Name: improved method for the establishment of an in vitro blood-brain barrier model based on porcine brain endothelial cells
Uploaded: 2017-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells at JoVE.com

המחברים רוצה להכיר אליזבת הלנה Bruun, שרה כריסטין כריסטנסן ו נילס מ Kristiansen לקבלת סיוע טכני, קרן לונדבק להעניק מספר R155-2013-14113.

מחברי הדו ח אין ניגוד אינטרסים.

טיהור והתפשטות של pBEC
במהלך ההליך טיהור, שלבים קריטיים כוללות הסרה מהירה ויעילה של קרומי המוח והפרדה של חומר לבן ואפור, וזה חשוב עבור טיהור ביבול ובאיכות טוהר ועבור הקמת הדגם המתאים. לדגם הציג במבחנה BBB באמצעות pBECs, יש שיפור ואנו פשוטה הליך טיהור בהתבסס על המגון מכני של החו?...

המבנה התאי ותפקוד מחסום הדם - מוח
-הממשק של הדם ומרכזי מערכת העצבים (CNS), BBB משמש אתר רגולטורי המפתח לשליטה homoeostatic של microenvironment מערכת העצבים המרכזית, שהוא חיוני לתפקוד תקין והגנה של מערכת העצבים. האתר של BBB הוא התאים אנדותל המצפים לומן כלי דם. נימים המוח, תאי אנדותל ליצור מורכבות המערכת צמתי צר, ביטוי חזק מקוטב דפוסים של מובילי זרם, בזרימת מסוים להבטיח תחבורה מולקולרי ספציפי מאוד בין הדם של המוח 1. מרכיביה המבניים של מתחמי צמוד לצומת לכלול חלבונים מן המשפחה occludin, claudin, zonula occludens (זואי) חלבונים, cingulin, ומקושרת מולקולות אדהזיה מהחיבור (ריבות). Claudin 5 חשוב במיוחד ההגבלה מהחיבור paracellular. תחזוקה של פנוטיפ אנדותל האופיינית הזאת BBB לערב דינמי אינטראקציות עם התאים שמסביב, כולל pericytes, האסטרוציטים, נוירונים, את הקרומים המרתף, אשר יחד עם המוח אנדותל תאים טופס נוירו-וסקולריים יחידה (NVU)2,3. המנגנונים המעורבים אינטראקציות אלה אינם עדיין לגמרי מובנים, אבל כוללים חילופי אותות כימיים בין תאים, אשר מאפשר אפנון של BBB חדירות בטווח הקצר ומשרה BBB לטווח ארוך כולל4. האסטרוציטים במיוחד ידועים לתרום ותפקיד תאי אנדותל המוח, הם מקור של גורמים רגולטוריים כגון פקטור (להשפיע על מחנה תאיים) גליה נגזר neurotrophic5, בסיסי פיברובלסט גורם הגדילה6, הידרוקורטיזון7, הפיכת גורם הגדילה β (TGF-β)8. עם זאת, ההשפעה של TGF-β, כבר התווכחו9.
In Vivo במבחנה BBB
מחקרים in vivo להמשיך לספק מידע רב ערך על BBB ביולוגיה. עם זאת, מודלים התרבות התא יכול לספק תובנות נוספות ומהווים כלים שימושיים להבנת היבטים פונקציונליים המולקולריים מפורט של BBB על בריאות ומחלה. יחסי גומלין מורכבים סוגי תאים ומרכיבים של BBB אמנם קשה להשיג באופן מלא דגמים במבחנה , היה, מאז הטיהור הראשון של תאי אנדותל המוח ויישום של אלה בתרבויות-מונו 10 , 11 , 12, פיתוח נרחב של תהליכי טיהור, תנאי הגידול של BBB תא מודלים תרבות, וכתוצאה מכך דמיון גדול עד המחסום ויוו . הדגמים BBB נפוץ במבחנה מבוססים על ראשי תאים של מכרסמים, חזירי, ומקור שור ועל שורות תאים מונצח. כל דגם כולל החסרונות והיתרונות שונים. השוואה ומודל בחירה, סמני אימות כגון הביטוי של BBB אנזימים, שנאים, קולטנים חלבונים מבניים משמשות ליצירת סקירות ויצר מודלים הנוכחית1.
מטרת הפרוטוקול
