המחברים מבקשים להודות לכל העמיתים שעשו את עבודה זה אפשרי, במיוחד מאיה Balamane, אליזבת לבנה ג&#39;ונסטון, שרון Sjoblom, גרג Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, ג&#39;יימס גארווי, גאווין קוב, Senzo Maphanga, Terusha Chetty , Kevi Naidoo, אנדרו Skingsley, קתרין סטוט, וLungani Ndwandwe. המחברים רוצים גם להודות לכל אנשים של מחלקת בריאות ומרכז אפריקה אנשים שעובדים Hlabisa HIV הטיפול וטיפוח לתכנית.

<ol>
	<li>Shao, Y., Williamson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+epidemic:+low-+to+middle-income+countries.">The HIV-1 epidemic: low- to middle-income countries.</a> Cold Spring Harbor Persp. Med. 2, (2012).</li><li>Mutevedzi, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-up+of+a+decentralized+HIV+treatment+programme+in+rural+KwaZulu-Natal,+South+Africa:+does+rapid+expansion+affect+patient+outcomes.">Scale-up of a decentralized HIV treatment programme in rural KwaZulu-Natal, South Africa: does rapid expansion affect patient outcomes.</a> Bull. World Health Organ. 88, 593-600 (2010).</li><li>Houlihan, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohort+profile:+Hlabisa+HIV+treatment+and+care+programme.">Cohort profile: Hlabisa HIV treatment and care programme.</a> Int. J. Epidemiol. 40, 318-326 (2011).</li><li>Tanser, F., Barnighausen, T., Grapsa, E., Zaidi, J., Newell, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+coverage+of+ART+associated+with+decline+in+risk+of+HIV+acquisition+in+rural+KwaZulu-Natal.">High coverage of ART associated with decline in risk of HIV acquisition in rural KwaZulu-Natal.</a> South Africa. Science. 339, 966-971 (2013).</li><li>Bor, J., Herbst, A. J., Newell, M. L., Barnighausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increases+in+adult+life+expectancy+in+rural+South+Africa:+valuing+the+scale-up+of+HIV+treatment.">Increases in adult life expectancy in rural South Africa: valuing the scale-up of HIV treatment.</a> Science. 339, 961-965 (2013).</li><li>Montaner, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+case+for+expanding+access+to+highly+active+antiretroviral+therapy+to+curb+the+growth+of+the+HIV+epidemic.">The case for expanding access to highly active antiretroviral therapy to curb the growth of the HIV epidemic.</a> Lancet. 368, 531-536 (2006).</li><li>Granich, R. M., Gilks, C. F., Dye, C., De Cock, K. M., Williams, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+voluntary+HIV+testing+with+immediate+antiretroviral+therapy+as+a+strategy+for+elimination+of+HIV+transmission:+a+mathematical+model.">Universal voluntary HIV testing with immediate antiretroviral therapy as a strategy for elimination of HIV transmission: a mathematical model.</a> Lancet. 373, 48-57 (2009).</li><li>Johnson, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+expectancies+of+South+african+adults+starting+antiretroviral+treatment:+collaborative+analysis+of+cohort+studies.">Life expectancies of South african adults starting antiretroviral treatment: collaborative analysis of cohort studies.</a> PLoS Med. 10, (2013).</li><li>Blower, S., Ma, L., Farmer, P., Koenig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+the+impact+of+antiretrovirals+in+resource-poor+settings:+preventing+HIV+infections+whilst+controlling+drug+resistance.">Predicting the impact of antiretrovirals in resource-poor settings: preventing HIV infections whilst controlling drug resistance.</a> Curr. Drug Targets. 3, 345-353 (2003).</li><li>Geretti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+antiretroviral+drug+resistance+in+drug-naive+persons.">Epidemiology of antiretroviral drug resistance in drug-naive persons.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 22-32 (2007).</li><li>Larder, B. A., Darby, G., Richman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+with+reduced+sensitivity+to+zidovudine+(AZT)+isolated+during+prolonged+therapy.">HIV with reduced sensitivity to zidovudine (AZT) isolated during prolonged therapy.</a> Science. 243, 1731-1734 (1989).</li><li>Erice, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+primary+infection+with+zidovudine-resistant+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Brief report: primary infection with zidovudine-resistant human immunodeficiency virus type 1.</a> N. Engl. J. Med. 328, 1163-1165 (1993).</li><li>Williams, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=British+HIV+Association+guidelines+for+the+treatment+of+HIV-1-positive+adults+with+antiretroviral+therapy.">British HIV Association guidelines for the treatment of HIV-1-positive adults with antiretroviral therapy.</a> HIV Med. 13 Suppl 2, 1-85 (2012).</li><li>DHHS, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and Adolescents. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. , (2012).</li><li>Vandamme, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+recommendations+for+the+clinical+use+of+HIV+drug+resistance+testing:+2011+update.">European recommendations for the clinical use of HIV drug resistance testing: 2011 update.</a> AIDS Rev. 13, 77-108 (2011).</li><li>DHHS, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> US Panel on Antiretroviral Therapy and Medical Management of HIV-Infected Children. Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Pediatric HIV Infection. , (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Department+of+Health.">Department of Health.</a> Clinical guidelines for the management of HIV &amp; AIDS in adults and adolescents. , (2010).</li><li>Conradie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2012+southern+African+ARV+drug+resistance+testing+guidelines.">The 2012 southern African ARV drug resistance testing guidelines.</a> S. Afr. J.HIV Med. 13, 162-167 (2012).</li><li>Manasa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Drug+Resistance+in+South+Africa:+Data+from+10+Years+of+Surveys.">Primary Drug Resistance in South Africa: Data from 10 Years of Surveys.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 558-565 (2012).</li><li>Tshabalala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+of+transmitted+antiretroviral+drug+resistance+among+HIV-1+infected+women+attending+antenatal+clinics+in+Chitungwiza,+Zimbabwe.">Surveillance of transmitted antiretroviral drug resistance among HIV-1 infected women attending antenatal clinics in Chitungwiza, Zimbabwe.