著者は、方法論的なトレーニングや検定の指針としてリチャード·ジンクとトッドWiernickiを承認したいと思います。また、熟読し、編集上の提案のためにジョン·ポール·スペンスに感謝します。この作品は、リリー研究賞プログラム（LRAP）を通じて健康MH 060397、脳と行動研究財団、およびイーライリリー·アンド·カンパニーの国立研究所によってサポートされていました。

1。アッセイレディ細胞の増殖および凍結保存<ol><li> 1.0100μMのL-グルタミン、800μgの/μLG418、300μgの/μLハイグロ、100 U /μLを補ったハムF12培地さ15cm 2細胞培養ディッシュ上で培養したCHO-K1-DRD 2L（CHO-D 2L）は、細胞ペニシリン、100μg/ml/μlのストレプトマイシン、及び10％ウシ胎児血清（FBS）。 </li><li>細胞が90〜95％コンフルエントになるまで、5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃で細胞をインキュベートする。 10μlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄し、37℃で5分間、細胞解離緩衝液3μlのを添加することにより細胞を採取培養液12μlのを使用して細胞を再懸濁し、トリパンブルー排除を用いて細胞を数える。 </li><li>室温で5分間、500×gで細胞懸濁液を遠心分離する。上清を吸引除去し、凍結培地を5μl（10％ジメチルスルホキシド、90％Fで細胞ペレットを再懸濁BS）。所望の細胞濃度（ 例えば、1〜20×10 6細胞/μl）を達成するために、細胞懸濁液を希釈する。 </li><li>各クライオバイアルに細胞溶液の一定量1.0μL。 -80℃で一晩細胞凍結容器中の凍結バイアルをインキュベートします。長期保存のために液体窒素タンクに凍結バイアルを転送します。 </li></ol> 2。アッセイレディ細胞（およびリバーストランスフェクションオプション）メッキ<ol><li>急速に37℃の水浴中で細胞の凍結クライオバイアルを解凍する。細胞を解凍したら、のOpti-MEM 9μLを含む15μlのコニカルチューブに細胞を移し、チューブ3-5X転倒混和。 </li><li>室温で5分間、500×gで細胞を遠心分離する。上清を吸引し、1μLのOpti-MEM中で細胞を再懸濁。 </li><li>細胞生存率を決定し、必要に応じて（ 例えば、図3×10 5細胞/μlの濃度）中で生存細胞を希釈し、トリパンブルー排除を用いて細胞を数えるのOpti-MEM。組織培養中の細胞のプレートに10μl/ウェルのマルチチャンネルピペットを用いて、384ウェルプレートを処理した。 </li><li> （勧告を製造していますによると - セクション7を参照）細胞によるcAMP産生を推定するための標準曲線を作成するのOpti-MEM中のcAMPの連続希釈液を作る。プレートにcAMP標準の10μL/ウェルを追加します（注）。単一の標準曲線は、アッセイプレートの1に別のプレートやブランクウェルに調製することができる。 </li><li>室温で15秒間、100×gでプレートを遠心分離し、1時間、5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートする。 </li></ol> 3。 * siRNAトランスフェクション·オプションを逆転このセクションでは、図3にはオプションと関連しています。 <ol><li> RNaseフリーのddH 2 O（ 例えば 0.4ピコモル/μL）でのsiRNAの溶液を調製する。 384ウェルプレートの各ウェルに5μLを追加し、15 SEの100×gで遠心プレート室温でC。 </li><li> 0.006倍のOpti-MEM中でリポフェクタミン2000を希釈（ 例えばのOpti-MEM千μlにリポフェクタミン2000の6μLを加える）、そして上下にピペッティングにより混和する。 </li><li>室温で5分間、リポフェクタミン2000/Opti-MEM溶液をインキュベートする。すでにsiRNAのが含まれている384ウェルプレートの各ウェルに希釈したリポフェクタミン2000/Opti-MEM溶液5μlを加える。室温で15秒間100×gでプレートを遠心分離する。 </li><li>室温で30分間プレートをインキュベートする。 </li><li>上記のようなプレートアッセイ準備細胞（第2節）。室温で15秒間100×gでプレートを遠心分離する。 </li><li> （説明を参照してください）ノックダウン標的遺伝子のために決定された48〜96時間、37℃（5％CO 2）の加湿インキュベーターにアッセイプレートを返します。 </li></ol> 4。低分子スクリーニング<ol><li>オプティに目的の薬物（ 例えば、小分子阻害剤）を希釈する-MEM所望の最終濃度が6倍にする。連続希釈は、手持ちピペット又は液体ハンドリングステーションを使用して完成させることができる。 </li><li>試験化合物の2.5μL/ウェルを追加したり、マルチチャンネルピ ​​ペットを用いて、ウェルの側に車両（ 例えば 、DMSO）を含有する緩衝液。 </li><li>遠心分離機、室温で15秒間、100×gでプレート（インキュベーションはオプションです）。 </li></ol> 5。永続的なアゴニスト治療<ol><li>のOpti-MEM中キンピロールの600 nMの（ すなわち 。100 nMでの6回の所望の最終濃度）溶液を調製する。 </li><li> 2.5μL/ウェルのマルチチャンネルピペットを用いて、ウェルの側に600 nMのキンピロールソリューションを追加します。 </li><li>室温で15秒間、100×gでプレートを遠心分離し、2時間、5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートする。 </li></ol> 6。のcAMP蓄積の刺激<ol><li> 2時間のインキュベーションの間、stimulatiを準備のOpti-MEM内の溶液に。刺激溶液を、40μMのフォルスコリン、2μMの3 - イソブチル-1 - methyxanthine（IBMX）、及び4μMのスピペロン（ステップ6における全ての濃度は、所望の最終濃度を4倍している）から構成されている。 </li><li> 5μL/ウェルのマルチチャンネルピペットを用いて、ウェルの側面に刺激溶液を加える。 </li><li>室温で15秒間、100×gでプレートを遠心分離し、1時間室温でインキュベートする。 </li></ol> 7。 cAMPの蓄積の消光と評価<ol><li>細胞によるcAMPの産生を、製造業者の説明書に従ってcAMPのダイナミック2キットを用いて測定される。簡潔には、蒸留水中の抗cAMP-クリプテートおよびcAMP-d2とを再構成する。短期保存のために-20℃で一定分量を凍結する。 </li><li>作業溶液を作るために製造業者の指示に従って溶解緩衝液中で別々に抗cAMP-クリプテートおよびcAMP-D2の一方のアリコートつのアリコートを希釈する。 </li><li> ADD抗cAMP-クリプ作業溶液および10μL/ウェルのマルチチャンネルピペットを用いて、384ウェルプレートにcAMPの-D2の作業溶液の10μlの/ウェル。 </li><li>室温で15秒間、100×gでプレートを遠心分離し、1時間室温でインキュベートする。 </li><li> 337 nmの励起を用いた蛍光プレートリーダー（感度の自動スケール設定）でプレートを読んで、あたりの620 nmおよび665 nmでの排出量を測定する指示を製造しています。 </li><li>指示を製造してあたりのcAMP標準曲線を評価するためのレシオメトリック分析を適用します。得られた値を用いて、データ解析ソフトウェアを用いて、試験ウェル中の推定されたcAMP蓄積を推定する。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