תכונה חשובה אחת של BBB מכשול מהבלוטות ומניעת TEER גבוהה, אך מספר גדול של הדגמים זמינים ואינם משקפים היטב את רמות ויוו . שילוב תרומות פיתוח ואופטימיזציה של מספר מעבדות, המטרה של פרוטוקול זה היא להציג שיטה להקמת גבוהה TEER במבחנה BBB מודל המבוסס על pBECs ראשי MC עם או בלי ACM, או NCC עם ראשי האסטרוציטים של עכברוש או מקור חזירי. הליכים שהוחל והקמת המודל כוללות מאמצים לחסל תאים מזהמים וכדי לשפר את הבידול של pBECs לתוך הפנוטיפ BBB. עבודה זו הובילה להקמת מודלים TEER אמינים, עם חדירות נמוכה paracellular וביטוי פונקציונליים טוב של מפתח חלבונים מהחיבור חזק, שנאים, קולטנים. עם זאת, כפי האסטרוציטים גורם תורם פנוטיפ תא אנדותל המוח, שלושה מצבים שונים של תרבות מייצגים שלוש פנוטיפים שונים של תאי אנדותל המוח. מודל NCC שימושית במיוחד עבור מחקרים של מנגנונים מיוחדים מסוימים מעורב גילוי תרופות, מחקרים תחבורה וסחר תאיים, כמו גם עבור חקירת האינטראקציות תא-תא איפה ביטוי מכסימלי של BBB תכונות יתרון.
מקור והיסטוריה של הפרוטוקול
המודל pBEC המתוארים כאן מבוסס במידה רבה על המודל חזירי שפותחה במעבדות Eisai (לונדון) על ידי ד ר לואיס מורגן ועמיתיו, חישבת בהתבסס על מוצלחת קודמת המוח שור תא אנדותל דגם13. שיטת ההכנה התא המקורי היה רשתות שינוי סינון בשני שלבים באמצעות ניילון כדי לתפוס את microvessels, ואחריו צעד subculturing כדי לשפר את טוהר. בפיתוח קודמות של השיטה, אטימות פנוטיפ ומכשול BBB אופטימלית הושגו על ידי גידול בינוני שהושלם, כולל ACM. שינויים ותיקונים נוספים לשיטת נעשו על ידי ר' סקינר במעבדה של פרופ ' / ח' ש רותוול מנצ'סטר בבריטניה14,15. השיטה אומצה על ידי המעבדה אבוט, אשלגן כלורי לונדון, שם Patabendige עשה את זה משמעותי יותר פשוט להכין על ידי הימנעות משימוש האסטרוציטים או ACM בהריגת תאים מזהמים כמו pericytes עם puromycin. העיתונים הראשון אישר כי דגם MC נשמר כמה תכונות חשובות של ה- ויוו BBB, כולל צמתי צר יעיל, מערכות תחבורה ממברנה קולטן בתיווך transcytosis16,17 , 18 , 19 , 20. אח כ ס Yusof שוב נבדק תרבות משותפת אסטרוציט ונמצא זה לשפר באופן משמעותי TEER, אז זה הגרסה המועדפת כיום בשימוש המעבדה אבוט21. המודל כבר עכשיו בהצלחה להעביר את נילסן מ מעבדה בארהוס, איפה היו שינויים ותיקונים נוספים הציג (פרוטוקול זה), כולל גריי מפשט משנה החילוץ, באמצעות שלב סינון רשת אחת בלבד, וצעד ציפוי מסננים יחידה שילוב של קולגן, fibronectin. ההליך שימושית עבור בידוד של חזירי האסטרוציטים (פרוטוקול זה) התבססה על פרוטוקולים שפותחה על ידי המעבדה טי Moos באולבורג, שתואר על ידי תומסון ואח22. את TEER ומאפיינים אחרים של המודל שנוצר ב לונדון וב אהרחוס דומים, אשר מקנה בטחון לרעיון המודל בקלות מועברים בין מעבדות ומגיב היטב כדי התבוננות מעמיקה, רציונליזציה של שיטת השלבים. אכן, Yusof ס הקימה כעת דגם MC במדינה טרופית (מלזיה)23, אשר מעורבים התאמה נוספת עבור תנאים מקומיים ומקורות רקמות.
יתרונות על פני שיטות אלטרנטיביות וכיום הקימה מודלים
בהשוואה לתאי אנדותל מוח של פרה ומקור מכרסמים, pBECs לספק את היתרון של בעל שיעור נמוך יותר של אובדן ויוו BBB פנוטיפ בעקבות בידוד24. יתר על כן, pBECs מסוגלים להרכיב את המחסומים אנדותל צר יחסית, אפילו כאשר גדל ב- MC (Ω 800 ס מ2)16 לעומת רמות בדרך כלל דיווחו על monolayers של שורות תאים כגון bEND.5 ו- bEND.3 (50 Ω ס מ2) 25 , 26 , 27, cEND (300-800 Ω ס מ2)28,29,30, ואת cerebEND (500 Ω ס מ2)29,31,32, ומוח ראשוניים תאי אנדותל של העכבר (100-300 Ω ס מ2)האס. אס = "xref" > 33,34,35,36 , עכברוש (100-300 Ω ס מ2)37,38. עם זאת, TEER מראה תלות על ההליכים טיהור ותרבות. ברוב המקרים, התוספת של ACM או תרבות משותפת עם האסטרוציטים מראה השפעות המבדילים על תאי אנדותל ועלייה ב אטימות של שכבות אנדותל1. ובכל זאת, עם מאמצים כדי למטב את התנאים culturing, רק