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li><li>Bartolo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+drug+resistance+surveillance+among+treatment-naive+human+immunodeficiency+virus+type+1-infected+individuals+in+Angola:+evidence+for+low+level+of+transmitted+drug+resistance.">Antiretroviral drug resistance surveillance among treatment-naive human immunodeficiency virus type 1-infected individuals in Angola: evidence for low level of transmitted drug resistance.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 53, 3156-3158 (2009).</li><li>Bartolo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+genetic+diversity+and+transmitted+drug+resistance+in+health+care+settings+in+Maputo,+Mozambique.">HIV-1 genetic diversity and transmitted drug resistance in health care settings in Maputo, Mozambique.</a> J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 51, 323-331 (2009).</li><li>Hamers, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+drug+resistance+in+antiretroviral-naive+individuals+in+sub-Saharan+Africa+after+rollout+of+antiretroviral+therapy:+a+multicentre+observational+study.">HIV-1 drug resistance in antiretroviral-naive individuals in sub-Saharan Africa after rollout of antiretroviral therapy: a multicentre observational study.</a> Lancet Infect. Dis. 11, 750-759 (2011).</li><li>Hamers, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Drug+Resistance+Mutations+Are+Present+in+Six+Percent+of+Persons+Initiating+Antiretroviral+Therapy+in+Lusaka,+Zambia.">HIV-1 Drug Resistance Mutations Are Present in Six Percent of Persons Initiating Antiretroviral Therapy in Lusaka, Zambia.</a> J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2010).</li><li>Nwobegahay, J., Selabe, G., Ndjeka, N. O., Manhaeve, C., Bessong, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+prevalence+of+transmitted+genetic+drug+resistance+in+a+cohort+of+HIV+infected+naive+patients+entering+antiretroviral+treatment+programs+at+two+sites+in+northern+South+Africa.">Low prevalence of transmitted genetic drug resistance in a cohort of HIV infected naive patients entering antiretroviral treatment programs at two sites in northern South Africa.</a> J. Med. Virol. 84, 1839-1843 (2012).</li><li>Iweriebor, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+epidemiology+of+HIV+in+two+highly+endemic+areas+of+northeastern+South+Africa.">Molecular epidemiology of HIV in two highly endemic areas of northeastern South Africa.</a> Arch. Virol. 157, 455-465 (2012).</li><li>Parboosing, R., Naidoo, A., Gordon, M., Taylor, M., Vella, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antiretroviral+drugs+in+newly+diagnosed,+young+treatment-naive+HIV-positive+pregnant+women+in+the+province+of+KwaZulu-Natal+South+Africa.">Resistance to antiretroviral drugs in newly diagnosed, young treatment-naive HIV-positive pregnant women in the province of KwaZulu-Natal South Africa.</a> J. Med. Virol. 83, 1508-1513 (2011).</li><li>Nwobegahay, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+antiretroviral+drug+resistance+mutations+and+HIV-I+subtypes+among+newly-diagnosed+drug-naive+persons+visiting+a+voluntary+testing+and+counselling+centre+in+northeastern+South+Africa.">Prevalence of antiretroviral drug resistance mutations and HIV-I subtypes among newly-diagnosed drug-naive persons visiting a voluntary testing and counselling centre in northeastern South Africa.</a> J. Health Popul. Nutr. 29, 303-309 (2011).</li><li>Nwobegahay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+drug-resistant+mutations+in+newly+diagnosed+drug-naive+HIV-1-infected+individuals+in+a+treatment+site+in+the+waterberg+district,+limpopo+province).">Prevalence of drug-resistant mutations in newly diagnosed drug-naive HIV-1-infected individuals in a treatment site in the waterberg district, limpopo province).</a> S. Afr. Med. J. 101 (2011), 335-337 (2011).</li><li>Rosen, S., Long, L., Sanne, I., Stevens, W. S., Fox, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+net+cost+of+incorporating+resistance+testing+into+HIV/AIDS+treatment+in+South+Africa:+a+Markov+model+with+primary+data.">The net cost of incorporating resistance testing into HIV/AIDS treatment in South Africa: a Markov model with primary data.</a> J. Int. AIDS Soc. 14, 24 (2011).</li><li>Dalai, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+molecular+epidemiology+of+subtype+C+HIV-1+in+Zimbabwe.">Evolution and molecular epidemiology of subtype C HIV-1 in Zimbabwe.</a> AIDS. 23, 2523-2532 (2009).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-house+human+immunodeficiency+virus-1+genotype+resistance+testing+to+determine+highly+active+antiretroviral+therapy+resistance+mutations+in+Hong+Kong.">In-house human immunodeficiency virus-1 genotype resistance testing to determine highly active antiretroviral therapy resistance mutations in Hong Kong.</a> Hong Kong Med. 18, 20-24 (2012).</li><li>Lee, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in-house+HIV+genotyping+assay+for+the+detection+of+drug+resistance+mutations+in+Southeast+Asian+patients+infected+with+HIV-1.">An in-house HIV genotyping assay for the detection of drug resistance mutations in Southeast Asian patients infected with HIV-1.</a> J. Med. Virol. 84, 394-401 (2012).</li><li>Aitken, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pragmatic+Approach+to+HIV-1+Drug+Resistance+Determination+in+Resource-Limited+Settings+by+Use+of+a+Novel+Genotyping+Assay+Targeting+the+Reverse+Transcriptase-Encoding+Region+Only.">A Pragmatic Approach to HIV-1 Drug Resistance Determination in Resource-Limited Settings by Use of a Novel Genotyping Assay Targeting the Reverse Transcriptase-Encoding Region Only.</a> J. Clin. Microbiol. 51, 1757-1761 (2013).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+low+cost+and+broadly+sensitive+genotyping+assay+for+HIV-1+drug+resistance+surveillance+and+monitoring+in+resource-limited+settings.">Optimization of a low cost and broadly sensitive genotyping assay for HIV-1 drug resistance surveillance and monitoring in resource-limited settings.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+Technologies.">Life Technologies.</a> Life Technologies and SATuRN Collaborate to Increase Access to HIV Testing in Africa. , (2012).</li><li>Lihana, R. W., Ssemwanga, D., Abimiku, A., Ndembi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+HIV-1+diversity+in+Africa:+a+decade+in+review.">Update on HIV-1 diversity in Africa: a decade in review.</a> AIDS Rev. 14, 83-100 (2012).</li></ol>

