המחברים מודים לד&quot;ר Yangyang יאן במעבדה של ד&quot;ר פרד Sigworth באוניברסיטת ייל לתרומתו הנדיבה של HEK293 תאים ביציבות להביע מרווח-B חלבון חולדה. בנוסף המחברים מודים לד&quot;ר Sigworth עבור דגם ההומולוגיה מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-של המרווח מוצג במבוא הווידאו. מחקר זה נתמך על ידי NIH מענקי DH067517 וNS073943 לLKK

1. תרבית תאים (מעובד מתוך פלמינג וקצ&#39;מארק 18) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאים בתקשורת המתאימה ליותר מ 2 אבל פחות מ 10 מעברים לפני השימוש בassay זה. HEK-293 תאי untransfected וHEK-293 תאים ביציבות להביע מרווח-B חלבון חולדה גדלים במדיום של המחצית Dulbecco אחד השתנה נשר וחצי אחד של ליבוביץ L-15 בינוניים בתוספת 10% סרום חום מומת שור עוברי ואנטיביוטיקה. 500 מיקרוגרם / מיליליטר Geneticin (G418) הוא הוסיף לHEK-293 תאים ביציבות להביע מרווח-B כדי לבחור לביטוי של ערוץ המרווח. תאי מעבר במפגש 70-90% על ידי ניתוק ממנות עם פתרון טריפסין-EDTA 0.25%. </li></ol> 2. תאי מטריקס ציפוי (ECM) של 2 384 גם פלייט Biosensor האופטי טיו עם פיברונקטין וOvalbumin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תערובת ECM פיברונקטין ופתרון חסימת ovalbumin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עבודה של fibronectבפוספט בופר סליין (PBS) עם ריכוז סופי של 5 מיקרוגרם / מיליליטר של פיברונקטין ב20.0 מיליליטר PBS. מריכוז מניית 1.0 מ&quot;ג / מיליליטר, להוסיף 100 μl ל20.0 מיליליטר PBS לדילול 200 פי. הפתרון עובד של פיברונקטין ניתן aliquoted ומאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס לאחר הכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות 5% מovalbumin חום מומת במים סטריליים. לדלל ovalbumin במי כיתה סטרילי רקמת תרבות לפתרון 5% וחום להשבית למשך 30 דקות ב60 ° C. לקרר את הפתרון לטמפרטורת חדר וסינון סטרילי הפתרון. Aliquot פתרון 5% ovalbumin ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עבודה 2% מovalbumin על ידי דילול 5% מניות הפתרון לPBS. לדוגמא, הוסף 12.0 מיליליטר של 5% מניות פתרון ovalbumin ל18.0 מיליליטר של PBS עבור נפח סופי של 30.0 מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי צלחת biosensor האופטי 384 גם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מימה צלחת Tio 2 עם 20.0 μl / טובמים סטריליים של תרבית רקמת כיתה במשך 15 דקות. יש לבצע את הפעולות הבאות עם pipettor 16 ערוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 1x צלחת עם 50.0 μl PBS לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 20.0 μl של הפתרון עובד פיברונקטין לכל היטב דגירה עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר כדי ליצור את ECM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 1x צלחת עם 50.0 μl PBS לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 40.0 μl של הפתרון עובד ovalbumin לכל היטב דגירה הלילה ב 4 ° C כדי לחסום את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x צלחת עם 50.0 μl PBS לכל טוב. ניתן לאחסן צלחות ECM מצופים על 4 מעלות צלזיוס עד 48 שעה. </li></ol></li></ol> 3. זריעה של תאים לצלחת Biosensor האופטי 384 גם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תקשורת צמיחה מהתאים ולהוסיף טריפסין כדי לסלק את התאים מן הצלחת. לאסוף את התאים ו צנטריפוגות XG ב 1000 דקות 1. הסר את המדיה טריפסין ותאי resuspend בתקשורת צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות hemocytometer או אוטומטידלפק תא, לקבוע את הריכוז של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למזער את ההשפעות של אידוי במהלך דגירה, 50.0 μl של מדיום גידול בכל טוב יהיה בשימוש. צריכים להיות מדוללים תאים כדי להשיג את המספר הרצוי של תאים לכל טוב בנפח של 50.0 μl של מדיום גידול. בניסויים אלה, 1,000 תאים / גם היו מצופים על biosensor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תאי זרע לדגירת הלילה במדיום גידול על 37 מעלות צלזיוס תחת אוויר / 5% CO 2. </li></ol> 4. הכנת צלחות Biosensor ואת המתחם עבור assay RWG האופטי Biosensor <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת מן החממה ולהסיר תקשורת צמיחה מהתאים. לשטוף את התאים 1x עם תמיסת מלח מאוזנת הנקס (HBSS). הוספת 25.0 μl של HBSS היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת biosensor על סורק BIND ולאפשר לתאים לאזן לטמפרטורת חדר למשך 1-2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת מתחם נפרדת ממנו ligands של ריבית יהיה מודעהטוליפ אין לצלחת biosensor במהלך assay. למבחנים אלה, 25.0 μl של תרכובת תמיסה המכילה נוסף לכל גם על צלחת biosensor להיקף כולל של 50.0 μl. ככזה, תרכובות בפתרון הוכנו ב2x הריכוז הסופי הרצוי. </li></ol> 5. לבצע את assay RWG האופטי Biosensor <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח מדידה בסיסית עם מערכת הסורק לבארות A1-P12 (מחצית מצלחת 384 גם SBS) באמצעות רזולוציה מקסימלית של 3.75 מיקרומטר / פיקסל ל1.5 מ&quot;מ של כל אחד גם באמצעות תוכנת BIND הסריקה המרכזי. סריקה בסיסית זה תיקח כ 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 25.0 μl של פתרונות המתחם היטב כל אחד לבארות A1-P12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח מדידה בסיסית של בארות A13-P24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 25.0 μl של פתרונות המתחם היטב כל אחד לבארות A13-P24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח מדידה בנוסף הודעה מתחם לבארות A1-P12, וחזור לבארות A13-P24. </li></ol> 6.nalysis של assay נתונים עם BIND צפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את נתוני assay BIND למדידה הבסיסית ב-Windows, ולחץ על כפתור &quot;גריד העורך&quot; כדי לאפשר בחירת תא. התוכנה תחשב מדדים של עניין שהוגדרו על ידי המשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את &quot;תוספות&quot;, הכוללות את &quot;Finder Cell&quot; ותפקוד &quot;Baseliner&quot;. פרמטרים שנקבעו ב&quot; Finder Cell &quot;, כך שתאים וניתן להבחין מהרקע של biosensor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את קובץ מפת התא שמכיל את הנתונים &quot;Finder Cell&quot; למדידת קו הבסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 6.1-6.2 לנתונים בנוסף מתחם הודעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוספת &quot;Baseliner&quot; ולייבא את מפת התא מהמדידה בתחילת המחקר. התוכנה תחשב את השינוי בPWV בין נתוני רקע והודעת מתחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;Cell Δ הממוצע&quot; לתפוקה של המשמרת הממוצעת בPWV לתאים. מכן ניתן לייצא את הנתונים ל-Microsoft Excאל לניתוח נוסף. </li></ol>