המודלים מבוססי שור הראו ערכי TEER להשוות המודלים מבוססי-חזירי (ממוצע של 800 Ω ס מ2 ב- MC, עד 2500 Ω ס מ2 בתרבות שיתוף אסטרוציט)13 ,39,40,41,42,43,44,45. כמו הדגמים בהתבסס על מוח ראשוניים שור תאי אנדותל הראו וריאציות גדול, בין ובתוך מעבדות14,45,46,47,48. הפארמצבטית יכול להיות בעיה. במודל pBEC שדווחו פה, המעבדות התורמים השיגו TEER דומה מאוד וערכי חדירות paracellular עם השתנות נמוך, והן בין מעבדות. ומכאן, זה צריך להיות אפשרי עבור מעבדות אחרות להקים מודל חזקים עם השתנות נמוך באמצעות השיטה המוצגת כאן. בנוסף ויוצרים שכבות אנדותל חזק, מודלים עם pBECs יש בעבר מאומתים על-ידי ביטוי של חלבונים צומת חזק, מובילי BBB פונקציונלי, רצפטורים, אנזימים והפגינו התאמה למגוון רחב של מחקרים15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. יתר על כן, transcriptome שלא פורסמו נתונים על תרבויות המשנה pBECs מציגה פרופיל הצפוי של מובילי BBB, קולטנים (שלא פורסמו תוצאות, נילסן. et al.).
המודל מבוסס על חזירי BBB יש יתרון נוסף כמו הגנום, אנטומיה, פיזיולוגיה, ומשקפים התקדמות המחלה של החזיר הביולוגיה האנושית ברמה גבוהה מאשר דגמים אחרים הוקמה60, אשר הם חיוביים כולל בתעשייה הפרמצבטית. כמו חזירי המוח הם תופעת לוואי נפוצה של תעשיית הבשר, הם מהווים מקור נגיש בקלות של המוח תאי אנדותל, צמצום מספר בעלי חיים לצורך הניסויים, וגם לספק תשואה גבוהה טיהור מהמוח חזירי אחד. למרות טיהור והטיפוח של תאים העיקרי הוא במידה מסוימת זמן רב ודורש מומחיות התקינה מתארגנת המודל, ראשי תאים מפיקים הדגמים BBB הכי אמין. שורות תאים מונצחים לא יכול להיות תחליף, כמו תכונות חשובות כגון מכשול אטימות, פרופילי ביטוי טרנספורטר, ורגולציה microenvironment אינן משקפות את ממצאי הניסוי ויוו61, 62. מודלים במבחנה לספק יתרון לחיות תאים הדמיה עם רזולוציה גבוהה יותר, כך ויזואליזציה של תהליכים תאיים מאפשר מתן אפשרות גישה בסמיכות לתאי שנדגמו או שנצפה, באמצעות מטרות עם הגדלה גבוהה יותר, איכות אופטית טובה יותר63. זה אינו המקרה לשימוש של מיקרוסקופ שני הפוטונים בבעלי חיים. יתר על כן, במבחנה מודלים מספקים את היכולת transfect תאים, המאפשר ויזואליזציה של חלבונים מתויג והחקירה של סחר שלהם.
יישומים של המודל
הפונקציה של BBB אינו קבוע, יכול להיות מאופנן באופן דינמי פיזיולוגיה והן פתולוגיה. מחלות נוירולוגיות רבות, כולל ניווניות, במחלות דלקתיות וזיהומיות, הפרעה, חדירות מוגברת של BBB נצפית64,65,66,67 . על מנת להפחית ולמנוע התקדמות המחלה ונזק עוקבות, זיהוי ואפיון של המנגנונים המולקולריים שבבסיס של האפנון של BBB הם בעלי חשיבות גדולה. בהקשר זה, מודלים אמינים במבחנה יש ביקוש גבוה על ידי תעשיית התרופות, יתר על כן תפקיד חשוב בחיזוי BBB החדירות של סמים על מערכת העצבים. כל במבחנה דגם הגשה המסך חדירות צריך להציג מסלול paracellular מגבילים, ארכיטקטורה התא מבחינה פיזיולוגית מציאותי, ביטוי פונקציונאלי של טרנספורטר מנגנונים68. הפגינו ב מחקרים קודמים16,17,57, ועל ידי paracellular חדירות וביטוי של טי-ג'יי, ג'יי חלבונים כאן, המודל הציג עונה על כל הקריטריונים האלה ומתאים לטווח של BBB מחקרים בולטים בשני פיזיולוגיה נורמלי בפתולוגיה. נקודות החוזק של שיטת טיהור וטיפוח הציג כוללים שילוב של פשטות, הפארמצבטית ואת היכולת לכלול astrocytic להשפיע בדגם שנוצר עמיד ואמין גבוהה TEER במבחנה BBB. בשביל זה מטרה, האסטרוציטים של חזירי ואלשין מקור הוכחו להגדיל את ותפקיד BBB של pBECs בצורה דומה22.

