה מושלמת מתאימים כדי להעריך את ההגדרות אופטימלי PDT להיות מאוחר יותר נעשה שימוש בניסויי in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">DMEM</td>
			<td style="width:251px;">PAA GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td style="width:127px;">E15-883</td>
			<td style="width:287px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">HAM F12</td>
			<td>PAA GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td style="width:127px;">E15-817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">heat-inactivated fetal calf serum</td>
			<td>GIBCO, Basel, Switzerland</td>
			<td style="width:127px;">10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:291px;">mTHPC</td>
			<td style="width:251px;">biolitec research GmbH, Jena, Germany</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:287px;">As this liposomal formulation is originating from R &#38; D 
			no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; &#62;99% purity)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectramax Gemini XS plate reader</td>
			<td style="width:251px;">Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:127px;">ID# 861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Microscope Zeiss Observer.Z1</td>
			<td style="width:251px;">Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Ceralas PDT 652 nm Laser</td>
			<td style="width:251px;">Biolitec AG, Jena, Germany</td>
			<td style="width:127px;">LD652nm2W400u</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Water-soluble tetrazolium (WST) reagent</td>
			<td style="width:251px;">Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland</td>
			<td style="width:127px;">1644807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytotoxic efficacy of photodynamic therapy in osteosarcoma cells in vitro

בשנים האחרונות, חל קושי במציאת טיפולים יעילים יותר נגד סרטן עם תופעות לוואי מערכתיים פחות. לכן הטיפול פוטודינמי הוא גישה חדשנית לטיפול סלקטיבית יותר גידול. טיפול פוטודינמי (PDT), שעושה שימוש בפוטוסנסיטייזר רעיל (PS), אשר, על הפעלה עם אור באורך גל מסוים בנוכחות חמצן, יוצר רדיקלים שיעוררו תגובה ציטוטוקסיות 1. למרות אישורה לפני כמעט עשרים שנה על ידי ה-FDA, PDT הוא כיום משמש רק לטיפול במספר מצומצם של סוגי הסרטן (עור, שלפוחית ​​השתן) ומחלות nononcological (פסוריאזיס, keratosis actinic) 2. היתרון העיקרי של השימוש בPDT הוא היכולת לבצע טיפול מקומי, המונע תופעות לוואי מערכתיות. יתר על כן, היא מאפשרת טיפול בגידולים באתרים עדינים (למשל סביב עצבים או כלי דם). הנה, intraoperatיישום ive של PDT נחשב באוסטאוסרקומה (OS), גידול של העצם, כדי למקד את לוויני גידול ראשוניים נשאר מאחור בגידול רקמות לאחר כריתת גידול כירורגית. הטיפול שמטרתו להפחית את מספר הישנויות ולצמצם את הסיכון לגרורות (לאחר ניתוח). במחקר הנוכחי, אנו מציגים במבחנה נהלי PDT להקים הגדרות PDT אופטימליות לטיפול יעיל של שורות תאים בשימוש נרחב מערכת הפעלה המשמשות לשחזר את המחלה האנושית בעכברי מודל OS intratibial מבוססים היטב. הספיגה של mTHPC נ.ב. נבדקה בספקטרופוטומטר וphototoxicity היה עורר עם עירור אור הלייזר של mTHPC ב652 ננומטר כדי לגרום למוות של תאים הוערך עם assay WST-1 ועל ידי הספירה של תאים ששרדו. הטכניקות הוקמו תאפשר לנו להגדיר את הגדרות PDT אופטימליות למחקרים עתידיים במודלים של בעלי חיים. הם כלי קל ומהיר להערכת היעילות של טיפול פוטודינמי <em&gt; במבחנה לפני יישום in vivo.

בעזרת הטכניקות כאן דיווחו, אנחנו בדקנו PDT מבוסס mTHPC בתאי מערכת הפעלה אנושיים. ראשית, הספיגה תלויה בזמן ובמינון של mTHPC נחקרה בHOS גרורתי הנמוך ובשורות תאי 143B OS גרורתי מאוד. ספיגת mTHPC יכולה להיות מוערכת על ידי מדידת הקרינה של mTHPC עם ספקטרופוטומטר הקרינה (איור 2, לשכ?...

Watch this Scientific Journal Video about Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro at JoVE.com

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

הפרוטוקול דיווח כאן מאפשר ההערכה של היעילות של טיפול פוטודינמי (PDT) בשורות תאים ואופטימיזציה של הגדרות PDT לפני יישום הטיפול במודלים של בעלי חיים.

ציטוטוקסיות יעילות של טיפול פוטודינמי בתאי אוסטאוסרקומה<em&gt; במבחנה</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

cytotoxic-efficacy-photodynamic-therapy-osteosarcoma-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

12.7K Views.  Balgrist University Hospital, Zurich, Switzerland.  הפרוטוקול דיווח כאן מאפשר ההערכה של היעילות של טיפול פוטודינמי (PDT) בשורות תאים ואופטימיזציה של הגדרות PDT לפני יישום הטיפול במודלים של בעלי חיים. 