<div style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה זו נתמכה על ידי קרן Wellcome (082384/Z/07/Z), האיחוד האירופי (סנטה 2007 147-790), המרכז האמריקאי למחלות לשלוט באמצעות CAPRISA (כותרת פרויקט: מערכות בריאות חיזוק וכישלון הטיפול ב-HIV (איידס TFC)), ושויצרי דרום אפריקאי משותפת תכנית מחקר (SSJRP) &quot;השוויצרית Prot / דרום אפריקה: חלבון ביואינפורמטיקה פיתוח משאבים לפתוגנים חשובים הקשורים לבריאות&quot; מענק מחקר שכותרתו (090,999 / ת מספר מענק RL נתמך על ידי קרן Wellcome. / 09 / ת). הממנים לא היו תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד. המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים. </div>

שיטות בבית כמה עלות הנמוכה תוארו במאמצים כדי לנסות להפוך את גנוטיפ עמידות לתרופות HIV זול יותר 33, 34, 36. אין ספק בצורך לשלב בדיקת עמידות לתרופות לרצף של טיפול עבור אנשים בטיפול תרופתי במשאב מוגבל הגדרות. עם זאת, רוב השיטות דיווחו להתמקד ביישום של גנוטיפ עמידות לתרופה במעקב של עמידות לתרופות ברמת אוכלוסייה. שיטת גנוטיפ שבתאי / חיים טכנולוגיות היא פרוטוקול משולב במלואם למעקב וניטור של עמידות לתרופות. שיטה זו נועדה להיות פרוטוקול סביר יישום בעיקר קוד פתוח ומשאבים ביואינפורמטיקה הגישה פתוחים לפרשנות של עמידות לתרופות והפקת דוחות לניהול קליני. זה היה הראה באמצעות השוואה עם שיטת גנוטיפ Viroseq אישרה ה-FDA להיותמדויק בזיהוי מוטציות עמידות לתרופות מפנל של דגימות בדיקת מיומנות ANRS, בפנל של דגימות מעבדה שהיו מוגברות בהצלחה 100%. הדיוק הוערך גם על דגימות קליניות של וירוסי C תת סוג, תת הסוג הדומיננטי ביותר בדרום אפריקה. השיטה הייתה מדויקת כעל דגימות C תת כפי שהיה בתת הסוג A ו-B עם זאת, אם השיטה הייתה בשימוש בחלקים אחרים של העולם שבו CRF02_AG נפוץ, יש צורך בשינוי של פריימרים מאז השיטה לא הצליח להגביר את אחד המדגמים הפנל שהוצג לי CRF02_AG. לחלופין, סט מנוון של פריימרים רגישים לכל הקבוצה M וירוסי 33, 36 יכולים לשמש באזורים שבם החלוקה תת הסוג היא יותר הטרוגנית 38. הרגישות של השעתוק לאחור וPCR יכולה להיות מוגברת על ידי מיצוי RNA מכמויות גבוהות יותר של פלזמה, כמו 500 מיליליטר. הפלזמה ניתן centrifuged ב21,000 XG במשך 90 דקות להתרכז חלקיקים נגיפיים לפני שתמשיך עם הפרוטוקול כפי שתואר על ידי ערכת מיני מיצוי RNA QIAamp נגיפית. כפי שניתן לראות, יש לו את השיטה החדשה יתרון נוסף שהיא מייצרת דו&quot;חות מקיפים לניהול מטופל. דוחות אלה הם איחוד של גנוטיפ, חיסוני ונתוני ניטור virologic כמו גם היסטוריה קלינית וטיפול מRegaDB. זו מלווה בפרשנות מעבדה מפורטת של פרופיל ההתנגדות ואחריו ביקורת באותה מידה מפורטת של ההיסטוריה הקלינית של המטופל, כמו גם המלצות לטיפול. השימוש ברופאים מומחה כדי לבדוק את הדיווחים ולספק המלצות לטיפול בחולים מספק הדרכה נחוצה עבור מתרגל אחות, כמו גם רופאים לא מנוסים, שיותר ויותר לספק לאמנות בדרום אפריקה כחלק מהמלצות ארגון הבריאות העולמי להסטת משימה. אלה קלינייםדיווחים הוכחו להיות עזרי הוראה יעילים לרופאים עם מעט או ללא ניסיון בניהול עמידות לתרופה. מנקודת מבט של מטופל, השיטה שלנו מקטינה את הצורך לנסוע לאתרים מרכזיים לגישה לשירותי HIV מומחה. לפיכך, הפרוטוקול המתואר כמכלול מספק פלטפורמה טובה שדרכו ניתן לשלב בניהול עמידות לתרופות ב-HIV, במחיר סביר, לרצף של טיפול לאמנות שלא הצליחו אנשים נגועים ב-HIV. נתונים שנוצרו יכולים לשמש למטרות אפידמיולוגיים על מנת להעריך את ההתפתחות והעברה של עמידות לתרופות בקהילה. גודלו של הבר לקים שנוצר הוא מספיק טוב לניתוח פילוגנטי מורכב יותר אשר ייצר הבנה טובה יותר של המגיפה ברמת אוכלוסייה.