<table><tbody><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Low Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Plasma derived serum (PDS)</td><td>First Link UK Ltd.</td><td>60-00-89</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10-270-106</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>8-CPT-cAMP</td><td>Biolog</td><td>C010</td><td></td></tr><tr><td>RO 20-1724</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8279</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Sulfate</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34896</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>VWR</td><td>20,824,296</td><td>Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH</td></tr><tr><td>DNAse 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase CLS2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td>Made with Elga System</td></tr><tr><td>T75 flasks</td><td>Thermo Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts)</td><td>Costar</td><td>CLS3401</td><td>12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 &amp;mu;m polycarbonate membrane</td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tubes</td><td>Cellstar</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tubes</td><td>Cellstar</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Cryo vials</td><td>Thermo Scientific</td><td>377224</td><td></td></tr><tr><td>500 ml bottle</td><td>Thermo Scientific</td><td>159910/159920</td><td></td></tr><tr><td>Scalpels</td><td>Swann-Morten</td><td>REF0211</td><td>Type 24</td></tr><tr><td>Tissue homogenizer</td><td>Sigma</td><td>D9188</td><td></td></tr><tr><td>140 &amp;mu;m filters</td><td>MERCK</td><td>NY4H04700</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m filters</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>EndOhm chamber system</td><td>World Precision Instruments</td><td>ENDOHM-12</td><td>EndOhm chamber for 12mm Culture Cups</td></tr><tr><td>EVOM2 electrode system</td><td>World Precision Instruments</td><td>300523+STX100C</td><td>TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair</td></tr><tr><td>Long needle</td><td>Sigma</td><td></td><td>Attach to a syringe</td></tr><tr><td>Fine-tip curved forceps</td><td>KLS Martin</td><td>12-409-12-07</td><td></td></tr><tr><td>Broad tip forceps</td><td>VWR</td><td>82027-390</td><td></td></tr><tr><td>Filter holder</td><td>MERCK Milipore</td><td>Swinnex-47</td><td></td></tr><tr><td>50 ml syringe</td><td>Braun</td><td>4617509F</td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringe</td><td>Terumo</td><td>SSt20ESI</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Occludin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab31721</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anti-p120 Catenin antibody</td><td>BD Transduction laboratories</td><td>610133</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anti-ZO-1 antibody</td><td>Invitrogen</td><td>61-7300</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anti-Claudin 5 antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4502981</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568</td><td>Thermo Scientific</td><td>A10042</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21202</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEC100X250UC</td><td>0.15&amp;micro;l/ml final working conc</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow</td><td>Sigma</td><td>L0144</td><td>10 &amp;micro;g/ml final working conc</td></tr></tbody></table>

