저자는 방법론 교육 및 분석 지침 씨 리처드 아연 토드 Wiernicki을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한주의 읽기 및 편집 제안 요한 바오로 스펜스 감사합니다. 이 작품은 국민 건강 MH 060397, 두뇌와 행동 연구 재단과 일라이 릴리의 연구소와 릴리 연구 상 프로그램 (LRAP)를 통해 회사에 의해 지원되었다.

1. 분석 준비 세포의 확장과 냉동 보존 <ol><li> 문화 CHO-K1-DRD 2L 1.0 μM의 L-글루타민, 800 ㎍ / μL의 G418, 300 ㎍ / ㎕의 하이 그로 마이신, 100 U / μL에게 보충 햄의 F12 미디어에서 15cm 2 세포 배양 접시에 (CHO-D 2L) 세포 페니실린, 100 개 / μL 스트렙토 μg, 10 % 소 태아 혈청 (FBS). </li><li> 세포가 90 % -95 %의 합류 때까지 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 세포를 품어. 10 ㎕의 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)으로 세포를 세척하고 37 ℃에서 5 분 동안 세포 분리 버퍼의 3 μl를 추가하여 세포를 수확 배양액 12 μl를 사용하여 세포를 재현 탁하고 트리 판 블루 배제를 이용하여 세포를 센다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 500 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기. 뜨는을 대기음 및 동결 미디어의 5 μL (10 % 디메틸 설폭 사이드, 90 % F에있는 세포 펠렛을 resuspendBS). 원하는 세포 농도 (예 1-20 × 106 세포 / μL)을 달성하기 위해 세포 현탁액을 희석. </li><li> 각 cryovial에 셀 솔루션의 나누어지는 1.0 μL. -80 ° C 하룻밤에 셀 냉동 컨테이너에 cryovials을 품어. 장기 저장을위한 액체 N 2 탱크에 cryovials을 전송합니다. </li></ol> 2. 분석 준비 세포 (및 역 형질 옵션) 도금 <ol><li> 빠른 속도로 37 ° C의 물을 욕조에있는 세포의 고정 cryovial을 해동. 세포를 해동되면, 옵티-MEM 15 μl를 함유하는 15 ㎕의 원뿔 튜브에 세포를 전송하고, 튜브 (3)-5X를 반전시켜 혼합한다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 500 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는을 기음과 1 ㎕의 옵티-MEM에있는 세포를 재현 탁. </li><li> 세포 생존 능력을 결정하고 필요한 경우 (예. 3 × 105 세포 / μL 농도)에서 생존 세포를 희석하기 위하여 트리 판 블루 배제를 이용하여 세포를 세어OPTI-MEM. 플레이트는 조직 배양 세포의 10 μL / 잘은 멀티 채널 피펫을 사용하여 384 - 웰 플레이트를 처리. </li><li> (권장 사항 제조에 따라 - 7 항 참조) 세포에 의해 캠프 생산을 추정하는 표준 곡선을 생성하는 옵티-MEM 캠프의 시리얼 희석합니다. 접시에 10 μL / 잘 캠프 표준의 추가 참고 :. 단일 표준 곡선 분석 플레이트 중 하나에 별도의 판 또는 빈 우물에 제조 할 수있다. </li><li> 실온에서 15 초 동안 100 XG에서 접시를 원심 분리기, 1 시간 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 알을 품다. </li></ol> 3. * siRNA의 형질 옵션 반전 이 섹션에서는 그림 3을 선택하고 관련이 있습니다. <ol><li> RNA 분해 효소가없는 DDH 2 O (예를 들어 0.4 pmol의 / μL)에서의 siRNA의 솔루션을 준비합니다. 384 - 웰 플레이트의 각각의 웰에 5 μl를 추가, 15 SE 100 XG에서 접시를 원심 분리실온에서 C. </li><li> (예 : 옵티-MEM 1000 μL에 리포 펙 타민 2000 년 6 μl를 추가), 아래로 pipetting에 의해 혼합 0.006의 요인에 의해 옵티-MEM에서 리포 펙 타민 2000을 희석. </li><li> 실온에서 5 분 동안 리포 펙 타민 2000/Opti-MEM 용액을 배양한다. 