<ol>
	<li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion Channels of Excitable Membranes. , (1992).</li><li>Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conducting+functions+of+voltage-gated+ion+channels.">Non-conducting functions of voltage-gated ion channels.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).</li><li>Levitan, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+protein+complexes+associated+with+neuronal+ion+channels.">Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels.</a> Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).</li><li>Shamah, S. M., Cunningham, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+cell-based+assays+using+photonic+crystal+optical+biosensors.">Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors.</a> Analyst. 136, 1090-1102 (2011).</li><li>Cunningham, B. T., Laing, L. M. i. c. r. o. p. l. a. t. e. -. b. a. s. e. d. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+detection+of+biomolecular+interactions:+applications+in+proteomics.">label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics.</a> Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).</li><li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays.">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).</li><li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing.">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).</li><li>Cunningham, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+assays+on+the+BIND+system.">Label-free assays on the BIND system.</a> J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).</li><li>Hessel, A. a. O., A, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Theory+of+Wood's+Anomalies+on+Optical+Gratings.">A New Theory of Wood's Anomalies on Optical Gratings.</a> Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).</li><li>Cunningham, B. T., Laing, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+application+of+label-free+detection+assays+in+drug+screening.">Advantages and application of label-free detection assays in drug screening.</a> Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).</li><li>Lee, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+optical+biosensor:+a+tool+for+G+protein-coupled+receptors+pharmacology+profiling+and+inverse+agonists+identification.">Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification.</a> J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).</li><li>Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+K++channels,+Na++is+the+new+Ca2.">For K+ channels, Na+ is the new Ca2.</a> Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).</li><li>Santi, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+regulation+of+Slick+and+Slack+K++channels+by+neuromodulators.">Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators.</a> J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).</li><li>Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slack+and+Slick+K(Na)+channels+regulate+the+accuracy+of+timing+of+auditory+neurons.">Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons.</a> J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).</li><li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+controls+gating+of+the+sodium-activated+potassium+channel.">Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel.</a> 13, 819-821 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuronal+excitability+by+interaction+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+slack+potassium+channels.">Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels.</a> J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).</li><li>Barcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+gain-of-function+KCNT1+channel+mutations+cause+malignant+migrating+partial+seizures+of+infancy.">De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy.</a> Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).</li><li>Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+optical+biosensors+to+detect+modulation+of+Slack+potassium+channels+by+G+protein-coupled+receptors.">Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors.</a> J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).</li><li>Nelson, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+diacylglycerol+degradation+to+M1+muscarinic+receptors+by+beta-arrestins.">Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins.</a> Science. 315, 663-666 (2007).</li><li>Zhang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Gribbon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+real-life+high-throughput+screening+data.">Evaluating real-life high-throughput screening data.</a> J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).</li></ol>