improved method for the establishment of an in vitro blood-brain barrier model based on porcine brain endothelial cells

המטרה של פרוטוקול זה מציג את הליך בלתי אופטימליים לטיהור ודה הטיפוח של pBECs ולהקים במבחנה מחסום הדם - מוח (BBB) מודלים בהתבסס על pBECs, מונו-תרבות (MC), MC ממוזגים אסטרוציט בינונית (ACM), ו תרבות משותפת (NCC) עם האסטרוציטים של חזירי ללא מגע או עכברוש מקור. pBECs היו מבודדים ותרבותית של שברי נימים מ cortices המוח של חזירים במשפחה בת 5-6 חודשים. קטעים אלה היו מטוהרת על-ידי הסרת זהיר של קרומי המוח, בידוד המגון של החומר האפור, סינון, עיכול אנזימטי צנטריפוגה. לחסל עוד תאים מזהמים, שברי נימי היו תרבותי עם puromycin המכילות בינוני. כאשר 60-95% confluent, pBECs גדל מן השברים נימי היו passaged את קרום חדיר המסנן מוסיף והקימו במודלים. כדי להגדיל את מחסום מהבלוטות ומניעת BBB פנוטיפ אופייני של pBECs, התאים שטופלו הגורמים בידול הבאים: ממברנה permeant 8-CPT-מחנה (מחנה מקוצר כאן), הידרוקורטיזון, מעכב phosphodiesterase, RO-20-1724 (RO). ההליך בוצע על פני תקופה של 9-11 ימים, בעת יצירת מודל NCC, האסטרוציטים היו תרבותי 2-8 שבועות מראש. ההקפדה ההליכים המתוארים בפרוטוקול אפשרה את הקמת שכבות אנדותל עם חדירות paracellular מוגבלת מאוד, עם NCC המודל מראה על ממוצע transendothelial ההתנגדות החשמלית (TEER) 1249 ± Ω 80 ס מ 2, ו paracellular חדירות (Papp) עבור לוציפר צהוב 0.90 10-6 ± 0.13 10-6 ס מ סק-1 (זאת אומרת ± SEM, n = 55). הערכה נוספת של פנוטיפ pBEC הזה הראה ביטוי טוב claudin חזק חלבונים מהחיבור 5, זואי-1, occludin ו adherens של catenin p120 של צומת חלבון. המודל המוצג יכול לשמש למגוון רחב של מחקרים של BBB על בריאות ומחלה, עם החדירות paracellular מאוד מגבילה, מודל זה מתאים ללימודי תחבורה, וגדילת.