מגפת האיידס בדרום אפריקה כבר מתפתחת במהירות 1 עם עלייה במקביל מעריכי באנשים בטיפול תרופתי (ART), ובמיוחד בדרום אפריקה 2, 3. כראיה על ההשפעה אפידמיולוגיים של תוכניות טיפול בקנה מידה גדולה בהפחתת שכיחות 4 והגדלת תוחלת חיים במשאב מוגבל הגדרות (RLS) 5 ממשיך לצבור, המאמצים להגדיל את כיסוי ART יהיו מוגברים. האבולוציה של הנחיות לשימוש בטיפול ככלי למניעה 6, 7 מתחת לבדיקה והטיפול בתוכניות אומרת שהמספר המוחלט של אנשים בטיפול יהיה להגביר עוד יותר. מספרים גדולים של אנשים יהיו על אמנות לתקופות זמן ארוכות יותר כפי שתוחלת החיים הממוצעת של אנשים באמנות מתקרבת זה של האוכלוסייה נגוע ב-HIV 8. הפיתוח וההעברה של עמידות לתרופת HIV יש alwaי&quot;ש נחשב איום על ההישגים של ART 9-12. לפיכך, יש צורך במעקב וניטור של עמידות לתרופות קפדניים יותר ככל שיותר אנשים הם יזמו על אמנות. עמידות לתרופות Genotypic הבדיקה (GRT) שמשה בהצלחה במדינות מפותחות, הן למעקב, כמו גם ניטור של עמידות לתרופות של HIV-1 באנשים שקיבלו לאמנות. בהגדרות אלה, GRT כבר משולב לתוך הרצף של טיפול ל-HIV-1 אנשים נגועים. רוב ההנחיות הבינלאומיות ממליצים GRT למבוגר או מטופלי ילדים שלא הצליחו ART (קו ראשון וקו שני) 13-15, מטופלי ילדים שנחשפו למניעת העברת אמא לילד משטרים (PMTCT) אבל נגועים לאחר מכן 16, ובהגדרות עם רמות גבוהה של עמידות לתרופות מועברת בין אנשים שנדבקו בחריפות 13-15. עם זאת, דרישות העלות, טכנולוגיה ותשתיות מוגבלות implemenסימטרייה של גישות דומות לניטור עמידות לתרופה בRLS. הטיפול בדרום אפריקה ב-HIV והנחיות ניטור בשלב זה אינו ממליצים על השימוש בGRT בבחירה מנחה של אמנות עבור אנשים שלא הצליחו קו הראשון משטר 17. אנשים מופעלים מבוססים בעיקר על virological פרמטרים (עומס הנגיפי RNA HIV-1). עם זאת ב2012, אגודת האיידס בדרום אפריקה הרופאים פרסמה הנחיות לבדיקת עמידות לתרופות ARV דרום האפריקאי הראשונות 18. הנחיות אלה ממליצים על בדיקות GRT לכל המבוגרים שלא הצליחו קו ראשון וART קו שני ועבור תינוקות נגועים וילדים שנחשפו לPMTCT 18. עם זאת, GRT אינו מומלץ 18 לאנשים שנדבקו בחריפות, משום שאין ראיות הנוכחיות לרמות גבוהות של עמידות לתרופות מועברת בדרום אפריקה 19-29. צפוי כי חלק מההמלצות אלה ישולב לאורך זמן ולטיה הלאומיתהנחיות atment וניטור של המדינות השונות באזור. כבר עכשיו, ב2013 הנחיות טיפול בדרום אפריקה יש כרגע היא המלצת GRT בזמן של כישלון קו השני למבוגרים ובזמן של כישלון טיפול המבוסס על PI הראשון או קו שני לילדים 30. הוכח כי שילוב GRT להנחיות טיפול בדרום אפריקה יהיה פוטנציאל העלות ניטראלית. בהתחשב בעלות של תרופות משטר הקו השניה שהם יחסית יקרים יותר מאשר תרופות הקו הראשונות, תוך שימוש בGRT לזהות חולים שבאמת צריך להיות מופעל לטיפול קו שני לא תביא כל עלות נוספת לתכנית. בנוסף, GRT יכול גם לזהות סיבות אחרות לכישלון, לשמר את אפשרויות טיפול והפקת מידע על דפוסי התנגדות מתעוררים ביום 31. לכן, יש צורך להפחית את העלות של שיטות ניטור עמידות לתרופה עוד יותר על מנת לשפר את הגישה, איכות טיפולתוצאות ד. כאן, אנו מציגים שיטת GRT תוכננה להשתמש פריימרים כלליים (קוד פתוח) לשעתוק לאחור, תגובת שרשרת פולימרז (PCR) ורצף (טבלה 1), כמו גם תוכנות קוד פתוח בעיקר לפרשנות עמידות לתרופה. לניהול קליני, הפרוטוקול הוא החמיא על ידי שיטת ביקורת ודיווח מקיפה עם פרשנות מומחה של דו&quot;ח עמידות לתרופה במעבדה עם קרוב דבקות בהנחיות הטיפול הלאומית. הפרוטוקול מחולק לארבעה מרכיבים שונים: 1) ה-HIV ריבונוקלאית חומצה (מיצוי RNA), 2) הפוך תמלול ותגובת שרשרת פולימרז (PCR הגברה) של מטרות נגיפיות, 3) רצף ו4) שיטות ביואינפורמטיקה לניתוח של chromatograms, יישור, אוצרות ופרשנות של נתונים ברצף.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Superscript III 1st strand Synthesis kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">18080051</td>
			<td style="width:265px;">Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">SATURN/LiFE Technologies Custom Primers</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4473517</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Platinum Taq</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10966026</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PureLink QUICK PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">K310002</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Viroseq</td>
			<td style="width:372px;">ABBOTT</td>
			<td style="width:119px;">4J94-20</td>
			<td>Reverse Transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Agarose Tablets (Dnase/Rnase free)</td>
			<td style="width:372px;">BIOLINE</td>
			<td style="width:119px;">BIO-41027</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">1.06177.2500</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">O&#39;Range Ruler 200bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:372px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">FE SM0633</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Novel Juice</td>
			<td style="width:372px;">GeneDireX</td>
			<td style="width:119px;">LD001-1000&#160;</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">MiniBis Bioimaging System</td>
			<td style="width:372px;">DNR Bioimaging Systems Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Documentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Power Pac 300&#160;</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Big Dye Terminator Kit ver 3.1</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4337456</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Arrays</td>
			<td style="width:372px;">Life Technolgies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4319899</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PoP</td>
			<td style="width:372px;">Life technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4363785</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">10 x EDTA Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">402824</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Formamide</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4311320</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">5 x Sequencing Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Tecgnologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4336697</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3130 xl Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT/PCR/Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5804</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sample Processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>PCR Product Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5810</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Picofuge</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;">C1301-230V</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td style="width:372px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3M Sodium Acetate</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td align="right" style="width:119px;">567422</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Absolute Ethanol</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">SAAR2233540LP</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">1.5ml SARSTEDT Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.692.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml SARSTEDT&#160; Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.693.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml Collection tubes</td>
			<td style="width:372px;">SCIENTIFIC GROUP</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-NC/S</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Optical MicroAmp 96 Well reaction plates</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">N8010560</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps</td>
			<td style="width:372px;">STAR Lab - supplied by CELTIC</td>
			<td style="width:119px;">A1402-3700</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul PCR individual tubes</td>
			<td style="width:372px;">Scientific Group</td>
			<td style="width:119px;">CR/3745</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Geneious&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Biomatters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Internet Access</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Preferrably high speed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Web resources</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">hivdb.stanford.edu</td>
			<td style="width:372px;">Stanford University</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Drug reistance analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>database</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence quality tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings

יש עמידות לתרופות של HIV-1 את הפוטנציאל לסכן את היעילות והשפעה של טיפול תרופתי (ART) ברצינות. כתוכניות לאמנות באפריקה שמדרום לסהרה להמשיך ולהרחיב, יחידים באמנות צריכים להיות תחת פיקוח הדוק להופעתה של עמידות לתרופה. מעקב של עמידות לתרופות מועברת כדי לעקוב אחר שידור של זני נגיפים כבר עמידים לאמנות הוא גם קריטי. למרבה הצער, בדיקת עמידות לתרופות היא עדיין אינה נגישה בקלות בהגדרות מוגבלות של משאבים, כי גנוטיפ זה יקר ודורש מעבדה משוכללת ותשתיות ניהול הנתונים. שיטת ניטור עמידות לתרופת genotypic גישה פתוחה לניהול אנשים ולהעריך את העמידות לתרופה מועברת מתוארת. השיטה משתמשת בתוכנת קוד פתוח חופשית לפרשנות של דפוסי עמידות לתרופות והדור של דוחות חולה בודדים. יש פרוטוקול גנוטיפ שיעור הגברה של יותר מ 95% עבור דגימות פלזמה עם avעומס iral&gt; 1,000 HIV-1 RNA עותקים / מיליליטר. הרגישות פוחתת באופן משמעותי לעומס נגיפי &lt;עותקי RNA 1,000 HIV-1 / מיליליטר. השיטה המתוארת כאן הייתה תוקף כנגד שיטה של ​​עמידות לתרופות של HIV-1 בדיקות שאושרה על ידי ארצות הברית מנהל המזון והתרופות אמריקניות (FDA), שיטת גנוטיפ Viroseq. מגבלות של השיטה המתוארת כאן כוללות את העובדה שזה לא אוטומטי ושזה גם לא הצליח להגביר את CRF02_AG צורה רקומביננטי במחזור מפנל אימות של דגימות, למרות שזה מוגבר תת A ו-B מאותו הפנל.