Video: Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

הזרקת subretinal של וקטורי ריפוי גנטי ותאי גזע לעיניים המאוסות

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

בהעשרת מבחנה של תאי ייזום-גידול סרטן השחלות

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin-induced נפיחות מעיים Organoids: An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay עבור הערכת תגובה לתרופה בחולי סיסטיק פיברוזיס

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

הכנה<em&gt; במבחנה</em&gt; אפיון ממוגנטים miR-modified לתאי אנדותל

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

שיטה לכימות ביצוע גפיים עליונים ב Daily Life בעזרת מדי תאוצה

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light photoactivation to induce cell apoptosis. The Federal Drug Administration has approved PDT for the treatment of actinic keratosis, and clinical guidelines recommend PDT as a treatment for certain non-melanoma skin cancers and acne vulgaris. PDT is an advantageous therapeutic modality as it is low cost, non-invasive, and associated with minimal adverse events and scaring. In the first step of PDT, a PS is applied and allowed to accumulate intracellularly. Subsequent light irradiation induces reactive oxygen species formation, which may ultimately lead to cell apoptosis, membrane disruption, mitochondrial damage, immune modulation, keratinocyte proliferation, and collagen turnover. Herein, we present an in vitro method to study PDT in an adherent cell line. This treatment protocol is designed to simulate PDT and may be adjusted to studying the use of PDT with various cell lines, photosensitizers, incubation temperatures, or photoactivation wavelengths. Squamous cell carcinoma cells were incubated with 0, 0.5, 1.0, and 2 mM 5-aminolevulinic acid (5-ALA) for 30 min and photoactivated with 417 nm blue light for 1,000 s. The primary outcome measure was apoptosis and necrosis, as measured by annexin-V and 7-aminoactinomycin D flow cytometry. There was a dose-dependent increase in cell apoptosis following thirty-minute incubation of 5-ALA. To achieve high inter-test validity, it is important to maintain consistent incubation and light parameters when performing in vitro PDT experiments. PDT is a useful clinical procedure and in vitro research may allow for the development of novel PSs, optimization of protocols, and new indications for PDT.

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light photoactivation to induce apoptosis. We present an in vitro PDT protocol designed to simulate PDT that may be used to study differences in PS incubation and light treatment parameters.

גישה במבחנה טיפול פוטודינמי

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light ...

Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang (GSK) granules, a marketed prescription in China, have bone-protective effects in treating POP. Before administration to the body, one standard preparation procedure is commonly required, which aims to promote the release of active constituents from raw herbs and enhance the pharmacological effects as well as therapeutic outcomes. This study proposes a detailed protocol for using GSK granules in in vivo and in vitro experimental assays. The authors first provide a detailed protocol to calculate the animal-appropriate dosages of granules for in vivo investigation: weighing, dissolving, storage, and administration. Second, this article describes protocols for micro-CT scanning and the measurement of bone parameters. Sample preparation, protocols for running the micro-CT machine and quantification of bone parameters were evaluated. Third, serum-containing GSK granules are prepared, and drug-containing serum is extracted for in vitro osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. GSK granules were intragastrically administered twice per day to rats for three consecutive days. Blood was then collected, centrifuged, inactivated, and filtered. Finally, serum was diluted and used for performing osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. The protocol described here can be considered a reference for pharmacological investigations of herbal prescription medicines, such as granules.

Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

This article provides a detailed protocol for preparing a working solution of Gushukang granules for animal studies and GSK granule containing serum for in vitro experiments. This protocol can be applied to pharmacological investigations of herbal medicines as well as prescriptions for both in vivo and in vitro experiments.

הכנת הגרגירים של גושוקאנג (GSK) בגרגרים בVivo ובניסויים חוץ-גופית

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...

Large Animal Model for Evaluating the Efficacy of the Gene Therapy in Ischemic Heart

Coronary artery disease is one of the significant causes of mortality and morbidity worldwide. Despite the progression of current therapeutics, a considerable proportion of coronary artery disease patients remain symptomatic. Gene therapy-mediated therapeutic angiogenesis offers a novel therapeutic method for improving myocardial perfusion and relieving symptoms. Gene therapy with different angiogenic factors has been studied in few clinical trials. Due to the novelty of the method, the progress of myocardial gene therapy is a continuous path from bench to bedside. Therefore, large animal models are needed for evaluating the safety and efficacy. The more the large animal model identifies the original disease and the endpoints used in clinics, the more predictable outcomes are from clinical trials. Here, we introduce a large animal model for evaluating the efficacy of the gene therapy in the ischemic porcine heart. We use clinically relevant imaging methods such as ultrasound imaging and 15H2O-PET. For targeting the gene transfers into the desired area, electroanatomical mapping is used. The aim of this method is: (1) to mimic chronic coronary artery disease, (2) to induce therapeutic angiogenesis at hypoxic areas of the heart, and (3) to evaluate the safety and efficacy of the gene therapy by using relevant endpoints.

Myocardial gene therapy for ischemic heart disease holds great promise for future therapeutics. Here, we introduce a large animal model for evaluating the efficacy of gene therapy in the ischemic heart.