הקמתה של הדגמים במבחנה BBB
בשיטה שלו שהוצגו, אופטימיזציה, טיפוח של pBECs והקמת מערכת הוספה קרום חדיר עם MC או בלי ACM או NCC עם האסטרוציטים (איור 1) בוצע לתקופה של 9-11 ימים (איור 2). לבחירה של תאי אנדותל, תרבות הראשונ...

Watch this Scientific Journal Video about Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells at JoVE.com

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

המטרה של הפרוטוקול היא להציג את הליך בלתי אופטימליים להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח (BBB) מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי הראשי (pBECs). המודל מראה הפארמצבטית גבוהה, אטימות גבוהה, מתאים ללימודי תחבורה, וגדילת גילוי סמים.

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

improved-method-for-establishment-an-vitro-blood-brain-barrier-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

14.7K Views.  Aarhus University. המטרה של הפרוטוקול היא להציג את הליך בלתי אופטימליים להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח (BBB) מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי הראשי (pBECs). המודל מראה הפארמצבטית גבוהה, אטימות גבוהה, מתאים ללימודי תחבורה, וגדילת גילוי סמים.

Video: Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Bioengineering

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם מחסום דם מוח

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Neuroscience

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

הדור של המוח האנושי מבוסס על-ידי שבב דם-מחסום

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Developmental Biology

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is characterized by an interruption in blood supply to the brain leading to cell death and cognitive dysfunction. During and after ischemic stroke, blood-brain barrier (BBB) dysfunction facilitates injury progression and contributes to poor patient recovery. Current BBB models primarily include endothelial monocultures and double co-cultures with either astrocytes or pericytes.
Such models lack the ability to fully imitate a dynamic brain microenvironment, which is essential for cell-to-cell communication. Additionally, commonly used BBB models often contain immortalized human endothelial cells or animal-derived (rodent, porcine, or bovine) cell cultures that pose translational limitations. This paper describes a novel well-insert-based BBB model containing only primary human cells (brain microvascular endothelial cells, astrocytes, and brain vascular pericytes) enabling the investigation of ischemic brain injury in vitro. 
The effects of oxygen-glucose deprivation (OGD) on barrier integrity were assessed by passive permeability, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements,and direct visualization of hypoxic cells. The presented protocol offers a distinct advantage inmimicking the intercellular environment of the BBB in vivo, serving as a more realistic in vitro BBB model for developing new therapeutic strategies in the setting of ischemic brain injury.

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Here, we describe the method for establishing a triple cell culture model of the blood-brain barrier based on primary human brain microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. This multicellular model is suitable for studies of neurovascular unit dysfunction during ischemic stroke in vitro or for the screening of drug candidates.

מודל תלת-תאי ראשוני של מחסום הדם-מוח האנושי לחקר שבץ איסכמי במבחנה

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is ...