שיטת תוקף הייתה שינוי של שיטה שדווחה בעבר 20. שיטת גנוטיפ Viroseq, אשר אושרה על ידי ה-FDA, הייתה בשימוש כשיטת ההתייחסות באימות. פנל של דגימות בדיקת מיומנות המתקבלות מהסוכנויות הלאומיות הצרפתית למחקר באיידס וצהבת נגיפית (ANRS) שימש בהשוואה העיקרית בין שתי השיטות. שתי שיטות genotyping היו 100% concordant בזיהוי כל המוטציות הקשורים עמידות לתרופה החשובה קליני כפי שפורש על ידי תכנית HIVDB לדגימות שהיו מוגבר בהצלחה על ידי שני השיטות. כפי שניתן לראות בטבלה 6, רצפי נוקליאוטידים של שלושה הזוגות היו 99.5% זהים. רצפי חומצות אמינו חזו היו 100% זהים. דגימה אחת מתוך חמישה לא יכולה להיות מוגברת בהצלחה על ידי Viroseq. בנוסף למדגם לא מוגבר על ידי Viroseq, השיטה בתוך הבית לא הצליחה להגביר דגימה שנייה שהוצגהכדי להיות וירוס במחזור רקומביננטי (CRF02_AG) על ידי Viroseq. שלוש הדגימות שמוגברות עם שני מתודולוגיות היו תת סוג B (שתי דוגמאות) ותת (מדגם אחד). <img alt="איור 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5.jpg" /> איור 5. שימוש בעץ השכן הצטרפות HKY נעשה כחלק מהבטחת איכות רצף. ישנם ארבעה זוגות / אשכולות של רצף עם מרחקים גנטיים קצרים מאוד. המרחק הגנטי בין RES655 וRES655_1 (דגימות אותו הרצף בימים שונים) הוא 0.003. היא טעות פוטנציאלית עם זוג RES637_1/RES638 כמרחק הגנטי שלהם הוא קצר מדי (0.075) לדגימות מאנשים epidemiologically לא צמודים שונים. יש RES637 אחר על העץ עם מרחק של 0.075 בהשוואה לRES638_1. אשכול CQ01/CQ02 עולה כי שתי דגימותמלוח הן כפילויות של המדגם זהה. הם מתקבצים יחד עם רצף ההתייחסות תת הסוג B המאשר את תת הוקצה על ידי כלי REGA Subtyping. CQ05 וCQ04 התקבצו עם תת ו-G בהתאמה, ואילו כלי subtyping REGA סיווג אותם וכCRF02_AG בהתאמה. כלי שימושי נוסף לsubtyping HIV ורקומבינציה הוא SCUEL, אשר זמין בhttp://www.datamonkey.org. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> פנל של חמש דגימות שימש כדי להעריך את רמת הדיוק של שיטת in-house. עשרה גנוטיפים לשכפל נוצרו לכל אחד מחמש הדגימות. באמצעות המנתח הגנטי 16 נימי 3130xl, 48 של 50 גנוטיפים נוצרו מ24 ריצות, שהוכנו באותו היום. לכל חמש דגימות, רצפי חומצות אמינו חזו היו 100% concordant בין משכפל. לרצפי חומצות, ה הגרעיןפה היה&gt; 99% דמיון pairwise. בשנתיים הראשונות של השימוש בשיטה זו, דגימות שישים חזרו על עצמם באופן אקראי ממיצוי RNA רצף. לא היו הבדלים משמעותיים סטטיסטי בין ציון איכות הרצף ובמספר מעורבים בסיסים בין משכפל. השוואות pairwise שני נוקליאוטידים וחומצות אמינו לזוגות שישים היו גדולים יותר מ99% זהות. לכן מוטציות עמידות לתרופות לכל הזוגות היו 100% תואמות. הפחתת עלויות כרכי התגובה לRT, PCR וסדר הופחתו בחצי לפחות, ביחס לשיטה המקורית 20, 32, מבלי להתפשר על האיכות של הרצפים שנוצרו. זה אפשר הפחתה בעלות של 50% לשלבי RT וה-PCR. השיטה החדשה תוכננה במקור לעבודה עם שישה פריימר רצף רצף<html> כל 99 קודונים של גן פרוטאז ו300 קודונים הראשונים של הגן ההפוך טרנסקריפטאז 20, 32. שיטות דומות גם להשתמש בשש עד שמונה פריימרים 33, 34. כמה שיטות שפורסמו לאחרונה השתמשו בפחות משישה צבעי יסוד, לפעמים למרות רצף פרוטאז וגני RT seprately 35, 36. אנחנו ביקשנו לצמצם את מספר פריימרים רצף 6-4, (איור 6) <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6.jpg" /> איור 6. השוואה של רצפים רציפים משישה לעומת ארבעה פריימרים רצף לדור של רצף Pol 1197 נ&quot;ב המכסה את כל 99 קודונים פרוטאז ה-HIV-1 ו300 קודונים הראשונים של גן reverse transcriptase.242/51242fig6highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. רצפים מסט של 17 דגימות שנוצרו משישה פריימרים הושוו לרצפים שנוצרו לאחר ההרחקה של שני פריימרים (MAW46 וrty). תת היו 14 C תת, שני תת סוג B, וא &#39;תת סוג אחד לא היו הבדלים משמעותיים בציוני איכות רצף. שוב, את זהות pairwise הממוצעת בין 17 הזוגות של חומצות גרעין הייתה 99% ו100% ברמת חומצת אמינו. לפיכך, הפחתת פריימרים רצף 6-4 הביאה לירידה בעלות רצף בכמעט שליש. כלי תוכנת הקניינית רק בשימוש בפרוטוקול זה היה Geneious להרכבת רצף. כלי פרשנות עמידות לתרופות, כמו גם את הדו&quot;ח יצירת כלים כל כלים חופשיים, פתוחים גישה. פעולה זו מפחיתה את העלות נוספת על ידי ביטול את העלויות כרוכות בשימוש בתוכנת קניינית. יתר על כן, collectivמשא ומתן דואר אפשר ריאגנטים לפרוטוקול זה להיות ארוז בערכה לגישה קלה מחיים טכנולוגיים וזמין כטכנולוגיות שבתאי / החיים genotyping שיטה 37. יתר על כן, חברי שבתאי יכולים לגשת לחומרים כימיים במחיר מוזל. הגדרה קלינית הפרוטוקול המתואר יושם בניטור והמעקב של עמידות לתרופות בקהילה כפרית בקוואזולו נטאל. כולל של 604 גנוטיפים נוצרו מדגימות קליניות בין דצמבר 2010 ומאי 2013 בקצב הגברה של 95% לדגימות עם עומס נגיפי&gt; 1,000 RNA עותקים / מיליליטר. מחקר עמידות לתרופה זו קלינית HIV אושר על ידי ועדת המחקר ביו רפואת האתיקה של אוניברסיטת קוואזולו נטאל (BF052/10 אסמכתא) והוועדה לחקר הבריאות של מחלקת קוואזולו נטאל לבריאות (מס &#39;אסמכתא HRKM 176/10). דיווחי חולה בודדים שהופקו ונשלחו בחזרה למרפאותלניהול מטופל. שבעים ושניים (72) גנוטיפים גם נוצרו כחלק ממעקב של מחקר עמידות לתרופות משודר, מקוננים בתוך מחקר גדול המבוסס על אוכלוסייה פוטנציאלי HIV מעקב. הדגימות ראשוניות היו דם כל זין מחט שנאסף בmicrotubes EDTA. בגנוטיפ היה שיעור הגברה של 79% 19. אישור אתי לגנוטיפ של דגימות ממחקר המעקב הושג מאוניברסיטת ועדת המחקר ביו קוואזולו נטאל אתיקה (BE066107 אסמכתא). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם פריימר </td><td> רצף </td><td> משך </td><td> הוראה </td><td> תפקיד HXB2 </td><td></td></tr><tr><td> לוע-26 </td><td> TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC </td><td> 23 </td><td> קדימה </td><td> 2028-2050 </td><td> סיבוב 1 PCR </td></tr><tr><td> RT-21 </td><td> CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG </td><td> ביום 31 </td><td> הפוך </td><td> 3539-3509 </td><td> סיבוב 1 PCR </td></tr><tr><td> Pro-1 </td><td> TAGAGCCAACAGCCC CACCA </td><td> 20 </td><td> קדימה </td><td> 2147-2166 </td><td> PCR סיבוב 2 </td></tr><tr><td> RT-20 </td><td> CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC </td><td> 22 </td><td> הפוך </td><td> 3462-3441 </td><td> PCR סיבוב 2 </td></tr><tr><td> RTC1F </td><td> ACCTACACCTGTCAA CATAATTG </td><td> 23 </td><td> קדימה </td><td> 2486-2508 </td><td> רצף </td></tr><tr><td> RTC2R </td><td> TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG </td><td> 27 </td><td> הפוך </td><td> 2630-2604 </td><td> רצף </td></tr><tr><td> RTC3F </td><td> CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC </td><td> 30 </td><td> קדימה </td><td> 2956-2994 </td><td> רצף </td></tr><tr><td> RTC4R </td><td> CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC </td><td> 29 </td><td> הפוך </td><td> 3129-3101 </td><td> רצף </td><html></tr><tr><td> RT-y </td><td> GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG </td><td> 22 </td><td> הפוך </td><td> 2967-2946 </td><td> רצף </td></tr><tr><td> לוע-46 </td><td> TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC </td><td> 27 </td><td> קדימה </td><td> 2251-2277 </td><td> רצף </td></tr></tbody></table> טבלת 1. שעתוק הפוך, PCR, ופריימרים מותאמים אישית רצף בשימוש בדורו של שבר 1197 Pol נ&quot;ב המכסה את כל 99 קודונים פרוטאז ה-HIV-1 ו300 קודונים הראשונים של גן trascriptase ההפוך. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> RT21 (5pmol/ml) </td><td> 0.5 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> dNTP (10 מ&quot;מ) </td><td> 0.5 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> סך הכל </td><td> 1 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 2. dNTP / פריימר לערבב לתגובת השעתוק ההפוכה. <table border</html style=";text-align:right;direction:rtl">= &quot;0&quot; cellpadding = cellspacing &quot;0&quot; = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> מגיב </td><td> נפח / תגובה (מיליליטר) </td><td> ריכוז / תגובה </td></tr><tr><td> הראשון סטרנד חוצץ (10x) </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 מ&quot;מ) </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT (0.1 ז) </td><td> 1 </td><td> 0.008 </td></tr><tr><td> RNaseOUT (40 U / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> כתב עילי III הפוך transcriptase (200U/ml) </td><td> 0.5 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> סך הכל </td><td> 5 </td><td></td></tr></tbody></table> לוח 3. אנזים לערבב לתגובת השעתוק ההפוכה. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> נפח / תגובה (מיליליטר) </td><td> ריכוז סופי / תגובה </td></tr><tr><td> מים שטופלו DEPC </td><td> 18.4 </td><td> - &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> PCR חוצץ (10x) </td><td> 2.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCI 2 (50 מ&quot;מ) </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> תמהיל dNTP (10 מ&quot;מ) </td><td> 0.5 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> פריימר froward (5 pmol / ml) </td><td> 0.25 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> פריימר ההפוך (5 pmol / ml) </td><td> 0.25 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> פלטינום תקי פולימראז (5 U / ml) </td><td> 0.1 </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> סיכום ביניים </td><td> 23 </td><td> - </td></tr></tbody></table> לוח 4. תערובת אב PCR המקונן. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> נפח / תגובה (מיליליטר) </td><td> ריכוז / תגובה </td></tr><tr><td> מים שטופלו DEPC </td><td> 6.1 </td><td></td></tr><tr><td> רצף חוצץ (5x) </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> פריימר (3.2 pmol / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 0.16 </td></tr><tr><td> תמהיל רצף גדול דיי שליחות קטלנית </td><td> 0.4 </td><td> - </td></tr><tr><td> סך הכל </td><td> 9 </td><td></td></tr></tbody></table> לוח 5. מיקס מאסטר לתגובות רצף. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td align="center" colspan="4"> Viroseq </td><td align="center" colspan="4"> Inhouse </td><td rowspan="2"> % דמיון NA </td></tr><tr><td> מזהה לדוגמה </td><td> סוג משנה </td><td> ציון איכות </td><td> מוטציות יחסי הציבור </td><td> מוטציות RT </td><td> סוג משנה </td><td> ציון איכות </td><td> מוטציות יחסי ציבור </td><td> מוטציות RT </td></tr><tr><td> CQ01 </td><td> ב &#39; </td><td> 99.9 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> ב &#39; </td><td> 99.2 </td><td> M46L, I54L, V82, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ02 </td><td> ב &#39; </td><td> 99.5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> ב &#39; </td><td> 99.5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ03 </td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td></td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ04 </td><td> CRF02_AG </td><td> 98.4 </td><td> I54V, V82F, I84V </td><td> M41L, L74I, L210W, T215Y, V108I, Y181C </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ05 </td><td> </td><td> 99.7 </td><td></td><td> K103N </td><td> </td><td> 93 </td><td></td><td> K103N </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> לוח 6. resul השוואתיts מניתוח קבלה בין שיטת גנוטיפ Viroseq והשיטה בבית באמצעות פנל של דגימות הניתן על ידי ANRS.