異種感作の研究を促進する努力において、我々は、我々の以前の広範囲に合理化された方法の達成修飾されている「ミックスを読み「ハイスループットスクリーニングと試験作用機序に修正可能なフォーマットである。次のように我々のプロトコルへの主要な変更は、要約することができる。1）」アッセイ対応」試薬として凍結保存した細胞の使用、384ウェルフォーマットへのアッセイの2?...

異種または超感として知られている適応型アデニル酸シクラーゼ（AC）シグナル応答が最初にノーベル賞受賞者、博士マーシャルニーレンバーグの研究室で発見された。博士ニーレンバーグ、慢性δオピオイド受容体の活性化後に観察増加交流応答性はアヘン耐性および依存性1に関与する機構であったことを提案した。慢性δオピオイド受容体の活性化に加えて、交流信号伝達のこの神経適応応答は、他のいくつかののGαi/ O共役受容体2の持続的な活性化に続いて発生します。注目すべきことに、これらの受容体の多くは、痛み、神経精神障害および神経障害に関連する、μ/κオピオイド、D 2月4日 、ドーパミン、5HT 1AおよびM 2/4ムスカリン受容体2が含まれています。博士ニーレンバーグの調査結果に加えて、多くの証拠は、両方の慢性オピオイド受容体の活性化にACシグナリングの感作を結ぶ存在<ein vitroおよびin vivo 3-7 の M&gt;。 ACの感作はまた、（総説については参考文献2を参照）、統合失調症およびパーキンソン病を含むD 2様ドーパミン受容体が関与する様々な疾患と関連している。感作の潜在的な重要性にもかかわらず、正確なメカニズムは、ACの応答性が大幅に未知のまま増加につながる持続的なのGαi/ O共役受容体の活性化に関連する。 これらの研究は、重要な神経生物学的ターゲットとしてアデニル酸シクラーゼの感作のためのメカニズムを調べるための理論的根拠を提供する。同様に、個々のACアイソフォームは、この適応応答で開催8シグナリング交流の生理的関連性と重要性も2,9,10を認識すべきである。我々の研究の文脈において、ACの組換えアイソフォームの異種感作に関連する一般的な特徴は、それらの特性をパラレルデ交流の内因性のアイソフォームを研究するためcribed。具体的には、これまでの研究では、Gαiを/ Oタンパク質および後続のリリース/再配置βγサブユニットの活性化は、すべてのACアイソフォームの受容体誘起感のために重要な要件であることを発見した。さらに、いくつかの研究は、タンパク質キナーゼおよびGβγサブユニットからの信号を感作2,11-13に関与していることを示唆している。個々のACSでは、ユニークで明確な感パターン12が表示されます。密接に関連AC3を2増感されていないのに対し、例えば、アゴニストに対するD 2受容体の持続的な露出は、Ca 2 +の/カルモジュリン刺激14,15にAC1及びAC8の感作に関連している。 AC2、AC4、およびAC7は密接に関係しているが、しかし、唯一のPKC-刺激されたAC2活性は堅牢にアゴニスト7,14,16,17にD 2受容体の長期暴露後の増感されている。さらに、AC5およびAC6はheterの著しい度合いを示しているologous D 2受容体14,18-20の活性化に続いてガスとフォルスコリン刺激cAMP蓄積への感作が、Gβγサブユニット-交流の相互作用21のために彼らの要件が異なっているように見える。 AC感作のほとんどの研究は、モデル細胞株（ 例えば、HEK293細胞は、個々のACアイソフォームを発現する）を使用したが、これらの知見は、天然の神経細胞モデル4,22に変換するようである。より最近では、ACアイソフォームを発現するHEK293細胞において同定されたACアイソフォーム選択的小分子阻害剤の効果はまた、 インビボ行動研究23に変換することができる。 異種感作のために特定の分子メカニズムの欠如はおそらく適応応答の複雑さだけでなく、個々のAC 12アイソフォームのユニークな調節特性を反映している。このような複雑さの解明をさらに面倒な方法論tの使用により複雑である帽子は公平なアプローチを採用することから、学術研究者が限られている。そして48ウェル組織培養フォーマット15 -たとえば、私たちの前の機械論的研究では、24を使用して継続的に培養された細胞モデルの使用を含んだ。培養した細胞は通常、48時間増殖させた後、細胞の洗浄及びインキュベーションのシリーズ（ 図1）に続いて、アゴニスト薬物治療（2月18日時間）にかけた。 ACアイソフォーム特異的cAMP蓄積プロトコルが次に方法論15,24を結合面倒で時間がかかる[3 H] cAMPを用いたcAMP蓄積を測定し使用した。各アッセイのために最初から最後までの期間は、通常、細胞播種からデータ分析（ 図1）に四から五日間の合計を必要とした。新しい技術や自動化の適用は産業およびHTSセンターの設定で感作性試験のためにマークの強化につながっている。たとえば、グループはケミコンのためのナショナルセンターでの作業校正ゲノミクスは、2日は1,536ウェルフォーマット25にμオピオイド受容体誘発される感作の小分子阻害剤を同定するためのアッセイ方法をHTS報告した。 本稿では、ほとんどの学術研究機関で利用できる技術を使用して、異種感の研究のためのHTSアッセイを開発するための取り組みを説明します。この戦略は、異種内因性または個々の組換えアデニリルシクラーゼアイソフォーム（CHO-D 2L又はHEK-AC6 / D 2 L）との組み合わせでD 2ドーパミン受容体を発現する細胞モデルからの凍結保存細胞の使用を組み込むことによって達成された。私たちのスループットを向上させるために、我々は基本的に「ミックス読み」だった384ウェルフォーマットで5段階の、一日アッセイに私達の48ウェル感アッセイ（4-5日間の約 &gt; 20ステップ）を再設計。新しいフォーマットは、cAMPのACCを測定するために、市販の均一時間分解蛍光（HTRF）アッセイを使用していますマルチモードプレートリーダーを用いて無傷の細胞内umulation。アッセイは、堅牢で、小分子のスクリーニングに適している、そして効果的に異種感作の阻害剤をスクリーニングするために適用することができる。加えて、我々は一般的なアプローチへのわずかな修正を加えてターゲットまたは全ゲノムのsiRNAライブラリースクリーニングのためのsiRNAのリバーストランスフェクションで、このアッセイを使用することを可能にするデータを提供する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">CHO-K1-DRD2L cells</td>
			<td style="width:144px;">DiscoveRx</td>
