המחברים מבקשים להודות למר ריצ&#39;רד אבץ וטוד Wiernicki להכשרה מתודולוגית והדרכה assay. אנו מודים גם יוחנן פאולוס ספנס לקריאה זהירה ועריכת הצעות. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות 060,397 MH, מוח והתנהגות קרן מחקר, ואלי לילי וחברה באמצעות התכנית לילי פרס המחקר (LRAP).

1. התרחבות וCryopreservation של תאי Assay מוכנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות CHO-K1-DRD 2L תאים (CHO-D 2L) על צלחת 15 סנטימטר 2 תא תרבות בתקשורת F12 של שינקין בתוספת 1.0 מיקרומטר L-גלוטמין, 800 G418 מיקרוגרם / μl, 300 מיקרוגרם / hygromycin μl, 100 u / μl פניצילין, 100 מיקרוגרם / μl סטרפטומיצין, ו10% בסרום שור העובר (FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO 2 עד לתאים ומחוברות 90-95%. לשטוף את התאים עם 10 μl בופר פוספט (PBS), ולאסוף את התאים על ידי הוספת 3 μl של חיץ התא דיסוציאציה במשך 5 דקות ב37 ° C. Resuspend התאים באמצעות 12 μl של התקשורת והתרבות ולספור תאים באמצעות הרחקת trypan כחולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה תא XG 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב μl 5 של תקשורת הקפאה (10% sulfoxide דימתיל, 90% FBS). לדלל את ההשעיה התא כדי להשיג את הריכוז הרצוי של התאים (לדוגמא: 1-20 x 10 6 תאים / μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> μl 1.0 aliquot של פתרון תא לכל cryovial. דגירה cryovials במכל הקפאת תא ב -80 ° C במשך הלילה. העבר את cryovials לN 2 מיכל נוזל לאחסון ארוך טווח. </li></ol> 2. תאי ציפוי Assay מוכנים (ואופציה ההפוך Transfection) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להפשיר cryovial קפוא של תאים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. ברגע שתאים מופשרים, להעביר את תאי צינור חרוטי 15 μl מכיל 9 μl של Opti-ממ, ומערבבים על ידי צינור היפוך 3-5x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant ו resuspend התאים ב1 μl Opti-ממ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות הרחקת trypan הכחולה כדי לקבוע כדאיות תא ולדלל את תאי קיימא במידת צורך (למשל. 3 x 10 5 תאים / ריכוז μl) בOpti-ממ. צלחת 10 μl / טוב של תאים בתרבית רקמה שטופלה צלחת 384 גם בעזרת פיפטה רבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך דילולים סדרתי של המחנה בOpti-ממ כדי ליצור עקומה סטנדרטית להערכת ייצור cAMP על ידי התאים (לפי מייצר המלצות - ראה סעיף 7). הוסף 10 μl / טוב של הסטנדרטים cAMP לצלחת הערה:. עקומת סטנדרט אחד יכולה להיות מוכנה על צלחת נפרדת או בארות ריקות באחת מצלחות assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס חממת humidified עם 5% CO 2 למשך שעה 1. </li></ol> 3. הפוך אפשרות transfection siRNA * סעיף זה הוא אופציונלי ורלוונטי לאיור 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של siRNA ב DDH RNase ללא 2 O (0.4 pmol / μl לדוגמא). הוסף 5 μl לבארות בודדות של צלחת 384 גם, ו צנטריפוגות הצלחת ב100 XG 15 seג בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל Lipofectamine 2000 בOpti-ממ בפקטור של 0.006 (למשל להוסיף 6 μl של Lipofectamine 2000 ל1,000 μl של Opti-ממ), ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פתרון Lipofectamine 2000/Opti-MEM במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. הוסף 5 μl של פתרון Lipofectamine 2000/Opti-MEM המדולל לבארות בודדות של צלחת 384 גם שכבר מכיל siRNA. צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת ל30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מוכנים assay הצלחת כפי שתואר לעיל (סעיף 2). צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור צלחת assay לחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2) ל48-96 שעה כפי שנקבע לגן ממוקד להפיל (ראו דיון). </li></ol> 4. הקרנת מולקולה קטנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התרופה של עניין (מעכבים למשל. מולקולה קטנה) בOpti-ממ ל6x הריכוזים הסופיים הרצויים. דילולים סידוריים ניתן להשלים באמצעות טפטפות כף יד או תחנת טיפול נוזלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 μl / טוב של מתחם הבדיקה או מאגר המכיל רכב (למשל DMSO) לצד השני של הבארות בעזרת פיפטה רבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר (דגירה היא אופציונלית). </li></ol> 5. מתמשך אגוניסט טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 600 ננומטר (כלומר. 6 פעמים הריכוז הסופי הרצוי של 100 ננומטר) פתרון של quinpirole בOpti-ממ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 μl / טוב של פתרון quinpirole ננומטר 600 לצד השני של הבארות בעזרת פיפטה רבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס חממת humidified עם 5% CO 2 למשך 2 שעות. </li></ol> 6. גירוי של cAMP צבירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה 2 שעות, להכין stimulatiעל פתרון בOpti-ממ. פתרון הגירוי מורכב מ40 forskolin מיקרומטר, 2 מיקרומטר 3-isobutyl-1-methyxanthine (IBMX), ו -4 spiperone מיקרומטר (כל הריכוזים בשלב 6 הם 4x הריכוז הסופי הרצוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת μl 5 / היטב פתרון הגירוי לצד השני של הבארות בעזרת פיפטה רבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר, ודגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. </li></ol> 7. מרווה והערכת cAMP הצבירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצור של cAMP בתאים נמדד באמצעות 2 הערכה הדינמית cAMP על פי הוראות יצרן. בקצרה, מחדש אנטי cAMP-cryptate וcAMP-D2 במים מזוקקים. להקפיא aliquots ב -20 ° C עבור אחסון לטווח קצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל aliquot אחד נגד cAMP-cryptate וaliquot אחד בנפרד cAMP-D2 במאגר תמוגה על פי הוראות היצרן כדי להפוך את הפתרונות עובדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">dd 10 μl / טוב של הפתרון עובד נגד cAMP-cryptate ו10 μl / טוב של הפתרון עובד cAMP-D2 לצלחת 384 גם בעזרת פיפטה רבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב100 XG במשך 15 שניות בטמפרטורת חדר, ודגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הצלחת בקורא צלחת פלואורסצנטי (הגדרת קנה מידה אוטומטית לרגישות) באמצעות עירור של 337 ננומטר, ולמדוד את הפליטות ב620 ננומטר ו665 ננומטר למייצר הוראות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ניתוח ratiometric להעריך עקומת סטנדרט cAMP למייצרת הוראות. שימוש בערכים שהתקבלו, להסיק את הצטברות cAMP המוערכת בבארות הבדיקה באמצעות תוכנה לניתוח נתונים. </li></ol>