סטיוון Shamah הנו עובד Biosciences X-BODY.

ראש Z (Z &#39;) הגורם הוא שיטה סטטיסטית מקובלת לכמת את האיכות של assay הקרנת תפוקה גבוהה 20, וכי ההקרנה של אגוניסטים GPCR בassay זה התרחשה בassay 384 גם תואם SBS, מספק מצוין מידה של החוסן ותוקפו של assay זה 21. הערך &#39;AZ של 1 מציין assay תיאורטי אידיאלי עם מספר אינסופי של נקודות נתוני...

בחינת תאי חיים בהקשר הרלוונטי מבחינה פיזיולוגית שלהם היא קריטית להבנת הפונקציות הביולוגיות של יעדים סלולריים. עם זאת, מבחני שבחנו את האינטראקציה בין ערוצים וחלבונים cytoplasmic רגולציה, כגון מבחני coimmunoprecipitation, בדרך כלל לספק מעט מידע על הקורס של אינטראקציות בתאים חיים בזמן. רוב מבחני תא מבוסס הנוכחיים למדוד אירוע תאי ספציפי, כגון טרנסלוקציה של חלבונים מתויגים fluorescently של עניין. מבחני אלו דורשים שינויים של החלבונים של עניין, אשר יכולה לשנות את ההתנהגות של החלבון ולהקטין את הרלוונטיות הפיזיולוגיות של היעד. מבחני תא פולשנית מבוססים, אשר אינו דורשים מניפולציה של המערכת, לספק מדידה רציפה של פעילות תאית ומאפשרים מחקרים של תאים ברוב רלוונטי מבחינה פיזיולוגית שלהם מדינת 4. biosensors האופטי מתוכננים לייצרשינוי שניתן לכמת במאפיין של האור שהוא מצמידים את משטח החיישן. biosensors האופטי לנצל גלי חלוף, הכולל משטח תהודה plasmon (SPR) וצורמים גל תהודה טכניקות (RWG), היה בשימוש בעיקר כדי לזהות את הזיקות וקינטיקה של מולקולות נקשרות לרצפטורים הביולוגיים שלהם משותקים על משטח החיישן. לאחרונה, biosensors RWG זמין מסחרי פותחו על מנת לאפשר זיהוי של השינוי היחסי במסה בתוך החלק התחתון של תאים חסיד אל פני השטח החיישן ברזולוציה מרחבית גבוהה (עד 3.75 מיקרומטר / פיקסל) 5. biosensors אלה יכולים לזהות שינויים במסה ליד קרום הפלזמה של תאי חיים הנובעים מגירוי, כגון הידבקות תא ומתפשט, רעיל, התפשטות ומסלולי איתות שהושרו על ידי מגוון רחב של קולטני תא שטח כוללים קולטנים בשילוב ה-G-חלבון (GPCRs) 6 . biosensors RWG לזהות chan היחסיge במדד השבירה כפונקציה של השינוי היחסי במסה בתוך 150 ננומטר של biosensor 7. כאשר תאים מצופה לbiosensor, שינוי זה באינדקס שבירה משקף את השינוי במסה ליד קרום הפלזמה של התא כתוצאה משינוי בדבקות סלולרית לbiosensor. פרוטוקול זה יעסוק בזיהוי של אינטראקציות ערוץ חלבון באמצעות biosensors RWG. מערכות רכישת נתונים RWG מורכבות ממספר מרכיבים. בגלל X-BODY Biosciences BIND הסורק שימש לניסויים אלה, נתייחס לרכיבים למערכת המסוימת הזה, אשר מורכב מקורא צלחת, biosensors קשור, תוכנת רכישת BIND סריקה, ותוכנת צפייה בBIND ניתוח 8. Biosensors הגבישים פוטוניים, המכונה להלן biosensors אופטי כ, מורכבים מסידור תקופתי של דיאלקטרי ומהותי ב2 או 3 ממדים אשר מונע את התפשטות אור בספציפיאורכי גל וכיוונים. מבני גבישים פוטוניים מבוססים על תופעה שנקראת האנומליה של ווד. התגלו לראשונה על ידי עץ ב1902, אנומליות אלה הן תופעות שנצפו בספקטרום של אור מוחזר על ידי שבכות שבירה אופטיות שבו וריאציות מהירים בעוצמת הזמנות עקיפה מסוימות מתרחשות בתדרים צרים מסוימים. ב1962, Hessel וOliner הציגו תאוריה חדשה של החריגות של עץ שבו צורם תקופה מוגבלת יוצרת גל תהודה עומד 9. בbiosensors האופטי שתואר כאן, חריגות של עץ משמשות לייצור biosensor RWG שכאשר מגורה עם אור לבן משקף את הלהקה רק צרה מאוד של אורכי גל (בדרך כלל בין 850-855 ננומטר). biosensors פרט מורכב של חומר פלסטי מדד נמוך שבירה עם משטח מבנה מחזורי אשר מצופה בשכבה דקה של תחמוצת גבוהה שבירת דיאלקטרי טיטניום חומר (Tio 2). כאשר Biosensאו מואר עם רחב מקור אור באורך גל, הצורם האופטית של גבישים פוטוניים משקף טווח צר של אורכי גל של אור הנמדד על ידי ספקטרופוטומטר בסורק BIND. עוצמת השיא של אורכי הגל משתקף (שיא גל הערך, או PWV) מחושבת אז מהאות. PWV של משמרות אור על שינוי במדד השבירה כתוצאה מעלייה