			<td style="width:148px;">930579C2</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Ham&#8217;s F12 media</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">SH30026fs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">SH3007003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">G418</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:144px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">50-230-5556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Penicillin/ streptomycin</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:144px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:148px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">DMSO</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Cell dissociation buffer</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">13150016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">10010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Cryovials</td>
			<td style="width:144px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">976171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">TC treated 384 well plates</td>
			<td style="width:144px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:148px;">6007688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:205px;">HTRF cAMP Dynamic 2 kit</td>
			<td style="width:144px;">Cisbio Bioassays</td>
			<td style="width:148px;">62AM4PEB</td>
			<td style="width:199px;">http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Synergy 4</td>
			<td style="width:144px;">Biotek</td>
			<td style="width:148px;">H4MLFPTAD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Prism 6</td>
			<td style="width:144px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:148px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">(&#177;)Quinpirole</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">Q111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Spiperone</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">S7395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Clozapine</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">C6305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Haloperidol</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">H1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">S-(-)Sulpiride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">S112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:205px;">Lipofectamine2000 transfection reagent</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:148px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Water, DNase, RNase-free</td>
			<td style="width:144px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:148px;">821739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Gas siRNA</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">custom siRNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Non-targeting siRNA control</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">D-001206-14-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">siGlo Red</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">D-001630-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug-induced sensitization of adenylyl cyclase: assay streamlining and miniaturization for small molecule and sirna screening applications