이미의 siRNA를 포함 384 - 웰 플레이트의 각각의 웰에 희석 리포 펙 타민 2000/Opti-MEM 솔루션의 5 μl를 추가합니다. 실온에서 15 초 동안 100 XG에서 접시를 원심 분리기. </li><li> 실온에서 30 분 동안 플레이트를 배양한다. </li><li> (2 절) 전술 한 바와 같이 플레이트 분석 준비 세포. 실온에서 15 초 동안 100 XG에서 접시를 원심 분리기. </li><li> (토론 참조) 노크 타겟 유전자에 대한 결정에 따라 48 ~ 96 시간 동안 37 ° C (5 % CO 2)에 가습 인큐베이터 분석 플레이트를 돌려줍니다. </li></ol> 4. 작은 분자 스크리닝 <ol><li> 옵티에 관심있는 약물 (예. 작은 분자 억제제)를 희석-MEM 원하는 최종 농도의 6 배. 시리얼 희석 휴대용 피펫 또는 액체 핸들링 스테이션을 이용하여 완료 될 수있다. </li><li> 시험 화합물을 2.5 μL / 웰을 추가 또는 멀티 채널 피펫을 사용하여 웰의 측면에, 차량 (예 DMSO)을 함유하는 버퍼. </li><li> 실내 온도 (배양는 선택 사항입니다)에서 15 초 동안 100 XG에서 접시를 원심 분리기. </li></ol> 5. 영구 작용제 치료 <ol><li> 600 nm의 옵티-MEM에서 quinpirole 용액 (100 ㎚의 예. 6 번 원하는 최종 농도)를 준비합니다. </li><li> 2.5 μL / 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 우물의 측에 600 nm의 quinpirole 솔루션을 추가합니다. </li><li> 실온에서 15 초 동안 100 XG에서 접시를 원심 분리기, 2 시간 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 알을 품다. </li></ol> 6. 캠프 축적의 자극 <ol><li> 2 시간 배양시 stimulati 준비옵티-MEM 용액에. 자극 용액을 40 μM의 포스 콜린으로 구성되어 2 μM 3 - 이소 부틸 -1 - methyxanthine (IBMX) 및 4 μM 스피 페론의 (6 단계의 모든 농도는 원하는 최종 농도의 4 배된다). </li><li> 5 μL / 웰의 멀티 채널 피펫을 사용하여 웰 측으로 자극 용액을 추가. </li><li> 실온에서 15 초 동안 100 XG에 플레이트를 원심 분리하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다. </li></ol> 7. 캠프 축적의 냉각 및 추정 <ol><li> 세포에 의해 cAMP의 생산은 제조업체의 지시에 따라 cAMP를 동적 2 키트를 사용하여 측정된다. 간단히, 증류수 안티 캠프 - 크립 테이트 및 캠프-D2를 재구성. 단기 저장을 위해 -20 ° C에서 분주 동결. </li><li> 작업 솔루션을 만들 수있는 제조 업체의 지침에 따라 용해 버퍼에 방지 캠프 - 크립 테이트 중 하나가 나누어지는 개별적으로 캠프-D2 중 하나가 나누어지는을 희석. </li><li>체크인 yyyy 방지 캠프 - 크립 테이트 작업 용액 10 μL / 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 384 - 웰 플레이트에 캠프-D2의 작업 솔루션의 10 μL / 잘. </li><li> 실온에서 15 초 동안 100 XG에 플레이트를 원심 분리하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 337 ㎚의 여기를 사용하여 형광 플레이트 리더 (감도 자동 스케일 설정)의 판을 읽고마다 620 ㎚, 665 ㎚에서 배출량을 측정 지침을 제조하고 있습니다. </li><li> 당 평가하는 비율 계량 분석을 적용 캠프의 표준 곡선은 지침을 제조하고 있습니다. 결과 값을 사용하여 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 테스트 웰에서 추정 된 cAMP의 축적을 추정. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