Biochemistry

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Immunology and Infection

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the brain. The BBB is mainly formed out of endothelial cells embedded in collagen IV and fibronectin-rich basement membranes. Several pathologies result from dysfunction of the BBB followed by microbial traversal, causing diseases such as meningitis. In order to test the effect of multiple parameters, including different drugs and anesthetics, on the permeability of the BBB we established a novel human cell culture model mimicking the BBB with human brain microvascular endothelial cells. The endothelial cells are grown on collagen IV and fibronectin-coated filter units until confluence and can then be treated with different compounds of interest. In order to demonstrate a microbial traversal, the upper chamber with the apical surface of the endothelial cells is inoculated with bacteria. After an incubation period, samples of the lower chamber are plated on agar plates and the obtained colonies are counted, whereby the number of colonies correlate with the permeability of the BBB. Endogenous cellular factors can be analyzed in this experimental set-up in order to elucidate basic cellular mechanisms of the endothelial cells contributing to the BBB. In addition, this platform allows performing a screen for compounds that might affect the permeability of the endothelial cells. Finally, bacterial traversal can be studied and linked to different pathologies, such as meningitis. It might be possible to extend the model and analyze the pathways of the bacteria through the BBB. In this article, we provide a detailed protocol of the described method to investigate the permeability of the BBB.

The human blood-brain barrier selectively prevents penetration of hydrophilic molecules and pathogens into the brain. Several pathologies, including meningitis and postoperative delirium, are associated with an increased permeability of the blood-brain barrier. Here, we describe an endothelial cell culture model to test the barrier permeability by microbial traversal.

ניתוח חדירות של מכשול המוח-הדם על ידי חציית מיקרודם באמצעות תאי מיקרו-כלי

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

מודל מחסום דם-מוח תלת-ממדי המופק מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting the brain from pathogens. The inherent barrier properties of the BBB pose a challenge for therapeutic drug delivery into the CNS to treat neurological diseases. Impaired BBB function has been related to neurological disease. Cerebral amyloid angiopathy (CAA), the deposition of amyloid in the cerebral vasculature leading to a compromised BBB, is a co-morbidity in most cases of Alzheimer&#39;s disease (AD), suggesting that BBB dysfunction or breakdown may be involved in neurodegeneration. Due to limited access to human BBB tissue, the mechanisms that contribute to proper BBB function and BBB degeneration remain unknown. To address these limitations, we have developed a human pluripotent stem cell-derived BBB (iBBB) by incorporating endothelial cells, pericytes, and astrocytes in a 3D matrix. The iBBB self-assembles to recapitulate the anatomy and cellular interactions present in the BBB. Seeding iBBBs with amyloid captures key aspects of CAA. Additionally, the iBBB offers a flexible platform to modulate genetic and environmental factors implicated in cerebrovascular disease and neurodegeneration, to investigate how genetics and lifestyle affect disease risk. Finally, the iBBB can be used for drug screening and medicinal chemistry studies to optimize therapeutic&#160;delivery to the CNS. In this protocol, we describe the differentiation of the three types of cells (endothelial cells, pericytes, and astrocytes) arising from human pluripotent stem cells, how to assemble the differentiated cells into the iBBB, and how to model CAA in vitro using exogenous amyloid. This model overcomes the challenge of studying live human brain tissue with a system that has both biological fidelity and experimental flexibility, and enables the interrogation of the human BBB and its role in neurodegeneration.

מחבר זרקור: גישה מותאמת אישית לחקר מחלת אלצהיימר באמצעות מודל מחסום דם-מוח במבחנה 

The blood-brain barrier (BBB) has a crucial role in sustaining a stable and healthy brain environment. BBB dysfunction is associated with many neurological diseases. We have developed a 3D, stem-cell-derived model of the BBB to investigate cerebrovascular pathology, BBB integrity, and how the BBB is altered by genetics and disease.

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ

הגדרה למעלה

הדור של המוח האנושי מבוסס על-ידי שבב דם-מחסום

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

מודל תלת-תאי ראשוני של מחסום הדם-מוח האנושי לחקר שבץ איסכמי במבחנה

ניתוח חדירות של מכשול המוח-הדם על ידי חציית מיקרודם באמצעות תאי מיקרו-כלי

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות