אנו מודים לג פרק לקריאת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי NIAMS תחת מספר פרס K01AR061434 ואגודת מלגת פרס לוקמיה ולימפומה (5,127-09) לשארית פליטה ובמענקים מהמוסד הלאומי לבריאות לCPL ו-DTS התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

1. עכברים ואכשור קד הערה: כל העכברים נשמרו בתנאי הפתוגן ללא וכל הפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) בבית החולים הכללי מסצ&#39;וסטס. כל הניתוח צריך להתבצע בתנאים סטריליים באמצעות ציוד סטרילי autoclaved. 15 MX1-Cre, Rosa26-loxP-stop-loxP-EYFP (Rosa-YFP), וRosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Rosa-עגבניות), היו נרכש ממעבדות ג&#39;קסון. עכברי osteocalcin-GFP נמסרו על ידי ד&quot;ר הנרי קרוננברג. לניתוח כמותי של הגירת OSPC ושגשוג in vivo, עכברי MX1-Cre + רוזה-YFP + (צבע כתב יחיד) היו בשימוש. למעקב מפורט יותר של הבידול שלהם לתוך osteoblasts osteocalcin בוגר +, השתמשנו trigenic MX1-Cre + רוזה-עגבניות + OCN-GFP +עכברים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתייג MX1 + תאי in vivo, להכין חומצת polyinosinic-polycytidylic (PIPC, 2.5 מ&quot;ג / מיליליטר) בפתרון PBS סטרילי ומזריק 200 μl ל20 גרם של עכבר + כתב MX1-Cre intraperitoneally פעם אחת בכל יום אחר ל10 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחסל תאי MX1 + hematopoietic תושב, להקרין עכברים עם מנה בודדת של 9.5 Gy. לאחר 24 שעות של קרינה, תאים להשתלה מסוג בר מח עצם (1x10 6 תאים / עכבר) לווריד 16. הערה: מאחר ותאי MX1 המושרים כוללים תאי hematopoietic וosteoclasts נגזר hematopoietic, חיסול + תאי hematopoietic MX1 משפר את איכות ההדמיה ולכמת את תאים + osteogenic MX1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השתלת מח העצם, לעקוב אחר בעלי חיים לארבעה עד שישה שבועות כדי להשיג אכלוס מוצלח של תאים במח תורם. </li></ol> 2. מולהשתמש בתכשיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר על ידי זריקת intraperitoneal של 50 μl של קטמין / xylazine (100 מ&quot;ג / קילוגרם, מ&quot;ג xylazine 12 / קילוגרם משקל גוף) באמצעות הליך שאושר IACUC. הערה: משך ההשפעה ניתן להארכה למנה נוספת של קטמין / xylazine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע אם העכבר הוא בהרדמה מלאה על ידי חוסר התגובה לבוהן ו / או צובט זנב. (אופציונאלי) כאשר העכבר הוא הרדים, לאבטח את מסכת גז isoflurane מעל האף על ידי מקליט. התאם את הרמה של isoflurane כדי להבטיח את החיה היא מסוממת באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפ שיער הקרקפת בעזרת גוזם חשמלי או מספריים קטנים. הסר את שברי השיער ולעקר את העור החשוף עם 70% ספוגית אלכוהול. החל ג&#39;ל המדמיע על מנת למנוע התייבשות של קרנית. </li></ol> 3. Microfracture פגיעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הבטחת בעלי החיים הוא מסוממים לחלוטין, לעשות חתך בצורת אות הפוך בודד כדי לפתוח את עור הקרקפת. בקצרה, לעשות חתך רוחבי ראשון (סנטימטר פחות מ 1) starting מאוזן אחת לאוזן אחרת. הפעל ~ 60 מעלות וממשיכים לחתוך לכיוון האף עד ~ 2-3 מ&quot;מ מאף. הערה: חתך זה ממזער את היווצרות רקמות צלקת מעל לאזור להיות צילם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את דשי עור על ידי משיכת כלפי הצדדים עם מלקחיים. שני עצמות קדמיות והצומת של תפרי sagittal ועטרה צריכים להיות ברורות חשופות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את פני השטח הפתוחים על ידי שטיפה עם PBS סטרילי ומנגב בעדינות עם מטליות גזה או צמר גפן סטרילי עד שכל שערות השייר בוטלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור microfractures על calvarium, להחזיק את ראש העכבר ביד אחת ומחט G 30 עם יד אחרת. הפוך מיקרו לנקב (פצע ~ 0.2 מ&quot;מ קוטר עם &lt;עומק 1 מ&quot;מ) על העצם הפרונטלית השמאלי בסמוך לצומת של תפרי sagittal ועטרה על ידי החדרת קצה מחט 30 G עם לחץ עדין ומתפתל בתנועה. זהירות: זה קריטי כדי למנוע את המחט לחדור לתוך המוח, ובכך לצמצם bleeding ונזק לרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור למחט גדולה יותר (25 20 או G) ולהרחיב את החור לנקב על ידי סיבוב המחט (~ קוטר 0.5 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.3-3.5 ליצור לנקב שני על העצם החזיתי הנגדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחוק את הכתמים שנפגעו מצניחה המתמשכת של PBS עד שהדימום ייעצר. הערה: הדימום באתרים שבר יפריע להדמיה מתאימה ולגרום להיווצרות צלקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ירידה של תמיסת מלח פיזיולוגית או 2% Methocel סטרילי על הגולגולת כדי למנוע התייבשות. שים לב: אין לאפשר למשטח הגולגולת לייבוש, אשר יפחית את בהירות תמונה. חשוב להשתמש בכמות מספקת של ג&#39;ל או תמיסת מלח כדי לכסות את האזור. </li></ol> 4. הדמיה Intravital <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) לפני ההדמיה, כמה עכברים מוזרקים עם צבע של כלי דם כדי להמחיש את כלי הדם. הזרק רטרו orbitally עם 20 μl של Qtracker הלא ממוקד 705 (2 מיקרומטר פתרון ב50 מ&quot;מ חיץ borate) בדילול מלא ב80 מl של PBS. השתמש במזרק אינסולין כדי לצמצם את הבזבוז מגיב. אם האות היא לא בהירה מספיק, סכומים נוספים ייתכן שיידרשו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הסורק. הערה: סורק לייזר המבוסס על מצולע מאפשר רכישה בו זמנית רב ערוצית תמונה בשיעור וידאו (30 מסגרות לשנייה). סריקת שיעור וידאו היא מאוד חשובה עבור הדמיה חיה חיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הלייזר רב פוטון (טיטניום FEMTO השני: לייזר ספיר). קבע את אורך הגל ל880 ננומטר ולהתאים את הכוח להדמית דור שני הרמוני (440 ננומטר) של העצם. לעירור ה-GFP וtdTomato, הדלק את ננומטר 491 ו561 הלייזרים של מצב מוצק ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל PMT גלאים (צינור מכפיל) עבור כל אות (± מסנן להקה עוברת 20 ננומטר 435 לדור שני הרמוני, ± מסנן להקה עוברת 19 ננומטר 528 עבור ה-GFP, ו590 ± 20 לtdTomato.) (אופציונאלי) השתמש בליזר הליום ניאון 638 ננומטר וPMT עם ± מסנן להקה עוברת 27.5 ננומטר 695 לזהות Qtracker 705 אות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Placדואר את החיה על במה מיקרוסקופ ממונע XYZ ציר. שמור את העכבר בעמדה הכי נוחה עם כרית חימום חשמלית כדי לעזור לשמור על טמפרטורת גוף (זה מפחית את הסיכון של אובדן של בעלי חיים). להשתמש בקלטת כדי להחזיק את העכבר כדי למזער את התנועה במהלך הדמיה וכדי לשמור על אזור הדמיה כאופקית ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ירידה של ג&#39;ל החם 2% methylcellulose או תמיסת מלח פיזיולוגית בגולגולת, כדי למנוע התייבשות. שים את מכסה זכוכית באזור ההדמיה. השתמש בעדשה בהגדלה נמוכה (30x אובייקטיבי מים טבילה עם 0.9 NA) כדי לסרוק את מכסה הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בבקר XYZ הציר, למצוא את פני השטח של מכסה גולגולת על ידי איתור את אות SHG מעצמות ולזהות מיקום ציון דרך חשוב, כגון צומת שבין תפרי sagittal ותפרי העטרה. לרכוש תמונה ולהקליט את קואורדינטות XYZ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך לחפש את המיקום של הפגיעה על ידי התבוננות אותות SHG וקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אתרי פציעה או o האזורעניין f נמצא, לרכוש תמונה של מטוס המוקד הטוב ביותר המכיל SHG ואותות הקרינה מהתאים של עניין. שמור XYZ קואורדינטות והמרחק עד לצומת של תפרי sagittal ועטרה להגדיר את מיקומם המדויק לסיבובים הבאים של הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף מבנים הסלולר ועצם 3D של פציעת שבר, להקליט תמונות על ידי Z-ערימות (2 - 5 מרווח מיקרומטר) עם ~ 100 עומק מיקרומטר ממשטח עצם endosteal. לאחר השלמת הדמיה של צד אחד של פציעה, חוזר על תהליך הדמיה לאתרי פציעה הבאים. </li></ol> נהלי 5. ההודעה מבצע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדמיה, לשטוף אתר הדמיה עם תמיסת מלח סטרילית כדי להסיר את הג&#39;ל methylcellulose מהגולגולת. באמצעות מקלון צמר גפן סטרילי, למרוח כמות קטנה של משחה אנטיביוטית משולשת על פני השטח. כסה את שולי העור ומחדש לסגור את הקרקפת על ידי תפירה כירורגית. ניתן לעשות זאת עם חוט תפירה היפואלרגנית (polyglactin נספג suture) ו5-0 מחט תפר גודל. זהירות: טכניקת תפירה טובה ממזערת היווצרות צלקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בכל בעלי החיים בהזרקת ה-IP של 0.05-0.1 מ&quot;ג / קילוגרם עצירות כל שעות 12 ל48 שעות לאחר ניתוח. לשמור על בעלי חיים בחדר התאוששות חם עד שהם יחזרו להכרה מספקת. לאחר 3 עד 5 ימים, לפתוח מחדש את התפר ולחזור על שלבי הדמיה intravital כדי לעקוב אחר השינוי הסלולרי במהלך ריפוי שבר. </li></ol>

<ol>
	<li>Harada, S., Rodan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+osteoblast+function+and+regulation+of+bone+mass.">Control of osteoblast function and regulation of bone mass.</a> Nature. 423, 349-355 (2003).</li><li>Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+old+means+to+bone.">What old means to bone.</a> Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).</li><li>Khosla, S., Riggs, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+age-related+bone+loss+and+osteoporosis.">Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis.</a> Endocrinol Metab Clin North Am. 34, 1015-1030 (2005).</li><li>Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Latsinik, N. V., Panasyuk, A. F., Keiliss-Borok, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+responsible+for+transferring+the+microenvironment+of+the+hemopoietic+tissues.+Cloning+in+vitro+and+retransplantation+in+vivo.">Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo.</a> Transplantation. 17, 331-340 (1974).</li><li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche.">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466, 829-834 (2010).</li><li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+Bone+Marrow+MSCs+Are+Dynamic,+Fate-Restricted+Participants+in+Bone+Maintenance+and+Regeneration.">Endogenous Bone Marrow MSCs Are Dynamic, Fate-Restricted Participants in Bone Maintenance and Regeneration.</a> Cell Stem Cell. 10, 259-272 (2012).</li><li>Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+remodeling+during+fracture+repair:+The+cellular+picture.">Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture.</a> Semin Cell Dev Biol. 19, 459-466 (2008).</li><li>Holstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+affects+early+fracture+healing+in+mice.">Rapamycin affects early fracture healing in mice.</a> Br J Pharmacol. 154, 1055-1062 (2008).</li><li>Maes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast+precursors,+but+not+mature+osteoblasts,+move+into+developing+and+fractured+bones+along+with+invading+blood+vessels.">Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels.</a> Dev Cell. 19, 329-344 (2010).</li><li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells.">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30, 187-196 (2012).</li><li>O'Neill, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-computed+tomography+assessment+of+the+progression+of+fracture+healing+in+mice.">Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice.</a> Bone. 50, 1357-1367 (2012).</li><li>Kovar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared-labeled+tetracycline+derivative+is+an+effective+marker+of+bone+deposition+in+mice.">Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice.</a> Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).</li><li>Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+promotes+progress+in+orthopedic+research.">Molecular imaging promotes progress in orthopedic research.</a> Bone. 39, 965-977 (2006).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem/progenitor+cells+in+their+niche.">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457, 92-96 (2009).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269, 1427-1429 (1995).</li><li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+bone+marrow+transplantation+(BMT):+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies.">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).</li><li>Tu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osterix+overexpression+in+mesenchymal+stem+cells+stimulates+healing+of+critical-sized+defects+in+murine+calvarial+bone.">Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone.</a> Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הרגולציה של תאי גזע שלד עשויה להיות בעל חשיבות רבה להגדרת שיטות טובות יותר להשיג התחדשות עצם. הדמיה כמותי ורציפה ברמה התאית הייתה מאתגרת מבחינה טכנית. למרות שמודל שבר ארוך עצם העכבר כבר בשימוש ומתאים למחקרים ביומכנית 17 נרחב, המיקום שלה רקמות עמוקות, גודל שבר לא אחיד, נזק לרקמות רכות, ואת היישום של תופסנים ייצוב מוגבלים הדמיה intravital רציפה. הנה, שיטה כדי להתגבר על מגבלות אלה על ידי השילוב של confocal / מיקרוסקופיה intravital שני פוטונים ומודל שבר calvarial עכבר מסופקת. גישה זו עם מעקב שושלת גזע / אב osteogenic מדגימה את יכולתה בזמן אמת, בתחום ההדמיה vivo של גזע / אבות osteogenic בתיקון שבר. אתגר טכני עיקרי בשיטה זו הוא להשיג תמונות באיכות עקביות וגבוהות לאורך זמן. im באיכות גבוההגילים עם עומק הדמיה מרבי תלויים בבהירות של כתבי ניאון ומצב הרקמות של אזור ההדמיה. בנוסף, צמצום חשיפת לייזר כדי למנוע נזק וphotobleaching רקמות חשוב להדמיה רציפה לטווח ארוך. סריקה מהירה באמצעות פלטפורמת שיעור וידאו מועילה למטרה זו. אם שדה בודד מבט לא יכול לכסות את כל פציעה, האזור יכול להיות ממופה על ידי לקיחת תמונות מונטאז&#39; כדי לכסות את רוב אתרי שבר. חשוב להתפשר בין איכות Z-המחסנית ואת כמות המידע שנרכש במהלך כל פגישת ההדמיה. לדוגמא, Z-ערימות עם פרוסות רבות (לדוגמא 1-2 מיקרומטר מדרגות) וחדות גבוהה הן קלים יותר לנתח עוד יותר; עם זאת, הם דורשים חשיפת לייזר לטווח ארוך שמוביל לרמה גבוהה יותר של photobleaching מושרה לייזר. מאז רציף בתחום ההדמיה vivo של פציעת שבר מחייב פתיחה ניתוחית החוזרת ונשנית של עור ומשטח עצם,היווצרות צלקת fibrotic על פני השטח של מכסה גולגולת היא בעיה נפוצה שקוטעת הדמיה רקמות עמוקה ותשואות בתפרחת רקע גבוהה. טכניקות תפר מיומנת ודימום מינימאלי הוא קריטיות כדי להפחית היווצרות צלקת. באופן כללי, שלוש עד חמש הדמיה חוזרת זמן יכולה להיות מושגת ללא אובדן משמעותי של איכות תמונה. בהתחשב באפשרות של הדמיה חוזרת, שליטה קלה ומדויקת של גודל שבר ואת העקביות של קינטיקה תיקון, שיטה זו יכולה לספק אמצעים סבירים לבדיקת מטרות טיפוליות לריפוי שברים, אוסטאופורוזיס, והתחדשות רקמות אחרת כגון שרירי שלד.

מחלות עצם ניווניות ואיבוד מסת עצם הקשור לגיל שמוביל לסיכון גבוה לשברי אוסטיאופורוזיס הפך אתגר גדול בתחום בריאות ציבור 1. תחזוקת עצם נשלטת על ידי אוסטאובלסטים יוצרי עצם וosteoclasts resorbing עצם. פגמים של תאי עצם ויוצרים הם גורם עיקרי לאובדן עצם הקשור לגיל ומחלות עצם ניווניות 2,3. בעוד מחקר מקיף התמקד בשיפור של ריפוי שבר, את הגילוי של תרופות אמינות כדי לרפא מחלות עצם ניווניות ולהפוך את החולשה של שברי אוסטיאופורוזיס נשאר נושא חשוב. כך, לומד את המקור לתאי עצם יוצר ומנגנוני הבקרה שלהם בהתחדשות עצם ותיקון מספק תובנה רומן כדי לשפר את התחדשות שלד ולהפוך מחלות איבוד מסת עצם. קיומם של תאי mesenchymal multipotent במח עצם הוצע מבוסס על זיהוי של אוכלוסיות clonogenic שיכול שונהiate לosteogenic, שושלות adipogenic וchondrogenic vivo לשעבר 4. לאחרונה, מחקרים רבים דיווחו כי תאי גזע השלד / mesenchymal (SSCs / MSCs) הם מקור טבעי של אוסטאובלסטים והם קריטיים עבור מחזור עצם, שיפוץ ותיקון שבר 5,6 . בנוסף, מחקר התחקות השושלת שלנו גילה שיש לי osteoblasts הבוגר מחצית חיים קצרים באופן בלתי צפוי (~ 60 ימים) ומתחדשים ללא הרף על ידי תאי גזע / אביהם בשני תנאי homeostatic ותיקון שבר רגילים 6. עם זאת, זהות vivo של תאי גזע וכיצד כגון תאים מגיבות לשברי פציעה ולספק תאי יוצרי עצם אינם ברורים. לכן, חשוב לפתח שיטה שהוא מסוגל לנתח את ההגירה, השגשוג והתמיינות של SSCs / MSCs אנדוגני בנסיבות פיסיולוגיות. תיקון שבר הוא תהליך רב תאי ודינמי מוסדר על ידי מערך של מתחםציטוקינים וצמיחת גורמי 7. הגישה הפופולרית ביותר ללימודי שבר היא להשתמש במודל של בעלי חיים עם שבר ארוך עצם ולנתח את עצמות על ידי חתך עצם וטכניקות immunofluorescent 8-10. תהליך תיקון זה יכול להיות פיקוח על ידי שיטות הדמיה מרובות כולל 11 מיקרו-CT, הקרינה אינפרא אדום קרובה 12, וההדמיה chemiluminescence 13. עם זאת, לכל טכניקה מגבלות מסוימות ולא הייתה שום דרך יעילה כדי לעקוב אחר תפקוד SSCs / MSC ברמה התאית בגוף חי. לאחרונה, confocal / מיקרוסקופיה intravital שני הפוטונים פותחה ומשמשת לאיתור תאים סרטניים מושתלים ותאי גזע hematopoietic בהקשר של microenvironment מח העצם שלהם אפילו ברזולוציה תא בודד חי חיות 14. על ידי שילוב של טכנולוגיה זו עם סדרה של דגמי התחקות שושלת, היינו יכול להגדיר שתאי גזע osteogenic / אב יכולים להיות מסומנים גנטי על ידי ac החולףtivation של התנגדות myxovirus -1 אמרגן (MX1) ואת אבות מושרה MX1 יכול לשמור על הרוב של osteoblasts הבוגר לאורך זמן, אך אינו משתתף בדור של כונדרוציטים בעכבר המבוגר 6. בנוסף, החוקרים הדגימו כי OSPCs כותרת MX1 לספק את רוב osteoblasts החדש בריפוי שבר 6. כאן, תוך שימוש במודלי מעקב osteo שושלת ומיקרוסקופיה intravital, פרוטוקול מסופק להגדיר in vivo קינטיקה של + בתאי גזע / אב osteogenic MX1 בתיקון שבר. פרוטוקול זה מציע הדמיה רציפה כדי לעקוב אחר המעבר של גזע / אבות osteogenic לאתרי שבר ומדידת כמותית של התרחבות osteoprogenitor בתהליך התיקון מוקדם. גישה זו עשויה להיות שימושית בהקשרים רבים, כולל ההערכה של מועמדים טיפוליים לשיפור תיקון עצם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="829">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">C57BL/6J (H-2b)</td>
			<td style="width:140px;">Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)</td>
			<td style="width:195px;">000664</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ketamine Hydrochloride Injection</td>
			<td style="width:140px;">Bionichepharma</td>
			<td style="width:195px;">67457-001-10</td>
			<td>&#160;Vial size: 10 ml (50 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylazine Sterile Solution</td>
			<td style="width:140px;">Lloyd Inc.</td>
			<td style="width:195px;">NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Buprenorphine Hl</td>
			<td style="width:140px;">BEDFORD LAB</td>
			<td style="width:195px;">NDC 55390-100-10</td>
			<td>Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS, 1X</td>
			<td style="width:140px;">CORNING cellgro</td>
			<td style="width:195px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol)</td>
			<td style="width:140px;">Kendall WEBCOL</td>
			<td style="width:195px;">5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine Surgical Scissor</td>
			<td style="width:140px;">F.S.T</td>
			<td style="width:195px;">14568-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Extra fine Forceps</td>
			<td style="width:140px;">F.S.T</td>
			<td style="width:195px;">11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">VICRYL*Plus Suture</td>
			<td style="width:140px;">Ethicon</td>
			<td style="width:195px;">VCP490G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qtracker 705 non-targeted quantum dot</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:195px;">Q21061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methocel 2%</td>
			<td style="width:140px;">OmmiVision</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid)&#160;&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:195px;">P0913-50MG</td>
			<td>100 &#956;l (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers</td>
			<td style="width:140px;">Spectra Physics</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser</td>
			<td style="width:140px;">Cobolt AB</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Radius-635 HeNe laser</td>
			<td style="width:140px;">Coherent</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequential in vivo imaging of osteogenic stem/progenitor cells during fracture repair

עצם מתהפך ברציפות, והוא מאוד משובי בעקבות פציעה. תאי גזע / אב osteogenic כבר מזמן שיערו להתקיים, אבל בהפגנת vivo של תאים כאלה יש רק לאחרונה הושגו. כאן, in vivo בטכניקות הדמיה כדי לחקור את תפקידם של תאי גזע / אב osteogenic אנדוגני (OSPCs) וצאצאיהם בתיקון עצם מסופקות. שימוש בתא osteo שושלת התחקות דגמים והדמיה intravital של microfractures המושרה בעצמות calvarial, OSPCs ניתן לצפות ישירות במהלך הימים הראשונים לאחר פציעה, שבאירועים קריטיים בתהליך התיקון מוקדם להתרחש. אתרי פגיעה יכולים להיות צילמו ברצף חושפים כי OSPCs לעבור לפציעה, עלייה במספר ולהתמיין לosteoblasts עצם טביעה. שיטות אלה מציעים אמצעי חוקר את התפקיד של רגולטורים מולקולריים גזע תאים פנימיים וחיצוניים להתחדשות עצם ותיקון.

<html> מודל שבר התייצב ארוך העצם היה פופולרי במחקרים שבר. עם זאת, עצם ארוך או דגמי שבר גדולים לגרום נזק לרקמות רב, ולכן, יש מגבלה במדידת כמותית של תפקוד תא עצם. פיתחנו פגיעה פולשנית (קוטר מ&quot;מ פחות מ 1 עם פלישה מינימאלית או ללא למאטר הדורה) בעצמות קדמיות calvarial עם קידוח מחט (איורים 1 א-1C). בחרנו להציג את דף של העצמות הקדמיות calvarial הדמיה לחיות vivo של microfractures כי יש עצם זה מבנה עצם שטוח ודק עם מח עצם, המאפשר הדמיה ברורה של עצם פגוע, תאי עצם, כלי דם וללא ההתערבות של רקמות אחרות ( איור 1 ג). הבחנו כי microfracture זה משחזר מאפיינים רבים של פציעות שבר גדולות הכוללים השקעה ביבלת רכה אחריו בתצהיר מינרלים והיווצרות עצם חדש (מידע לא מוצג). &quot;סדרתית&gt; בתחום ההדמיה vivo של תאים + אב גזע osteogenic MX1. בשלב הבא אנו בדקנו אם שיטה זו היא מסוגלת לעקוב אחר אוכלוסיית תא osteogenic בפרט במהלך ריפוי שבר. בעבר, פיתחנו עכברי כתב כפול Mx1/Tomato/Ocn-GFP trigenic ידי חציית עכברי MX1-Cre עם כתב Rosa26-עגבניות ועכברי osteocalcin-GFP (איור 2 א) 6. היתרון של המודל הזה הוא תיוג ההפרש של גזע / אבות osteogenic וosteoblasts הבוגר. ידי ממשל PIPC, MX1 + OSPCs מוגדרים מפורשות על ידי ביטוי העגבניות, ואילו osteoblasts הבוגר מובחן מOSPCs-Induced MX1 להביע את העגבניות וה-GFP. עם זאת, osteoblasts קיים מראש וosteoblasts הבוגר מMX1 אבות שאינם מושרה להביע GFP לבד (איור 2). לאחר החלפת מח העצם וקרינה, אנחנו generated שתי microfractures בעצמות הקדמיות של עכברים אלה. אנו מאשרים כי באזור של כל בר זוהה על ידי שדה בודד של נוף עם אובייקטיבי 30x שלנו. ההדמיה 3D-intravital רציף של microfractures הראתה העתקת העגבניות + OSPCs באתר של שבר ביום 2 ובהרחבתן ביום 5. היו בלתי ניתנת לגילוי ה-GFP + אוסטאובלסטים או לא בשלב זה. ביום 12, קבוצת משנה של osteoprogenitors קרוב לפני שטח שבר יזם את הבידול של osteoblasts (עגבניות + ה-GFP +). בהמשך לכך, ההצטברות של osteoblasts החדש והיווצרות העצם חדשה (נותחה על ידי דור השני הרמוני, כחולה) היו ברורות ביום 21, מצביעה על כך שההגירה והתפשטות של תאי אב osteogenic היא מנגנון עיקרי לאספקת osteoblasts החדש המשתתף בריפוי שבר (איור 2 ג). קינטיקה של גזע / אבות osteogenic בתיקונים שבר. כדי te<html> st אם השיטה שלנו מספקת תפוקה עקבית וכמותי של מספרי osteoprogenitor במהלך ריפוי שבר, השתמשנו בעכבר Mx1/YFP כמודל שושלת מעקב פשוט ומעקב MX1 + OSPCs בתיקון שבר מוקדם. לאחר תאי מח MX1 + הוחלפו במח מהסוג בר, יצר שש microfractures העצמאי (שני / עכבר) על מכסה גולגולת עכבר Mx1/YFP. כאשר Mx1/YFP + OSPCs היו במעקב במשך 14 ימים לאחר פציעה, אנחנו באופן עקבי ציינו כי מספר קטן של אבות התגלו באתר פגיעה על ידי 3 ימים. המספרים עלו ברציפות ביום 7, והגיעו לשיא אוכלוסייה ביום 10 ולשמר ידי 14 ימים (איור 3 א). אנחנו כמתנו את קינטיקה של מספרי osteoprogenitor על ידי מדידת עוצמת אות YFP (עיבוד תמונה וניתוח עם תכנית ImageJ). אנו חוזרים על הניסוי הזה עם תפוקה דומה, מה שמרמז על העקביות של הגישה שלנו (איור 3 ב). <html> ss = &quot;jove_content&quot; עבור: לשמור-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51289/51289fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51289/51289fig1.jpg" /> איור 1. בvivo הדמיה של פגיעת calvarial עכבר. (א) ייצוג סכמטי של microfractures על העצמות הקדמיות עכבר בסמוך לצומת של תפרי העטרה (CS) ועל sagittal (SS) וההדמיה intravital רציפה. (ב) חשיפה כירורגית של עכבר מכסה גולגולת לפני פציעה. (C) פציעות microfracture נציג על מכסה גולגולת עכבר להדמית intravital. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51289/51289fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 51289fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. מעקב vivo של OSPCs באתרי הפציעה. (א) ייצוג סכמטי של trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP עכבר. (ב) תרשים זה ממחיש אוכלוסיות תאי ניאון אפשריות המופיעות באתרי פציעתם של Mx1/Tomato trigenic / OCN-GFP עכבר. אדום מייצג MX1 + OSPCs להביע עגבניות. צהוב מייצג osteoblasts הבוגר (עגבניות + ה-GFP +) מובחן מMX1 + OSPCs אילו ירוק מייצג osteoblasts החדש מosteoblasts קיים מראש (+ GFP) או MX1 שאינו מושרה (MX1 -). אבות הדמיה intravital סדרתית (C) של MX1 + OSPCs וosteoblasts באתרי הפציעה. עגבניות osteoprogenitors + ו-GFP + osteoblasts ליד הפציעה על מכסה גולגולת עכבר Mx1/Tomato/Ocn-GFP היו צילמו מייד לאחר פציעה (יום 0) ועל tהוא הצביע פעמים לאחר פציעה. חצים מצביעים osteoblasts נגזר מMX1 + OSPCs (צהוב). כחול, עצם. המעגל המקווקו מייצג את האתר כולו שבר (יחיד). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51289/51289fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51289/51289fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51289/51289fig3.jpg" /> איור 3. מדידה עקבית וכמותי של OSPCs-Induced MX1 במהלך ריפוי שבר. () שלוש פציעות עצמאיות על מכסה גולגולת עכבר Mx1/YFP היו צילמו ברצף מייד לאחר פציעה (יום 0) ובמועדים מצויינים לאחר פציעה. (B) כמותי מדידה של תאי גזע / אב osteogenic MX1 +. קינטיקה של MX1 + OSPCהתרחבות באתרי פציעה נמדדה על ידי עוצמת אות YFP באמצעות ImageJ. גרפים מראים שני ניסויים בלתי תלויים עם הממוצע של שש פציעות בכל ניסוי. כחול, עצם; , MX1 + בתאי גזע / אב osteogenic ירוק; אדום, כלי דם (Q-נקודות). ברים סולם הם 100 מיקרומטר (). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51289/51289fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair at JoVE.com