이종 과민 반응의 연구를 촉진하기위한 노력의 일환으로, 우리는 광범위하게 우리의 이전 방법 효율적인 달성을 수정했습니다 &quot;혼합 및 읽기&quot;높은 처리량 검사 및 행동 검사의 메커니즘을 수정할 수있는입니다 형식. 다음과 같이 우리의 프로토콜에 큰 변형이 요약 될 수있다 : 1) &quot;분석 준비&quot;시약 등의 동결 보존 세포의 사용, 384 - 웰 포맷으로 분석의 2)의 소형화와, HTRF 둘레 3) 사용?...

이종 또는 초 과민성으로 알려진 응답 신호 적응 아데 닐 레이트 사이 클라 제 (AC)를 첫 번째 노벨상 수상자, 마샬 박사 Nirenberg의 연구실에서 발견되었다. 박사 Nirenberg 만성 δ 아편 수용체 활성화 다음 관찰 증가 AC 응답이 아편 내성과 의존성 1에 관여하는 메커니즘이라고 제안했다. 만성 δ 아편 수용체 활성화뿐만 아니라, AC 신호의이 neuroadaptive 응답은 또한 여러 가지 다른 Gαi / O를 결합 수용체 2의 지속적인 활성화 다음 발생합니다. 특히,이 수용체의 대부분은 통증, 신경 정신 및 신경 장애와 연관 μ / κ 아편, D 2 / 4 도파민, 5HT 1A 및 M 2 / 4 무스 카린 수용체 2를 포함한다. 박사 Nirenberg의 발견에 더하여, 기록하는 큰 몸체의 양쪽 만성 오피오이드 수용체 활성화에 AC 신호의 감작을 연결 존재 <e생체 외 및 생체 내 3-7 미터&gt;. AC의 감작도 (검토를 위해 참고 2 참조) 정신 분열증과 파킨슨 병 등의 D 2와 같은 도파민 수용체를 포함하는 다양한 질병과 관련이있다. 과민 반응의 잠재적 인 중요성에도 불구하고, 정확한 메커니즘 (들)은 AC 응답이 크게 알려지지 않은 남아 증가로 연결 지속 Gαi / O를 결합 수용체의 활성화와 관련. 이러한 연구는 중요한 신경 생물학적 대상으로 아데 닐 레이트 사이 클라 제의 민감성에 대한 메커니즘을 조사하기위한 이론적 근거를 제공한다. 마찬가지로, 개별 AC 아형이 적응 응답하여 홀드 8 시그널링 AC의 생리 학적 관련성 및 중요성도 2,9,10을 인식해야한다. 우리의 연구의 맥락에서, AC의 재조합 이소 형의 이종 감작과 관련된 일반적인 특징은 그 특성을 평행 데AC의 내생 이소을 공부 cribed. 특히, 이전의 연구는 Gαi / O 단백질 및 후속 릴리스 / 재 배열 βγ 서브 유닛의 활성화는 모든 AC 이소 형의 수용체에 의한 감작을위한 중요한 요구 사항입니다 것을 발견했습니다. 또한, 여러 연구는 단백질 키나아제 및 Gβγ 서브 유닛에서 신호가 과민성 2,11-13에 참여하는 것이 좋습니다. 개별 ACS는 또한 독특하고 뚜렷한 증감 패턴 (12)을 표시합니다. 밀접한 관련이 AC3는 2 민감하지 반면 예를 들어, 효능에 D 2 수용체의 지속적인 노출은, 칼슘 2 + / 칼 모듈 린의 자극 (14, 15)에 AC1 및 AC8의 과민 반응과 연관되어 있습니다. AC2, AC4, 및 AC7 밀접 단, PKC 자극 AC2 활동이 견고 7,14,16,17을 주작 동근하는 D 2 수용체의 장기간 노출 후 민감하고, 관련이 있습니다. 또한, AC5 및 AC6은 heter의 현저한 정도를 나타냅니다ologous D 2 수용체 14,18-20의 활성화에 다음과 같은 가스와 포스 콜린 자극 캠프 축적에 과민 반응하지만, Gβγ 서브 유닛 - AC에 대한 자신의 요구 사항에 차이가 나타납니다 (21)를 상호 작용. AC 감작의 대부분의 연구 모델 세포주 (예를 들어 HEK293 세포는 각각의 AC 이소 형을 표현하는)를 사용하고 있지만, 이러한 연구 결과는 원시 신경 세포 모델 4,22로 번역 것으로 보인다. 더 최근에, AC 아형을 발현하는 HEK293 세포에서 식별 AC 이소 선택적 소분자 억제제의 효과는 또한 생체 행동 연구 (23)로 변환 할 수있다. 이종 감작위한 식별 분자 메커니즘의 부족 가능성 적응 반응의 복잡성뿐만 아니라 AC가 12 이소 폼의 개별 고유 규제 특성을 반영한다. 그러한 복잡성을 이루는 것이 더욱 성가신 방법론 t의 사용에 의해 복잡모자 공정한 방법을 사용에서 학술 조사를 제한하고있다. 48 잘 조직 문화 형식 (15) - 예를 들어, 우리의 이전의 기계 론적 연구 (24)를 사용하여 지속적으로 배양 세포 모델을 사용하고있었습니다. 배양 된 세포는 일반적으로 48 시간 동안 성장하고 세포 세척 및 배양 일련의 (그림 1) 다음에 효능 약물 치료 (2-18 시간)을 실시 하였다. AC-이소 특정 캠프 축적 프로토콜 캠프 방법론 15,24 바인딩 노동력과 시간이 소요 [3 H]를 사용하여 캠프 축적 측정한다 사용 후했다. 각각의 분석을 위해 처음부터 끝까지 지속 기간은 일반적으로 세포 도금의 데이터 분석 (그림 1)에 4-5일 총이 필요합니다. 새로운 기술과 자동화의 응용 프로그램은 산업 및 HTS 센터 설정에 감작 연구에 표시된 향상되었다. 예를 들어, 케미을위한 국립 센터와 협력 그룹칼 유전체학은 2 하루 1,536 잘 형식 25 μ 오피오이드 수용체에 의한 감작의 작은 분자 억제제를 식별하기위한 분석 절차를 HTS 보도했다. 본 기사는 대부분의 학술 연구 기관에서 사용할 수있는 기술을 사용하여 이종 과민 반응의 연구를위한 HTS 분석을 개발하는 우리의 노력을 설명합니다. 이 전략은 heterologously 내인성 또는 개별 재조합 아데 닐릴 시클 라제 이소 폼 (CHO-D 2L 또는 HEK-AC6 / D 2 L)와 조합 D 2 도파민 수용체를 발현하는 세포 모델에서 냉동 보관 세포의 사용을 통합함으로써 달성되었다. 우리의 처리량을 개선하기 위해, 우리는 기본적으로 &quot;혼합 읽기&quot;이었다 384 - 웰 형식의 5 단계, 하루의 분석에 우리의 48 개 감작 분석 (4-5 일 동안 ca.&gt; 20 단계)를 재 설계. 새로운 형식은 캠프 ACC를 측정하기 위해 시중에서 균일 한 시간 해결 형광 (HTRF) 분석을 사용하여멀티 모드 플레이트 리더와 손상 세포 umulation. 분석은 강력하고 작은 분자 검사 의무, 그리고 효과적으로 이종 과민 반응의 억제에 대한 화면으로 적용 할 수 있습니다. 또, 일반적인 방법으로 오직 사소한 수정을 가진 대상 또는 게놈 와이드 siRNA의 라이브러리 스크리닝 된 siRNA의 형질 감염과 역방향이 분석의 사용을 허용 데이터를 제공한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">CHO-K1-DRD2L cells</td>
			<td style="width:144px;">DiscoveRx</td>