Watch this Scientific Journal Video about An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings at JoVE.com

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

בדיקת עמידות לתרופות ל-HIV-1 אנשים נגועים נכשלו טיפול תרופתי (ART) יכולה להדריך את הטיפולים בעתיד ולשפר את תוצאות טיפול. תוצאות בריאותיות אופטימיזציה של פרט ואוכלוסייה בשכיחות איידס גבוהה, אך משאב מוגבל הגדרות סופו של דבר תדרוש גנוטיפ עמידות לתרופה במחיר סביר ונגיש ושיטות פרשנות.

שיטת ניטור משתלמת HIV-1 תרופות התנגדות להגדרות משאב מוגבלת

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

an-affordable-hiv-1-drug-resistance-monitoring-method-for-resource

Research

JoVE Journal

Medicine

18.4K Views.  University of KwaZulu-Natal, Durban, South Africa.  בדיקת עמידות לתרופות ל-HIV-1 אנשים נגועים נכשלו טיפול תרופתי (ART) יכולה להדריך את הטיפולים בעתיד ולשפר את תוצאות טיפול. תוצאות בריאותיות אופטימיזציה של פרט ואוכלוסייה בשכיחות איידס גבוהה, אך משאב מוגבל הגדרות סופו של דבר תדרוש גנוטיפ עמידות ל...

Video: An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

שיטה לפיתוח נגד סרטן רומן והתרופות באמצעות Explants גידול של דגימות כירורגי


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

מודל Murine orthotopic של אדם סרטן ערמונית גרורה

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

טכניקות לעיני עיבוד מושתלים בתותב רשתית למותאם למקום Histopathological ניתוח: חלק 2 Epiretinal שתלים עם נעצי רשתית

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Encapsulation תרמוגנית Preadipocytes להשתלה לבסיס מיון רקמת שומן

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

הטמעה של<em&gt; במבחנה</em&gt; תרופות מבחני התנגדות: למקסם את הפוטנציאל לחשיפת מנגנוני התנגדות קלינית רלוונטיים

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Bioluminescence-Based Tumor Quantification Method for Monitoring Tumor Progression and Treatment Effects in Mouse Lymphoma Models

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.

Bioluminescence imaging is a well-known tool for localizing tumors and metastases, but quantification of these images often requires complex calculations and particular instruments. We describe the easy-to-use luminoscore method, based on precise acquisition conditions, requiring no calculations, and enabling tumor burden and treatment response to be monitored in mouse models.

פליטת אור מבוסס שיטת כימות גידול עבור התקדמות גידול ניטור שפעות טיפול מודלים לימפומה העכבר

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

שיטה משופרת עבור אינטובציה מהירה של קנה הנשימה של עכברים

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, pancreatitis, and pancreatic cancer. All three of these diseases mark active areas of study, not only to develop immediate therapy, but also to better understand their pathophysiology. There are few tools to further these areas of study. Pancreatic duct infusion is an important technique that can allow for lineage tracing, gene introduction, and cell line-specific targeting. The technique requires the intricate dissection of the second portion of the duodenum and ampulla, followed by the occlusion of the bile duct and the cannulation of the pancreatic duct. Although the technique is technically challenging at first, the applications are myriad. Ambiguity in the specifics of the procedure between groups highlighted the need for a standard protocol. This work describes the expression of a green fluorescent protein (GFP) within the pancreas after the pancreatic duct infusion of a viral vector expressing GFP versus a sham surgery. The infusion and therefore expression is specific to the pancreas, without expression present in any other tissue type.

Pancreatic duct infusion is an important technique that can allow for lineage tracing, gene introduction, and cell line-specific targeting. A pancreatic duct infusion technique for drug and viral delivery to pancreatic cells is presented here.

עירוי צינור הלבלב: שיטה יעילה וסלקטיבית של סמים ומשלוח ויראלי

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

שיטת אופטימיזציה LC-MS/MS לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות קליניות של Ivacaftor, שלה מטבוליטים העיקריים Lumacaftor של נוזלים ביולוגיים של חולי סיסטיק פיברוזיס

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...