או ירידה במסה בתוך הקרבה (~ 150 ננומטר) של פני השטח biosensor. biosensors האופטי משולבים האגודה סטנדרטית למדעי Biomolecular (SBS) microplate 384 גם למבחנים המשמשים בניסויים אלה. biosensors RWV משמשים לאיתור שינויים על תוספת של אותות אקסוגניים בתאים חיים 10. תאים בתרבית ישירות על גבי המשטח של biosensor RWG והשינוי במדד המקומי של שבירה הוא פיקוח על טיפול בגירויים ספציפיים. הכיוון של שינוי במסה בbiosensor יכול להיותנקבע, כי עלייה במדד המקומי של תוצאות שבירה מעלייה במסה ליד biosensor ונמדדת כגידול בPWV. לעומת זאת ירידה במסה מייצרת ירידת PWV. השינוי בPWV המזוהה יכול לנבוע מאירועים סלולריים רבים, בם שינויים בהידבקות תא, גיוס / שחרור חלבון, אנדוציטוזה ומחזור, exocytosis, אפופטוזיס, וסידור מחדש cytoskeletal. לדוגמא, assay ניתן לזהות שינויים באינטראקציות ערוץ חלבון בין תעלות אשלגן ורכיבי cytoplasmic או cytoskeletal אחרים. האירוע, לעומת זאת, חייב להתרחש בתוך אזור זיהוי ננומטר ~ 150 ליד biosensor, ובמקרה של תא מצורף, ליד קרום הפלזמה. רכישה של תגובות הסלולר מתבצעת עם תוכנת BIND Scan וייצוג דמותו של כל אחד מ384 הבארות בצלחת SBS הוא שנוצר. במערכת זו יש רזולוציה של עד 3.75 מיקרומטר / פיקסל, המאפשר זיהוי של אירועים בתאים בודדים, וניתן להשתמש בו גם עם שורות תאים (כגון תאי HEK293 או CHO) או עם יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית תאים ראשוניים. ניתוח תמונה עם צפייה BIND תוכנה מאפשר זיהוי של תגובות תאיות בשני בודד ואוכלוסיות של תאים. כbiosensors ישולבו SBS הסטנדרטי 384 גם microplates, המערכת היא בקלות להתאמה לתפוקה גבוהה הקרנה (HTS). biosensors האופטי סבכת תהודה הגל בעבר נעשה שימוש כדי לזהות שינויים במסה ליד קרום הפלזמה של תאים הבאים הפעלה של 11 GPCRs. המעבדה שלנו משובט שני ערוצים (K Na) מופעל נתרן, אשלגן, מרווח-B ו12 סליק. פעילותם של שני ערוצי המרווח-B וסליק הוכח להיות מאוד מושפע במידה רבה על ידי הפעלה ישירה של חלבון קינאז C (PKC) 13. הפעלה של רצפטורים חלבון q Gα בשילוב, כגון קולט מוסקריניים M1 ו r גלוטמט metabotropic mGluR1eceptor, בעצמה מסדיר את פעילות ערוץ באמצעות הפעלת PKC. ערוצי K נה אלה תורמים להסתגלות עצבית בזמן גירוי מתמשך ולהסדיר את הדיוק של תזמון של פעולת פוטנציאלי 14. ערוצים רפויים ידועים אינטראקציה עם מגוון רחב של מולקולות איתות cytoplasmic, כוללים FMRP, חלבון X פיגור שהכלי השביר 15,16. מוטציות בתוצאת מרווח בהתקפים חלקיים מעבר מרובים של ינקות (MMPSI), צורת התחלה מוקדמת של אפילפסיה שתוצאתה עיכוב התפתחותי חמור 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="723">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Geneticin G-418 Sulfate</td>
			<td style="width:172px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB05057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">HBSS</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">DPBS</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer</td>
			<td style="width:172px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Carbamoylcholine chloride</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Finnpipette (5-50 &#181;l)</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4662090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">BIND Scanner System</td>
			<td style="width:172px;">X-BODY Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">384-well TiO2 coated plates</td>
			<td style="width:172px;">X-BODY Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">TiO-96-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of label-free optical biosensors to detect modulation of potassium channels by g-protein coupled receptors