<ol>
	<li>Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+of+adenylate+cyclase+accounts+for+narcotic+dependence+and+tolerance.">Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).</li><li>Watts, V. J., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitization+of+adenylate+cyclase+by+Galpha(i/o)-coupled+receptors.">Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors.</a> Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).</li><li>Christie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+neuroadaptations+to+chronic+opioids:+tolerance,+withdrawal+and+addiction.">Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction.</a> Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).</li><li>Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+AGS3+during+morphine+withdrawal+promotes+cAMP+superactivation+via+adenylyl+cyclase+5+and+7+in+rat+nucleus+accumbens/striatal+neurons.">Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons.</a> Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).</li><li>Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=m-Opioid+receptor+desensitization+by+&#946;-arrestin-2+determines+morphine+tolerance+but+not+dependence.">m-Opioid receptor desensitization by &#946;-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence.</a> Nature. 408, 720-723 (2000).</li><li>Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+long-term+plasticity+underlying+addiction.">Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction.</a> Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).</li><li>Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opiate-induced+adenylyl+cyclase+superactivation+is+isozyme-specific.">Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific.</a> J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).</li><li>Sadana, R., Dessauer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+for+G+protein-regulated+adenylyl+cyclase+isoforms:+insights+from+knockout+and+overexpression+studies.">Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies.</a> Neurosignals. 17, 5-22 (2009).</li><li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenylyl+cyclase+type+5+(AC5)+is+an+essential+mediator+of+morphine+action.">Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).</li><li>Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenylyl+cyclase+isoforms+as+novel+therapeutic+targets:+an+exciting+example+of+excitotoxicity+neuroprotection.">Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection.</a> Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).</li><li>Beazely, M. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+properties+of+adenylate+cyclases+type+5+and+6:+A+progress+report.">Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report.</a> Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).</li><li>Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J., Siehler, S., Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10.">Chapter 10.</a> Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. 10, 189-217 (2010).</li><li>Lin, Y., Smrcka, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+molecular+recognition+by+G+protein+betagamma+subunits+on+the+path+to+pharmacological+targeting.">Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting.</a> Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).</li><li>Cumbay, M. G., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+sensitization+of+recombinant+adenylate+cyclases+by+activation+of+D2+dopamine+receptors.">Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).</li><li>Watts, V. J., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitization+of+endogenous+and+recombinant+adenylate+cyclase+by+activation+of+D2+dopamine+receptors.">Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors.</a> Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).</li><li>Nevo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adenylyl+cyclase+isozymes+on+acute+and+chronic+activation+of+inhibitory+receptors.">Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors.</a> Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).</li><li>Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+activation+of+the+m-opioid+receptor+with+the+endogenous+ligand+endomorphin+differentially+regulates+adenylyl+cyclase+isozymes.">Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes.</a> Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).</li><li>Beazely, M. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+a+novel+PKC+isoform+synergistically+enhances+D2L+dopamine+receptor-mediated+sensitization+of+adenylate+cyclase+type+6.">Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6.</a> Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).</li><li>Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+molecular+tools+to+dissect+the+role+of+Gs+in+sensitization+of+AC1.">Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1.</a> Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).</li><li>Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D2+receptor-induced+heterologous+sensitization+of+adenylyl+cyclase+requires+Gas:+Characterization+of+Gas-insensitive+mutants+of+adenylyl+cyclase+V.">Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V.</a> Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).</li><li>Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D(2)+Receptor-Mediated+Heterologous+Sensitization+of+AC5+Requires+Signalosome+Assembly.">Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly.</a> J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).</li><li>Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+sensitization+of+adenylate+cyclase+is+protein+kinase+A-dependent+in+Cath.a+differentiated+(CAD)-D2L+cells.">Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells.</a> J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+adenylyl+cyclase+inhibitor+for+treating+neuropathic+and+inflammatory+pain.">Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain.</a> Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).</li><li>Nordstedt, C., Fredholm, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modification+of+a+protein-binding+method+for+rapid+quantification+of+cAMP+in+cell-culture+supernatants+and+body+fluid.">A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid.</a> Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).</li><li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+morphine-induced+cAMP+overshoot:+a+cell-based+assay+model+in+a+high-throughput+format.">Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).</li><li>Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+cells+facilitate+cell-based+drug+discovery.">Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).</li><li>Varga, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adenylyl+cyclase+isoenzymes+in+CHO+and+B82+cells.">Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells.</a> Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).</li><li>Masri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+of+dopamine+D2+receptor/beta-arrestin+2+interaction+is+a+common+property+of+clinically+effective+antipsychotics.">Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).</li><li>Thaker, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+glioblastoma+multiforme+through+short+interfering+RNA+screening:+a+paradigm+for+therapeutic+development.">Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development.</a> Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).</li><li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells:+a+user's+guide.">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Ejendal, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+antagonists+of+tick+dopamine+receptors+via+chemical+library+screening+and+comparative+pharmacological+analyses.">Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).</li><li>Meyer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"genome-to-lead"+approach+for+insecticide+discovery:+pharmacological+characterization+and+screening+of+Aedes+aegypti+D(1)-like+dopamine+receptors.">A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors.</a> PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).</li><li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology.">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).</li><li>Fan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetically+encoded+biosensors+using+firefly+luciferase.">Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase.</a> ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).</li><li>Jiang, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+cAMP+BRET+sensor+to+characterize+a+novel+regulation+of+cAMP+by+the+sphingosine+1-phosphate/G13+pathway.">Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway.</a> J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