アデニル酸シクラーゼ（AC）シグナル伝達の感作は、薬物乱用やパーキンソン病などの神経精神や神経疾患の様々に関与している。のGαi/ o-ジ連結型受容体の急性の活性化は、AC活性を阻害する、ACの異種感作におけるこれらの受容体の持続的活性化および細胞内cAMPのレベルの増加に対し。以前の研究は、AC応答のこの増強は、D 2ドーパミンなどのオピオイド受容体μのGαi/ oの連結型受容体のいくつかのタイプの慢性的活性化に続いて、インビトロおよびインビボの両方で観察されることを実証した。交流の異種感作が最初に4年前に報告されたが、この現象の根底にあるメカニズムはほとんどわかっていない。機械論的データの欠如は、おそらく偏りのないアプローチが識別するのを補助できることを示唆し、この適応応答に関与複雑さを反映している交流の異種感作に関与する分子経路をING。これまでの研究では、交流の異種感を調整するコンポーネントの重複などのキナーゼとGbγシグナリングを示唆されている。交流の感作に関連したユニークで、追加の重複標的を同定するために、拡張性のcAMPの感作アッセイの開発と検証がより大きなスループットが必要になります。感作を研究する従来のアプローチは、連続的な細胞培養維持だけでなく、複数の洗浄工程を伴うcAMP蓄積を測定するための複雑な方法論を含む一般扱いにくい。これにより、384ウェルフォーマットでハイスループットスクリーニング（HTS）のために使用することができる強固な細胞ベースのアッセイの開発は、将来の研究を容易にするであろう。 2、D 2ドーパミン受容細胞モデル（ すなわち 。CHO-D 2LおよびHEK-AC6 / D 2L）を使用して、我々は5-Sに私達の48ウェル感アッセイ（&gt; 20ステップ4〜5日間）に変換しているTEP、384ウェルフォーマットにおける単一日間のアッセイ。この新しいフォーマットは、小分子のスクリーニングに適している、と我々は、このアッセイの設計も容易に標的とするsiRNAライブラリースクリーニングを予想してsiRNAのリバーストランスフェクションのために使用することができることを実証している。

パートI.市販の細胞モデルを用いた小分子阻害剤を同定するための384ウェルの異種感作アッセイを開発する。 細胞モデルにおける異種感作を検討するために、私たちは &quot;混ぜて読む」フォーマットに分析を効率化することができました多くの改良を行いました。キー修飾のいくつかは、以下の強調表示され、議論においてより詳細に記載されている。最?...