תעלות יונים לשלוט בתכונות חשמליות של תאי עצב ותאים מסוגים אחרים להתרגש ידי סלקטיבי המאפשר ליונים לזרום דרך קרום הפלזמה 1. כדי לווסת את הרגישות עצבית, מאפייני biophysical של תעלות יונים שונו על ידי איתות חלבונים ומולקולות, אשר לעתים קרובות נקשרים לערוצים עצמם כדי ליצור 2,3 מורכב ערוץ heteromeric. מבחני מסורתיים בוחנים את האינטראקציה בין ערוצים וחלבונים רגולטורים דורשים תוויות אקסוגני שעלולים לשנות את ההתנהגות של החלבון ולהקטין את הרלוונטיות הפיזיולוגיות של היעד, תוך מתן מעט מידע על הקורס של אינטראקציות הזמן בתאים חיים. biosensors האופטי, כגון מערכת X-BODY Biosciences BIND הסורק, השתמש בטכנולוגיה ללא תווית רומן, צורם תהודה אורך גל (RWG) biosensors האופטי, כדי לזהות שינויים בתהודה משתקף אור ליד biosensor. assay זה מאפשר זיהוי של קרוב המשפחהשינוי במסה בתוך החלק התחתון של תאי חיים חסיד אל פני שטח biosensor כתוצאה משינויי יגנד מושרה בהידבקות תא ומתפשטת, רעיל, התפשטות, ושינויים באינטראקציות בין חלבונים בקרבת קרום הפלזמה. biosensors האופטי RWG היה בשימוש כדי לזהות שינויים במסה קרובים לקרום הפלזמה של תאים לאחר הפעלה של קולטני G-חלבון בשילוב (GPCRs), טירוזין קינאז רצפטור, וקולטני תא שטח אחר. שינויי יגנד-Induced באינטראקציות ערוץ חלבון יון גם ניתן ללמוד באמצעות assay זה. במאמר זה, נתאר את ההליך ניסיוני המשמש לגילוי האפנון של אשלגן המופעל נתרן המרווח-B ערוצים (K Na) על ידי GPCRs.