במאמץ להקל על מחקרים של רגישות Heterologous, יש לנו בהרחבה שונו השיטה הקודמת שלנו להשגת יעילה &quot;תערובת ולקרוא&quot; פורמט זה הוא amendable להקרנת תפוקה גבוהה ומנגנון של בדיקת פעולה. השינויים העיקריים לפרוטוקול שלנו ניתן לסכם באופן הבא: 1) השימוש בתאי cryopreserved כמו חומרים כימיים &quot;...

Cyclase adenylyl אדפטיבית (AC) איתות תגובה המכונה Heterologous או סופר רגישות התגלה לראשונה במעבדתו של חתן פרס נובל, ד&quot;ר מרשל נירנברג. ד&quot;ר נירנברג הציעה שנצפתה היענות AC עלתה בעקבות הפעלת קולטן כרונית δ אופיואידים הייתה מנגנון המעורב בסובלנות אופיום ותלות 1. בנוסף להפעלת קולטן כרונית δ אופיואידים, תגובת neuroadaptive זה של איתות AC מתרחשת גם לאחר הפעלה מתמשכת של כמה קולטנים אחרים Gαi / מצמידים o 2. יש לציין, רבים של קולטנים אלה קשורים לכאב, הפרעות נוירופסיכיאטריות ונוירולוגיות, וכוללים אופיואידים μ / κ, D דופמין 2/4, 5HT 1A, ו-M 2/4 קולטנים מוסקריניים 2. בנוסף לממצאיו של ד&quot;ר נירנברג, גוף גדול של ראיות המקשר רגישות של איתות AC להפעלת קולט אופיואידים כרונית שני <eמ&gt; במבחנה in vivo 3-7. רגישות של AC גם הייתה קשורה עם מגוון רחב של מחלות מעורבים קולטני דופאמין כמו 2 D כולל סכיזופרניה ומחלת פרקינסון (לסקירה ראתה התייחסות 2). למרות החשיבות הפוטנציאלית של רגישות, המנגנון המדויק (ים) הקשורים / הפעלה מתמשכת Gαi מצמידים o רצפטור שמוביל לעלייה בהיענות AC נשארה במידה רבה לא ידועה. מחקרים אלה מספקים רציונל לבחינת המנגנונים לרגישות של cyclase adenylyl כיעד הנוירוביולוגי חשוב. כמו כן, את הרלוונטיות הפיזיולוגיות של AC איתות 8 ואת החשיבות שisoforms AC הבודד להחזיק בתגובה מסתגלת זה צריכים גם להיות מוכר 2,9,10. בהקשר של המחקר שלנו, את התכונות הכלליות הקשורים לרגישות Heterologous של isoforms רקומביננטי של AC במקביל מאפיינים אלה described ללימוד isoforms אנדוגני של AC. באופן ספציפי, המחקרים קודמים מצאו כי ההפעלה של חלבוני Gαi / o ויחידות מהשנה שלאחר מכן שחרור / βγ התארגנות הן דרישות חשובות לרגישות הקולטן המושרית של כל isoforms AC. בנוסף, מספר מחקרים מצביעים על כך שהאיתות מקינאז החלבון ויחידות משנת Gβγ מעורבות ברגישות 2,11-13. מזגנים בודדים גם להציג דפוסי רגישות ייחודיים ומובחנים 12. לדוגמא, חשיפה מתמשכת של D 2 קולטנים לאגוניסטים קשורה לרגישות של AC1 וAC8 Ca 2 גירוי + / calmodulin 14,15, ואילו AC3 הקשור קשר הדוק לא רגיש 2. AC2, AC4, וAC7 קשור באופן הדוק, עם זאת, רק פעילות AC2 PKC מגורה היא רגישה וחסונה לאחר חשיפה ממושכת של D 2 קולטנים לאגוניסטים 7,14,16,17. בנוסף, AC5 וAC6 להראות מידה ניכרת של יתר מכירהרגישות ologous לגז וצבירת cAMP מגורה forskolin הבא הפעלה של D 2 קולטנים 14,18-20, אבל נראה שונים בדרישה שלהם לGβγ מקטע-AC קשרי גומלין ש21. למרות שרוב המחקרים של רגישות AC השתמשו קווי מודל תא (לדוגמא תאי HEK293 להביע isoforms AC הבודד), נראה כי ממצאים אלה לתרגם למודלי תא עצביים מקומיים 4,22. לאחרונה, את ההשפעות של מעכבי איזופורם AC סלקטיבית מולקולה קטנות שזוהו בתאי HEK293 להביע isoforms AC יכולות גם להיות מתורגמות למחקרים התנהגותיים in vivo 23. חוסר מנגנון מולקולרי שזוהה ולרגישות Heterologous כנראה משקף את המורכבות של התגובה המסתגלת, כמו גם מאפייני רגולציה הייחודיים של הפרט AC isoforms 12. להתיר מורכבות כזה מסתבך עוד יותר על ידי השימוש במתודולוגיה לא מסורבליםכובע הגביל חוקרים אקדמיים מהעסקת גישות משוחדת. לדוגמא, המחקרים מכניסטית הקודמים שלנו כללו שימוש במודלים סלולריים ברציפות תרבותי באמצעות 24 - ופורמט תרבית רקמת 48 היטב 15. תאים בתרבית גדלו בדרך כלל עבור 48 שעות ולאחר מכן נתון לטיפול אגוניסט תרופה (2-18 hr) ואחריו סדרה של שוטף התא וincubations (איור 1). פרוטוקולי הצטברות cAMP הספציפי AC-איזופורם היו אז מועסקים ואחרי מדידה של הצטברות cAMP באמצעות [3 H] מפרך וזמן רב cAMP מחייב מתודולוגיה 15,24. המשך מהתחלה ועד סוף לכל assay נדרש בדרך כלל כולל של ארבעה עד חמישה ימים מציפוי תא לניתוח נתונים (איור 1). היישום של טכנולוגיות ואוטומציה חדשות הוביל לשיפורים ניכר ללימודי רגישות בסביבה התעשייתית ומרכז HTS. לדוגמא, קבוצה עובדת עם המרכז הלאומי לחמיםקאל ג&#39;נומיקס דיווח יומיים HTS הליך assay לזיהוי מעכבי מולקולה קטנים של μ רגישות מושרה אופיואידים הקולטן בפורמט 1,536 היטב 25. המאמר הנוכחי מתאר את המאמצים שלנו כדי לפתח assay HTS ללימודים של רגישות Heterologous תוך שימוש בטכנולוגיות שזמינות ברוב מוסדות מחקר האקדמיים. אסטרטגיה זו הושגה על ידי שילוב של השימוש בתאי cryopreserved ממודלי תא heterologously מבטא את קולטן דופמין D 2 בשילוב