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

מדידת כמותית של פונקצית אב עצם בריפוי שבר דורשת טכנולוגיית הדמיה סידורי ברזולוציה גבוהה. הנה, פרוטוקולים ניתנים לשימוש במיקרוסקופיה intravital ומעקב osteo שושלת ברצף תמונה ולכמת את ההגירה, השגשוג והתמיינות של תאי גזע / אב osteogenic אנדוגני בתהליך של תיקון שברים בעצמות.

עוקב<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה של תאי גזע / אב osteogenic במהלך תיקון שבר

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

sequential-vivo-imaging-osteogenic-stemprogenitor-cells-during

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

10.5K Views.  Harvard Stem Cell Institute.  מדידת כמותית של פונקצית אב עצם בריפוי שבר דורשת טכנולוגיית הדמיה סידורי ברזולוציה גבוהה. הנה, פרוטוקולים ניתנים לשימוש במיקרוסקופיה intravital ומעקב osteo שושלת ברצף תמונה ולכמת את ההגירה, השגשוג והתמיינות של תאי גזע / אב osteogenic אנדוגני בתהליך של ?...

Video: Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate since the advent of in vivo bioluminescent imaging technologies 1-3. Indeed, the ability to locate and quantify tumor growth longitudinally in a single cohort of animals to completion of the study as opposed to sacrificing individual groups of animals at specific assay times has revolutionized how researchers investigate breast cancer metastasis. Unfortunately, current methodologies preclude the real-time assessment of critical changes that transpire in cell signaling systems as breast cancer cells (i) evolve within primary tumors, (ii) disseminate throughout the body, and (iii) reinitiate proliferative programs at sites of a metastatic lesion. However, recent advancements in bioluminescent imaging now make it possible to simultaneously quantify specific spatiotemporal changes in gene expression as a function of tumor development and metastatic progression via the use of dual substrate luminescence reactions. To do so, researchers take advantage for two light-producing luciferase enzymes isolated from the firefly (Photinus pyralis) and sea pansy (Renilla reniformis), both of which react to mutually exclusive substrates that previously facilitated their wide-spread use in in vitro cell-based reporter gene assays 4. Here we demonstrate the in vivo utility of these two enzymes such that one luminescence reaction specifically marks the size and location of a developing tumor, while the second luminescent reaction serves as a means to visualize the activation status of specific signaling systems during distinct stages of tumor and metastasis development. Thus, the objectives of this study are two-fold. First, we will describe the steps necessary to construct dual bioluminescent reporter cell lines, as well as those needed to facilitate their use in visualizing the spatiotemporal regulation of gene expression during specific steps of the metastatic cascade. Using the 4T1 model of breast cancer metastasis, we show that the in vivo activity of a synthetic Smad Binding Element (SBE) promoter was decreased dramatically in pulmonary metastasis as compared to that measured in the primary tumor 4-6. Recently, breast cancer metastasis was shown to be regulated by changes within the primary tumor microenvironment and reactive stroma, including those occurring in fibroblasts and infiltrating immune cells 7-9. Thus, our second objective will be to demonstrate the utility of dual bioluminescent techniques in monitoring the growth and localization of two unique cell populations harbored within a single animal during breast cancer growth and metastasis.

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Herein we describe the methods to construct, visualize, and quantify the bioluminescent reactions of both firefly and renilla luciferase enzymes expressed in metastatic breast cancer cells during their growth and metastasis in vivo.

במצע כפולה vivo bioluminescent ההדמיה

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

3D-Neuronavigation In Vivo Through a Patient's Brain During a Spontaneous Migraine Headache

A growing body of research, generated primarily from MRI-based studies, shows that migraine appears to occur, and possibly endure, due to the alteration of specific neural processes in the central nervous system. However, information is lacking on the molecular impact of these changes, especially on the endogenous opioid system during migraine headaches, and neuronavigation through these changes has never been done. This study aimed to investigate, using a novel 3D immersive and interactive neuronavigation (3D-IIN) approach, the endogenous &#181;-opioid transmission in the brain during a migraine headache attack in vivo. This is arguably one of the most central neuromechanisms associated with pain regulation, affecting multiple elements of the pain experience and analgesia. A 36 year-old female, who has been suffering with migraine for 10 years, was scanned in the typical headache (ictal) and nonheadache (interictal) migraine phases using Positron Emission Tomography (PET) with the selective radiotracer [11C]carfentanil, which allowed us to measure &#181;-opioid receptor availability in the brain (non-displaceable binding potential - &#181;OR BPND). The short-life radiotracer was produced by a cyclotron and chemical synthesis apparatus on campus located in close proximity to the imaging facility. Both PET scans, interictal and ictal, were scheduled during separate mid-late follicular phases of the patient's menstrual cycle. During the ictal PET session her spontaneous headache attack reached severe intensity levels; progressing to nausea and vomiting at the end of the scan session. There were reductions in &#181;OR BPND in the pain-modulatory regions of the endogenous &#181;-opioid system during the ictal phase, including the cingulate cortex, nucleus accumbens (NAcc), thalamus (Thal), and periaqueductal gray matter (PAG); indicating that &#181;ORs were already occupied by endogenous opioids released in response to the ongoing pain. To our knowledge, this is the first time that changes in &#181;OR BPND during a migraine headache attack have been neuronavigated using a novel 3D approach. This method allows for interactive research and educational exploration of a migraine attack in an actual patient's neuroimaging dataset.

3D-Neuronavigation In Vivo Through a Patient's Brain During a Spontaneous Migraine Headache

In this study, the authors report for the first time a novel 3D-Immersive &#38; Interactive Neuronavigation (3D-IIN) through the impact of a spontaneous migraine headache attack in the &#956;-opioid system of a patient's brain in vivo.

3D-Neuronavigation<em&gt; בVivo</em&gt; דרך המוח של חולה במהלך מיגרנה ספונטנית

A growing body of research, generated primarily from MRI-based studies, shows that migraine appears to occur, and possibly endure, due to the alteration ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

בF-MRI 19 vivo למעקב סלולרי

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Simultaneous PET/MRI Imaging During Mouse Cerebral Hypoxia-ischemia

Dynamic changes in tissue water diffusion and glucose metabolism occur during and after hypoxia in cerebral hypoxia-ischemia reflecting a bioenergetics disturbance in affected cells. Diffusion weighted magnetic resonance imaging (MRI) identifies regions that are damaged, potentially irreversibly, by hypoxia-ischemia. Alterations in glucose utilization in the affected tissue may be detectable by positron emission tomography (PET) imaging of 2-deoxy-2-(18F)fluoro-&#7429;-glucose ([18F]FDG) uptake. Due to the rapid and variable nature of injury in this animal model, acquisition of both modes of data must be performed simultaneously in order to meaningfully correlate PET and MRI data. In addition, inter-animal variability in the hypoxic-ischemic injury due to vascular differences limits the ability to analyze multi-modal data and observe changes to a group-wise approach if data is not acquired simultaneously in individual subjects. The method presented here allows one to acquire both diffusion-weighted MRI and [18F]FDG uptake data in the same animal before, during, and after the hypoxic challenge in order to interrogate immediate physiological changes.

The method presented here uses simultaneous positron emission tomography and magnetic resonance imaging. In the cerebral hypoxia-ischemia model, dynamic changes in diffusion and glucose metabolism occur during and after injury. The evolving and irreproducible damage in this model necessitates simultaneous acquisition if meaningful multi-modal imaging data are to be acquired.

ההדמיה PET / MRI בו זמנית בעכבר מוחין היפוקסיה-איסכמיה

Dynamic changes in tissue water diffusion and glucose metabolism occur during and after hypoxia in cerebral hypoxia-ischemia reflecting a bioenergetics ...