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Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

アデニリルシクラーゼシグナル伝達の増感における抑制性Gタンパク質共役型の受容体の持続的活性化。本質的な分子経路を同定するために、偏りのないアプローチが必要であるが、この戦略は、スケーラブルな細胞ベースのcAMP増感アッセイの開発を必要とする。ここで、我々は、小分子およびsiRNAスクリーニングのために作アッセイを説明します。

アデニリルシクラーゼの薬物誘発性感作：アッセイは、小分子およびsiRNAスクリーニング用途のために合理化·小型化

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

drug-induced-sensitization-adenylyl-cyclase-assay-streamlining

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.6K ビュー.  Purdue University. アデニリルシクラーゼシグナル伝達の増感における抑制性Gタンパク質共役型の受容体の持続的活性化。本質的な分子経路を同定するために、偏りのないアプローチが必要であるが、この戦略は、スケーラブルな細胞ベースのcAMP増感アッセイの開発を必要とする。ここで、我々は、小分子およびsiRNAスクリーニングのために作アッセイを説明します。 

ビデオ: Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

FlexStation 3を用いてTRPチャネルの機能のハイスループットスクリーニングへの媒体のためのセルベースカルシウムアッセイ

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

生物工学

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

医療画像処理アプリケーションのための超音波の広帯域光検出器

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

細胞および組織メカノでのアプリケーションのためのプラットフォームをストレッチ小説

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

siRNAの治療を送達するための多孔質シリコンマイクロ粒子

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

タンパク質 - 小分子標的薬のスクリーニングのための迅速かつ定量的蛍光法

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we describe the preparation of polycrystalline silicon nanowire field-effect transistors (pSNWFETs) that serve as biosensing devices for biomarker detection. A protocol for chemical and biomolecular sensing by using pSNWFETs is presented. The pSNWFET device was demonstrated to be a promising transducer for real-time, label-free, and ultra-high-sensitivity biosensing applications. The source/drain channel conductivity of a pSNWFET is sensitive to changes in the environment around its silicon nanowire (SNW) surface. Thus, by immobilizing probes on the SNW surface, the pSNWFET can be used to detect various biotargets ranging from small molecules (dopamine) to macromolecules (DNA and proteins). Immobilizing a bioprobe on the SNW surface, which is a multistep procedure, is vital for determining the specificity of the biosensor. It is essential that every step of the immobilization procedure is correctly performed. We verified surface modifications by directly observing the shift in the electric properties of the pSNWFET following each modification step. Additionally, X-ray photoelectron spectroscopy was used to examine the surface composition following each modification. Finally, we demonstrated DNA sensing on the pSNWFET. This protocol provides step-by-step procedures for verifying bioprobe immobilization and subsequent DNA biosensing application.

We describe key steps for biosensing by using polysilicon nanowire field-effect transistors, including the preparation of the device and the immobilization and confirmation of a DNA molecular probe on the nanowire surface, as well as conditions for DNA sensing.

化学とバイオセンシングアプリケーション用のシリコンナノワイヤ電界効果トランジスタの作製

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin exine capsules (SECs) are obtained when spores or pollen are processed so as to remove the internal sporoplasmic contents. The resulting hollow microcapsules exhibit a high degree of micromeritic uniformity and retain intricate microstructural features related to the particular plant species. Herein, we demonstrate a streamlined process for the production of SECs from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs. The current SEC isolation procedure has been recently optimized to significantly reduce the processing requirements which are conventionally used in SEC isolation, and to ensure the production of intact microcapsules. Natural L. clavatum spores are defatted with acetone, treated with phosphoric acid, and extensively washed to remove sporoplasmic contents. After acetone defatting, a single processing step using 85% phosphoric acid has been shown to remove all sporoplasmic contents. By limiting the acid processing time to 30 hr, it is possible to isolate clean SECs and avoid SEC fracturing, which has been shown to occur with prolonged processing time. Extensive washing with water, dilute acids, dilute bases, and solvents ensures that all sporoplasmic material and chemical residues are adequately removed. The vacuum loading technique is utilized to load a model protein (Bovine Serum Albumin) as a representative hydrophilic compound. Vacuum loading provides a simple technique to load various compounds without the need for harsh solvents or undesirable chemicals which are often required in other microencapsulation protocols. Based on these isolation and loading protocols, SECs provide a promising material for use in a diverse range of microencapsulation applications, such as, therapeutics, foods, cosmetics, and personal care products.