עם isoforms cyclase adenylyl רקומביננטי אנדוגני או אדם (CHO-D 2L או HEK-AC6 / D 2 ליטר). כדי לשפר את התפוקה שלנו, אנחנו מחדש assay שלנו 48 גם הרגישות (בערך&gt; 20 צעדים על 4-5 ימים) לחמישה שלבים assay יום אחד, בפורמט 384 גם שהיה למעשה &quot;לערבב ולקרוא&quot;. הפורמט החדש משתמש בקרינת זמן הומוגני זמינה מסחרי נפתרה assay (HTRF) כדי למדוד ACC cAMPumulation בתאים שלמים עם קורא צלחת מצב מרובה. Assay הוא איתן וניתן להקרנת מולקולה קטנה, ויכול להיות מיושם בצורה יעילה למסך למעכבים של רגישות Heterologous. בנוסף, אנו מספקים מידע שמאפשר השימוש של assay זה עם transfection ההפוך של siRNA להקרנת ספריית siRNA רחבה ממוקדת או הגנום עם שינוי קל בלבד לגישה הכללית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">CHO-K1-DRD2L cells</td>
			<td style="width:144px;">DiscoveRx</td>
			<td style="width:148px;">930579C2</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Ham&#8217;s F12 media</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">SH30026fs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">SH3007003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">G418</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:144px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">50-230-5556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Penicillin/ streptomycin</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:144px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:148px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">DMSO</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Cell dissociation buffer</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">13150016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">10010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Cryovials</td>
			<td style="width:144px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">976171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">TC treated 384 well plates</td>
			<td style="width:144px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:148px;">6007688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:205px;">HTRF cAMP Dynamic 2 kit</td>
			<td style="width:144px;">Cisbio Bioassays</td>
			<td style="width:148px;">62AM4PEB</td>
			<td style="width:199px;">http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Synergy 4</td>
			<td style="width:144px;">Biotek</td>
			<td style="width:148px;">H4MLFPTAD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Prism 6</td>
			<td style="width:144px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:148px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">(&#177;)Quinpirole</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">Q111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Spiperone</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">S7395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Clozapine</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">C6305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Haloperidol</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">H1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">S-(-)Sulpiride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">S112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:205px;">Lipofectamine2000 transfection reagent</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:148px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Water, DNase, RNase-free</td>
			<td style="width:144px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:148px;">821739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Gas siRNA</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">custom siRNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Non-targeting siRNA control</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">D-001206-14-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">siGlo Red</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">D-001630-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug-induced sensitization of adenylyl cyclase: assay streamlining and miniaturization for small molecule and sirna screening applications

רגישות של cyclase adenylyl איתות (AC) הייתה מעורבת במגוון רחב של הפרעות נוירופסיכיאטריות ונוירולוגיות, כולל שימוש בסמים ומחלת פרקינסון. הפעלה חריפה של / קולטנים צמודים o Gαi מעכבת את פעילות AC, ואילו הפעלה מתמשכת של תוצאות קולטנים אלה ברגישות Heterologous של AC ורמות מוגברות של cAMP התוך התאי. שמחקרים קודמים הוכיחו כי שיפור זה של היענות AC הוא ציין הן במבחנה in vivo לאחר ההפעלה הכרונית של מספר סוגים של קולטנים / צמוד o Gαi כולל D 2 דופאמין וμ קולטני אופיואידים. למרות רגישות Heterologous של AC דווחה לראשונה לפני כארבעה עשורים, המנגנון (ים) העומד בבסיס תופעה זו אינו ידוע ברוב. המחסור בנתונים מכניסטית ככל הנראה משקפים את המורכבות כרוכות בתגובה מסתגלת זה, טוען כי גישות nonbiased יכולים לסייע בזיהויing המסלולים המולקולריים מעורבים ברגישות Heterologous של AC. מחקרים קודמים מעורבים קינאז ואיתות Gbγ כחופפים מרכיבים המווסתים את רגישות Heterologous של AC. כדי לזהות מטרות חופפות וייחודיות נוספות הקשורות לרגישות של AC, הפיתוח והאימות של assay רגישות cAMP מדרגי נדרש לתפוקה גדולה יותר. גישות קודמות כדי ללמוד רגישות הן בדרך כלל מסורבלות מעורבת תחזוקה רציפה תא תרבות, כמו גם במתודולוגיה מורכבת למדידת צבירת cAMP שכוללת שלבי שטיפה מרובים. לכן, הפיתוח של assay מבוסס תאים חזק שיכול לשמש עבור הקרנת תפוקה גבוהה (HTS) בפורמט גם 384 יקל מחקרים עתידיים. שימוש בשני דגמי D 2 קולטן דופמין סלולריים (כלומר. CHO-D 2L וHEK-AC6 / D 2L), יש לנו להמיר assay שלנו 48 היטב הרגישות (&gt; 20 צעדים 4-5 ימים) ולחמש-sTEP, assay יום אחד בפורמט 384 גם. התבנית חדשה זו ניתנת להקרנת מולקולה קטנה, ואנו מראים כי עיצוב assay זה יכול גם לשמש בקלות עבור transfection ההפוך של siRNA בציפייה להקרנת ספריית siRNA ממוקד.

חלק א פיתוח assay רגישות גם Heterologous 384 לזיהוי מעכבי מולקולה קטנים תוך שימוש במודל סלולרי זמין באופן מסחרי. ללמוד רגישות Heterologous במודל תא, עשינו מספר השיפורים שאפשרו לנו לייעל את assay לפורמט &quot;לערבב ולקרוא&quot;. כמה מהשינויים המ...

Watch this Scientific Journal Video about Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications at JoVE.com

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

הפעלה מתמדת של תוצאות מעכבות G-חלבון בשילוב קולטנים ברגישות של איתות cyclase adenylyl. כדי לזהות את המסלולים מולקולריים החיוניים, גישות nonbiased נחוצות, עם זאת, אסטרטגיה זו מחייבת הפיתוח של assay רגישות cAMP מבוסס תאים ניתן להרחבה. בזאת, אנו מתארים assay רגישות למולקולה קטנה והקרנת siRNA.

רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות Assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת siRNA

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

drug-induced-sensitization-adenylyl-cyclase-assay-streamlining

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.6K Views.  Purdue University.  הפעלה מתמדת של תוצאות מעכבות G-חלבון בשילוב קולטנים ברגישות של איתות cyclase adenylyl. כדי לזהות את המסלולים מולקולריים החיוניים, גישות nonbiased נחוצות, עם זאת, אסטרטגיה זו מחייבת הפיתוח של assay רגישות cAMP מבוסס תאים ניתן להרחבה. בזאת, אנו מתארים assay רגיש?...

Video: Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

תא מבוססי סידן Assay עבור בינוני עד הקרנת תפוקה גבוהה של פונקציות TRP באמצעות ערוץ FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Wideband גלאי אופטיים של אולטראסאונד ליישומי הדמיה רפואית

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

הנקבובי הסיליקון microparticles למשלוח Therapeutics siRNA

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

מהיר וכמוני Fluorimetric שיטה להקרנת סמים מיקוד-חלבון מולקולה קטנה

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

המצאה של מכאני מתכוונן ויו מתכת פיגומים עבור יישומים ביו

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

אור בתיווך גיבוש דפוסים של הידרוג עבור יישומי תרבית תאים

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin exine capsules (SECs) are obtained when spores or pollen are processed so as to remove the internal sporoplasmic contents. The resulting hollow microcapsules exhibit a high degree of micromeritic uniformity and retain intricate microstructural features related to the particular plant species. Herein, we demonstrate a streamlined process for the production of SECs from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs. The current SEC isolation procedure has been recently optimized to significantly reduce the processing requirements which are conventionally used in SEC isolation, and to ensure the production of intact microcapsules. Natural L. clavatum spores are defatted with acetone, treated with phosphoric acid, and extensively washed to remove sporoplasmic contents. After acetone defatting, a single processing step using 85% phosphoric acid has been shown to remove all sporoplasmic contents. By limiting the acid processing time to 30 hr, it is possible to isolate clean SECs and avoid SEC fracturing, which has been shown to occur with prolonged processing time. Extensive washing with water, dilute acids, dilute bases, and solvents ensures that all sporoplasmic material and chemical residues are adequately removed. The vacuum loading technique is utilized to load a model protein (Bovine Serum Albumin) as a representative hydrophilic compound. Vacuum loading provides a simple technique to load various compounds without the need for harsh solvents or undesirable chemicals which are often required in other microencapsulation protocols. Based on these isolation and loading protocols, SECs provide a promising material for use in a diverse range of microencapsulation applications, such as, therapeutics, foods, cosmetics, and personal care products.

This protocol/manuscript describes a streamlined process for the production of sporopollenin exine capsules (SECs) from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs.