			<td style="width:148px;">930579C2</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Ham&#8217;s F12 media</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">SH30026fs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">SH3007003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">G418</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:144px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">50-230-5556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Penicillin/ streptomycin</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:144px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:148px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">DMSO</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Cell dissociation buffer</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">13150016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">10010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Cryovials</td>
			<td style="width:144px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">976171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">TC treated 384 well plates</td>
			<td style="width:144px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:148px;">6007688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:205px;">HTRF cAMP Dynamic 2 kit</td>
			<td style="width:144px;">Cisbio Bioassays</td>
			<td style="width:148px;">62AM4PEB</td>
			<td style="width:199px;">http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Synergy 4</td>
			<td style="width:144px;">Biotek</td>
			<td style="width:148px;">H4MLFPTAD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Prism 6</td>
			<td style="width:144px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:148px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">(&#177;)Quinpirole</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">Q111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Spiperone</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">S7395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Clozapine</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">C6305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Haloperidol</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">H1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">S-(-)Sulpiride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">S112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:205px;">Lipofectamine2000 transfection reagent</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:148px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Water, DNase, RNase-free</td>
			<td style="width:144px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:148px;">821739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Gas siRNA</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">custom siRNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Non-targeting siRNA control</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">D-001206-14-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">siGlo Red</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">D-001630-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug-induced sensitization of adenylyl cyclase: assay streamlining and miniaturization for small molecule and sirna screening applications