This protocol/manuscript describes a streamlined process for the production of sporopollenin exine capsules (SECs) from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs.

マイクロカプセル化アプリケーション用の抽出プラントベースのカプセル

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular processes. There is a need for culturing and measuring systems that incorporate programmed illumination and stimulation of optogenetic systems. We present a protocol for building and using a continuous culturing apparatus to illuminate microbial cells with programmed doses of light, and automatically acquire and analyze images of cells in the effluent. The operation of this apparatus as a chemostat allows the growth rate and the cellular environment to be tightly controlled. The effluent of the continuous cell culture is regularly sampled and the cells are imaged by multi-channel microscopy. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses in the fluorescence intensity and cellular morphology of cells sampled from the culture effluent are measured over multiple days without user input. We demonstrate the utility of this culturing apparatus by dynamically inducing protein production in a strain of Saccharomyces cerevisiae engineered with an optogenetic system that activates transcription.

We designed a continuous culturing apparatus for use with optogenetic systems to illuminate cultures of microbes and regularly image cells in the effluent with an inverted microscope. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses to illumination can be measured over several days.

微生物光遺伝学アプリケーションのための自動照明、培養、およびサンプリングシステムの設計と実装

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well as large-scale high-throughput screening (HTS) campaigns. Though laboratory automation has greatly increased the utility of microplates there remain instances where automation-based instrumentation is not feasible, cost-effective or compatible with microplate formatting needs. In these cases, microplates must be manually prepared. Problematic to manual microplate manipulations is that a number of difficulties can arise pertaining to the accurate tracking of sample operations, data record keeping and quality control (QC) inspection for well artifacts or formatting errors. As microplate well densities increase (i.e., 96-well, 384-well, 1536-well) the potential for introducing errors also drastically increases.&#160; Moreover, for small bench-top laboratory operations there exists a need to improve the ease and accuracy of sample handling in a cost-effective fashion. Herein, we describe a system that acts as a semi-automated pipetting guide referred to as the Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.). &#160;M.A.P.L.E. has multiple uses for supporting compound hit-picking and microplate preparation for assay development in high-throughput screening or laboratory benchtop operations, as well as QC/quality assurance (QA) diagnostic evaluation of microplate quality or visualizing well formatting errors.

Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.) is a computer-driven device that systematically illuminates microtiter wells to provide guidance for the manual preparation of microplates.&#160; M.A.P.L.E. improves the accuracy of microplate preparation while automating data recordkeeping. &#160;In addition, it can assist with examining microplate quality or aid in the detection of errors.&#160; &#160;

オープンソースマイクロプレート互換照明パネルのアプリケーション

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various biological activities including cell proliferation, survival, migration and differentiation. Several aberrations in the FGFR signaling pathway, owing to mutations or gene amplification events, have been identified in various types of cancers. Hence, recent research has focused on developing strategies involving therapeutic targeting of FGFRs. Current FGFR inhibitors at various stages of pre-clinical and clinical development include either small molecule inhibitors of tyrosine kinases or monoclonal antibodies, with only a few peptide- based inhibitors in the pipeline. Here, we provide a protocol using phage display technology to screen small peptides as antagonists of FGFR2. Briefly, a library of phage-displayed peptides was incubated in a plate coated with FGFR2. Subsequently, unbound phage was washed off by TBST (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20), and bound phage was eluted with 0.2 M glycine-HCl buffer (pH 2.2). The eluted phage was further amplified and used as input for the next round of biopanning. Following three rounds of biopanning, the peptide sequences of individual phage clones were identified by DNA sequencing. Finally, the screened peptides were synthesized and analyzed for affinity and biological activity.

Herein, we present a detailed protocol for screening small peptides that bind to FGFR2 using a phage display peptide library. We further analyze the affinity of the selected peptides toward FGFR2 in vitro and its ability to suppress cell proliferation.

ファージ表示ペプチドライブラリーを用いて線維芽細胞増殖因子受容体2を標的とする小ペプチドのスクリーニングと同定

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...