הפקת קפסולות צמחית עבור יישומי מיקרואנקפסולציה

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well as large-scale high-throughput screening (HTS) campaigns. Though laboratory automation has greatly increased the utility of microplates there remain instances where automation-based instrumentation is not feasible, cost-effective or compatible with microplate formatting needs. In these cases, microplates must be manually prepared. Problematic to manual microplate manipulations is that a number of difficulties can arise pertaining to the accurate tracking of sample operations, data record keeping and quality control (QC) inspection for well artifacts or formatting errors. As microplate well densities increase (i.e., 96-well, 384-well, 1536-well) the potential for introducing errors also drastically increases.&#160; Moreover, for small bench-top laboratory operations there exists a need to improve the ease and accuracy of sample handling in a cost-effective fashion. Herein, we describe a system that acts as a semi-automated pipetting guide referred to as the Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.). &#160;M.A.P.L.E. has multiple uses for supporting compound hit-picking and microplate preparation for assay development in high-throughput screening or laboratory benchtop operations, as well as QC/quality assurance (QA) diagnostic evaluation of microplate quality or visualizing well formatting errors.

Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.) is a computer-driven device that systematically illuminates microtiter wells to provide guidance for the manual preparation of microplates.&#160; M.A.P.L.E. improves the accuracy of microplate preparation while automating data recordkeeping. &#160;In addition, it can assist with examining microplate quality or aid in the detection of errors.&#160; &#160;

יישומים ללוחות תאורה בקוד פתוח מיקרופלייט

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various biological activities including cell proliferation, survival, migration and differentiation. Several aberrations in the FGFR signaling pathway, owing to mutations or gene amplification events, have been identified in various types of cancers. Hence, recent research has focused on developing strategies involving therapeutic targeting of FGFRs. Current FGFR inhibitors at various stages of pre-clinical and clinical development include either small molecule inhibitors of tyrosine kinases or monoclonal antibodies, with only a few peptide- based inhibitors in the pipeline. Here, we provide a protocol using phage display technology to screen small peptides as antagonists of FGFR2. Briefly, a library of phage-displayed peptides was incubated in a plate coated with FGFR2. Subsequently, unbound phage was washed off by TBST (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20), and bound phage was eluted with 0.2 M glycine-HCl buffer (pH 2.2). The eluted phage was further amplified and used as input for the next round of biopanning. Following three rounds of biopanning, the peptide sequences of individual phage clones were identified by DNA sequencing. Finally, the screened peptides were synthesized and analyzed for affinity and biological activity.

Herein, we present a detailed protocol for screening small peptides that bind to FGFR2 using a phage display peptide library. We further analyze the affinity of the selected peptides toward FGFR2 in vitro and its ability to suppress cell proliferation.

הקרנה וזיהוי של פפטידים קטנים פילוח הצמיחה פיברוהפיצוץ מקדם Receptor2 באמצעות ספריית Phage התצוגה פפטיד

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Rapid Fabrication of Custom Microfluidic Devices for Research and Educational Applications

Microfluidic devices allow for the manipulation of fluids, particles, cells, micro-sized organs or organisms in channels ranging from the nano to submillimeter scales. A rapid increase in the use of this technology in the biological sciences has prompted a need for methods that are accessible to a wide range of research groups. Current fabrication standards, such as PDMS bonding, require expensive and time consuming lithographic and bonding techniques. A viable alternative is the use of equipment and materials that are easily affordable, require minimal expertise and allow for the rapid iteration of designs. In this work we describe a protocol for designing and producing PET-laminates (PETLs), microfluidic devices that are inexpensive, easy to fabricate, and consume significantly less time to generate than other approaches to microfluidics technology. They consist of thermally bonded film sheets, in which channels and other features are defined using a craft cutter. PETLs solve field-specific technical challenges while dramatically reducing obstacles to adoption. This approach facilitates the accessibility of microfluidics devices in both research and educational settings, providing a reliable platform for new methods of inquiry.

Here we present a protocol to design and fabricate custom microfluidic devices with minimal financial and time investment. The aim is to facilitate the adoption of microfluidic technologies in biomedical research laboratories and educational settings.