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with distinct functions and gene expression profiles. The roles of microglial activation in health, injury and disease remain incompletely understood due to their dynamic and complex regulation in response to changes in their microenvironment. Thus, it is critical to non-invasively monitor and analyze changes in microglial activation over time in the intact organism. In vivo studies of microglial activation have been delayed by technical limitations to tracking microglial behavior without altering the CNS environment. This has been particularly challenging during chronic neurodegeneration, where long-term changes must be tracked. The retina, a CNS organ amenable to non-invasive live imaging, offers a powerful system to visualize and characterize the dynamics of microglia activation during chronic disorders.
This protocol outlines methods for long-term, in vivo imaging of retinal microglia, using confocal ophthalmoscopy (cSLO) and CX3CR1GFP/+ reporter mice, to visualize microglia with cellular resolution. Also, we describe methods to quantify monthly changes in cell activation and density in large cell subsets (200-300 cells per retina). We confirm the use of somal area as a useful metric for live tracking of microglial activation in the retina by applying automated threshold-based morphometric analysis of in vivo images. We use these live image acquisition and analyses strategies to monitor the dynamic changes in microglial activation and microgliosis during early stages of retinal neurodegeneration in a mouse model of chronic glaucoma. This approach should be useful to investigate the contributions of microglia to neuronal and axonal decline in chronic CNS disorders that affect the retina and optic nerve.

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia activation and microgliosis are key responses to chronic neurodegeneration. Here, we present methods for in vivo, long-term visualization of retinal CX3CR1-GFP+ microglial cells by confocal ophthalmoscopy, and for threshold and morphometric analyses to identify and quantify their activation. We monitor microglial changes during early stages of age-related glaucoma.

בVivo הדינמיקה של רשתית microglial הפעלה במהלך מוחיה: Confocal Ophthalmoscopic הדמיה וMorphometry הסלולרי בעכבר גלאוקומה

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest improved outcome measures in both experimental and clinical studies. Although the BMMSC are implanted into the tendon lesion in large numbers (usually 10 - 20 million cells), only a relatively small number survive (&#60;10%) although these can persist for up to 5 months after implantation. This appears to be a common observation in other species where BMMSC have been implanted into other tissues and it is important to understand when this loss occurs, how many survive the initial implantation process and whether the cells are cleared into other organs. Tracking the fate of the cells can be achieved by radiolabeling the BMMSC prior to implantation which allows non-invasive in vivo imaging of cell location and quantification of cell numbers.
This protocol describes a cell labeling procedure that uses Technetium-99m (Tc-99m), and tracking of these cells following implantation into injured flexor tendons in horses. Tc-99m is a short-lived (t1/2 of 6.01 hr) isotope that emits gamma rays and can be internalized by cells in the presence of the lipophilic compound hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). These properties make it ideal for use in nuclear medicine clinics for the diagnosis of many different diseases. The fate of the labeled cells can be followed in the short term (up to 36 hr) by gamma scintigraphy to quantify both the number of cells retained in the lesion and distribution of the cells into lungs, thyroid and other organs. This technique is adapted from the labeling of blood leukocytes and could be utilized to image implanted BMMSC in other organs.

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

In vivo ההדמיה ומעקב של טכנציום-99m תווית תאי גזע מח העצם mesenchymal בסוסי Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The amount of the different tissues in the callus provides important information on the fracture healing progress. Available in vivo techniques to longitudinally monitor the callus tissue development in preclinical fracture-healing studies using small animals include digital radiography and &#181;CT imaging. However, both techniques are only able to distinguish between mineralized and non-mineralized tissue. Consequently, it is impossible to discriminate cartilage from fibrous tissue. In contrast, magnetic resonance imaging (MRI) visualizes anatomical structures based on their water content and might therefore be able to noninvasively identify soft tissue and cartilage in the fracture callus. Here, we report the use of an MRI-compatible external fixator for the mouse femur to allow MRI scans during bone regeneration in mice. The experiments demonstrated that the fixator and a custom-made mounting device allow repetitive MRI scans, thus enabling longitudinal analysis of fracture-callus tissue development.

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

The evaluation of tissue development in the fracture callus during endochondral bone healing is essential to monitor the healing process. Here, we report the use of a magnetic resonance imaging (MRI)-compatible external fixator for the mouse femur to allow MRI scans during bone regeneration in mice.

אין ויוו הערכה של שבר פיתוח קסם במהלך עצם הריפוי בעכברים שימוש בהתקן התואם ל- MRI Osteosynthesis את העכבר אתי

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

Middle Cerebral Artery Occlusion Allowing Reperfusion via Common Carotid Artery Repair in Mice

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue plasminogen activator (tPA) as an approved drug treatment to target ischemic strokes. Current research in the field of ischemic stroke focuses on better understanding the pathophysiology of stroke, to develop and investigate novel pharmaceutical targets. Reliable experimental stroke models are crucial for the progression of potential treatments. The middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is clinically relevant and the most frequently used surgical model of ischemic stroke in rodents. However, the outcomes of this model, such as lesion volume, are associated with high levels of variability, particularly in mice. The alternative MCAO model described here allows the reperfusion of the common carotid artery (CCA) and the increased perfusion of the middle cerebral artery (MCA) territory, using a tissue pad with fibrinogen-based sealant to repair the vessel, and the improved welfare of the mice by avoiding external carotid artery (ECA) ligation. This reduces the reliance on the Circle of Willis, which is known to be highly anatomically variable in mice. Representative data show that using this alternative surgical approach decreases the variability in lesion volumes between the traditional MCAO approach and the alternative approach described here.

Intraluminal filament occlusion of the middle cerebral artery is the most frequently used in vivo model of experimental stroke in rodents. An alternative surgical approach to allow common carotid artery repair is performed here, which allows the reperfusion of the common carotid artery and a full reperfusion to the middle cerebral artery territory.

חסימה בעורק האמצעי המאפשר פגיעה Reperfusion באמצעות תיקון עורק הראש נפוצות בעכברים

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue ...

עוקב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video