아데 닐 레이트 사이 클라 제 (AC) 신호의 과민 반응은 약물 남용 및 파킨슨 병 등의 신경 정신 및 신경 질환의 종류에 연루되어있다. Gαi / O를 결합 수용체의 급성 활성화는 AC의 활성을 억제, AC의 이종 감작에있는이 수용체 결과의 지속적인 활성화 및 세포 내 cAMP의 수준 증가하는 반면. 이전 연구는 AC의 응답 성이 향상이 D 2 도파민을 포함하고 오피오이드 수용체를 μ Gαi / O를 결합 수용체의 여러 종류의 만성 활성화 다음 시험 관내 및 생체 내에서 모두 관찰되는 것을 증명하고있다. AC의 이종 감작이 처음 사십 년 전에보고했지만,이 현상을 기초 메커니즘 (들)은 크게 알려지지 않은 남아있다. 기계적인 데이터의 부족은 아마도 nonbiased 방법 식별에 도움을 수 있다고 제안,이 적응 응답과 관련된 복잡성을 반영AC의 이종 과민 반응에 관여하는 분자 경로를 보내고. 이전 연구는 AC의 이종 과민 반응을 조절하는 구성 요소를 중복으로 키나제 및 Gbγ 신호를 내포하고 있습니다. AC의 과민 반응과 관련된 독특하고 추가 중복 표적을 확인하기 위해, 확장 성 캠프 민감성 분석의 개발 및 검증은 처리량이 필요합니다. 과민 반응을 연구하는 이전 방식은 연속적인 세포 배양 유지 보수뿐만 아니라 다수의 세척 단계를 포함 cAMP의 축적을 측정하는 복잡한 방법을 포함 일반적으로 복잡하다. 따라서, 384 웰 포맷에서 높은 처리량 스크리닝 (HTS)에 사용할 수있는 강력한 세포 기반 분석의 발전은 미래 연구를 용이하게한다. 두 개의 D 2 도파민 수용체 세포 모델 (예. CHO-D 2L와 HEK-AC6 / D 2L)를 사용하여, 우리는 다섯의 우리의 48 잘 증감 분석 (&gt; 20 단계 4 ~ 5 일) 변환 한TEP, 384 - 웰 형식으로 하루의 분석. 이 새로운 형식은 작은 분자 검사 의무이며, 우리는이 분석의 디자인도 쉽게 대상의 siRNA 라이브러리 심사의 기대에 siRNA를 역 형질 전환을 위해 사용될 수 있음을 보여줍니다.

시판 셀 모델을 사용하여 소분자 저해제를 식별하기 위해 384도 이종 감작 분석법 개발 부품 I.. 세포 모델에서 이종 과민 반응을 연구하기 위해, 우리는 &quot;혼합 읽기&quot;형식으로 분석을 간소화 할 수있었습니다 개선의 번호를했다. 키의 여러 변형이 아래 강조되고 논의에서 더욱 상세히 설명된다. 첫 번째 중요한 단계는 냉동 보관 된 세포 (26)에 지속?...

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Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

아데 닐릴 시클 라제 시그널링의 억제 감작있는 G 단백질 결합 수용체 결과의 지속적인 활성화. 필수 분자 경로를 식별하기 위해 nonbiased 접근이 필요하지만,이 전략은 확장 셀 기반 캠프 민감성 분석의 개발이 필요합니다. 여기서, 우리는 작은 분자 및 siRNA의 검사에 대한 민감성 분석을 설명합니다.

아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

drug-induced-sensitization-adenylyl-cyclase-assay-streamlining

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.6K 조회수.  Purdue University.  아데 닐릴 시클 라제 시그널링의 억제 감작있는 G 단백질 결합 수용체 결과의 지속적인 활성화. 필수 분자 경로를 식별하기 위해 nonbiased 접근이 필요하지만,이 전략은 확장 셀 기반 캠프 민감성 분석의 개발이 필요합니다. 여기서, 우리는 작은 분자 및 siRNA의 검사에 대한 민감성 분석을 설명합니다. 

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Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

FlexStation 3을 사용 TRP 채널 기능의 높은 처리량 검사하는 매체를위한 셀 기반의 칼슘 분석

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

연구

생체공학

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

광대역 의료 이미징 애플리케이션을위한 초음파의 광 검출기

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

siRNA를 치료제의 전달을위한 다공성 실리콘 미세 입자

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

단백질 표적 소분자 약물 검사를위한 신속하고 정량적적인 형광 방법

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin exine capsules (SECs) are obtained when spores or pollen are processed so as to remove the internal sporoplasmic contents. The resulting hollow microcapsules exhibit a high degree of micromeritic uniformity and retain intricate microstructural features related to the particular plant species. Herein, we demonstrate a streamlined process for the production of SECs from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs. The current SEC isolation procedure has been recently optimized to significantly reduce the processing requirements which are conventionally used in SEC isolation, and to ensure the production of intact microcapsules. Natural L. clavatum spores are defatted with acetone, treated with phosphoric acid, and extensively washed to remove sporoplasmic contents. After acetone defatting, a single processing step using 85% phosphoric acid has been shown to remove all sporoplasmic contents. By limiting the acid processing time to 30 hr, it is possible to isolate clean SECs and avoid SEC fracturing, which has been shown to occur with prolonged processing time. Extensive washing with water, dilute acids, dilute bases, and solvents ensures that all sporoplasmic material and chemical residues are adequately removed. The vacuum loading technique is utilized to load a model protein (Bovine Serum Albumin) as a representative hydrophilic compound. Vacuum loading provides a simple technique to load various compounds without the need for harsh solvents or undesirable chemicals which are often required in other microencapsulation protocols. Based on these isolation and loading protocols, SECs provide a promising material for use in a diverse range of microencapsulation applications, such as, therapeutics, foods, cosmetics, and personal care products.

This protocol/manuscript describes a streamlined process for the production of sporopollenin exine capsules (SECs) from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs.

마이크로 캡슐화 애플리케이션을위한 추출 공장 기반 캡슐

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well as large-scale high-throughput screening (HTS) campaigns. Though laboratory automation has greatly increased the utility of microplates there remain instances where automation-based instrumentation is not feasible, cost-effective or compatible with microplate formatting needs. In these cases, microplates must be manually prepared. Problematic to manual microplate manipulations is that a number of difficulties can arise pertaining to the accurate tracking of sample operations, data record keeping and quality control (QC) inspection for well artifacts or formatting errors. As microplate well densities increase (i.e., 96-well, 384-well, 1536-well) the potential for introducing errors also drastically increases.&#160; Moreover, for small bench-top laboratory operations there exists a need to improve the ease and accuracy of sample handling in a cost-effective fashion. Herein, we describe a system that acts as a semi-automated pipetting guide referred to as the Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.). &#160;M.A.P.L.E. has multiple uses for supporting compound hit-picking and microplate preparation for assay development in high-throughput screening or laboratory benchtop operations, as well as QC/quality assurance (QA) diagnostic evaluation of microplate quality or visualizing well formatting errors.

Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.) is a computer-driven device that systematically illuminates microtiter wells to provide guidance for the manual preparation of microplates.&#160; M.A.P.L.E. improves the accuracy of microplate preparation while automating data recordkeeping. &#160;In addition, it can assist with examining microplate quality or aid in the detection of errors.&#160; &#160;

오픈 소스 마이크로플레이트 호환 조명 패널용 애플리케이션

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various biological activities including cell proliferation, survival, migration and differentiation. Several aberrations in the FGFR signaling pathway, owing to mutations or gene amplification events, have been identified in various types of cancers. Hence, recent research has focused on developing strategies involving therapeutic targeting of FGFRs. Current FGFR inhibitors at various stages of pre-clinical and clinical development include either small molecule inhibitors of tyrosine kinases or monoclonal antibodies, with only a few peptide- based inhibitors in the pipeline. Here, we provide a protocol using phage display technology to screen small peptides as antagonists of FGFR2. Briefly, a library of phage-displayed peptides was incubated in a plate coated with FGFR2. Subsequently, unbound phage was washed off by TBST (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20), and bound phage was eluted with 0.2 M glycine-HCl buffer (pH 2.2). The eluted phage was further amplified and used as input for the next round of biopanning. Following three rounds of biopanning, the peptide sequences of individual phage clones were identified by DNA sequencing. Finally, the screened peptides were synthesized and analyzed for affinity and biological activity.

Herein, we present a detailed protocol for screening small peptides that bind to FGFR2 using a phage display peptide library. We further analyze the affinity of the selected peptides toward FGFR2 in vitro and its ability to suppress cell proliferation.

파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리를 사용하여 섬유아세포 성장 인자 수용체2를 표적으로 하는 소형 펩타이드의 스크리닝 및 식별

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Rapid Fabrication of Custom Microfluidic Devices for Research and Educational Applications

Microfluidic devices allow for the manipulation of fluids, particles, cells, micro-sized organs or organisms in channels ranging from the nano to submillimeter scales. A rapid increase in the use of this technology in the biological sciences has prompted a need for methods that are accessible to a wide range of research groups. Current fabrication standards, such as PDMS bonding, require expensive and time consuming lithographic and bonding techniques. A viable alternative is the use of equipment and materials that are easily affordable, require minimal expertise and allow for the rapid iteration of designs. In this work we describe a protocol for designing and producing PET-laminates (PETLs), microfluidic devices that are inexpensive, easy to fabricate, and consume significantly less time to generate than other approaches to microfluidics technology. They consist of thermally bonded film sheets, in which channels and other features are defined using a craft cutter. PETLs solve field-specific technical challenges while dramatically reducing obstacles to adoption. This approach facilitates the accessibility of microfluidics devices in both research and educational settings, providing a reliable platform for new methods of inquiry.

Here we present a protocol to design and fabricate custom microfluidic devices with minimal financial and time investment. The aim is to facilitate the adoption of microfluidic technologies in biomedical research laboratories and educational settings.