HEK-293 תאי untransfected הרפוי-B transfected ביציבות HEK-293 תאים ולשלוט היו זורעים ב1,000 תאים / גם ב384 גם, צלחות biosensor ECM מצופים RWG. תמונות מ1.5 מ&quot;מ 2 המרכזיים של biosensor נרשמו ברזולוציה של 3.75 מיקרומטר / פיקסל (איור 1). מפות שיפוע צפיפות מסה נוצרו מראש ו30 בנוסף מתחם לאחר דקות עם ת?...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors at JoVE.com

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

טכניקות biosensor אופטיות יכולות לזהות שינויים במסה ליד קרום הפלזמה בתאים חיים ומאפשרות אחד כדי לעקוב אחר תגובות תאיות בתאים ובאוכלוסיות של תאים בודדים. פרוטוקול זה יתאר גילוי האפנון של תעלות אשלגן על ידי קולטנים בשילוב ה-G-חלבון בתאים שלמים באמצעות גישה זו.

שימוש בBiosensors האופטי ללא תווית לזיהוי מודולציה של תעלות אשלגן על ידי קולטנים מצמידים G-חלבון

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

use-label-free-optical-biosensors-to-detect-modulation-potassium

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Views.  Yale School of Medicine.  טכניקות biosensor אופטיות יכולות לזהות שינויים במסה ליד קרום הפלזמה בתאים חיים ומאפשרות אחד כדי לעקוב אחר תגובות תאיות בתאים ובאוכלוסיות של תאים בודדים. פרוטוקול זה יתאר גילוי האפנון של תעלות אשלגן על ידי קולטנים בשילוב ה-G-חלבון בתאים שלמים ב?...

Video: Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

הוספת בדיקות ביולוגיות Biosensors סיליקה אופטי באמצעות סוכני צימוד silane

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

זיהוי אופטי של<em&gt; א coli</em&gt; חיידקים על ידי Biosensors הסיליקון Mesoporous

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation של יחיד RNA מולקולות על ידי מלקחיים אופטיים

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Biochip אלקטרוכימי מבוסס Microfluidic לניתוח הכלאה DNA ללא תווית

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

ללא תווית מולקולה בודדת איתור באמצעות תהודה אופטית Microtoroid

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

השימוש β-lactamase מבוססי ביוסנסור Conductimetric Assay לזהות אינטראקציות למערכות ביולוגיות

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP על שבב: מחקר ללא תווית של אינטראקציות חלבון- phosphoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations and development of microstructurally motivated mathematical models for understanding the mechanical properties of human resistance arteries in health and disease have the potential to aid understanding how disease and medical treatments affect the human microcirculation. To develop these mathematical models, it is essential to decipher the relationship between the mechanical and microarchitectural properties of the microvascular wall. In this work, we describe an ex vivo method for passive mechanical testing and simultaneous label-free three-dimensional imaging of the microarchitecture of elastin and collagen in the arterial wall of isolated human resistance arteries. The imaging protocol can be applied to resistance arteries of any species of interest. Image analyses are described for quantifying i) pressure-induced changes in internal elastic lamina branching angles and adventitial collagen straightness using Fiji and ii) collagen and elastin volume densities determined using Ilastik software. Preferably all mechanical and imaging measurements are performed on live, perfused arteries, however, an alternative approach using standard video-microscopy pressure myography in combination with post-fixation imaging of re-pressurized vessels is discussed. This alternative method provides users with different options for analysis approaches. The inclusion of the mechanical and imaging data in mathematical models of the arterial wall mechanics is discussed, and future development and additions to the protocol are proposed.

We describe simultaneous mechanical testing and 3D-imaging of the arterial wall of isolated, live human resistance arteries, and Fiji and Ilastik image analyses for the quantification of elastin and collagen spatial organization and volume densities. We discuss the use of these data in mathematical models of arterial wall mechanics.

הערכת Microarchitectures תלויי-לחץ קולגן ואלסטין, חיים, אנושי התנגדות העורקים על ידי קרינה פלואורסצנטית ללא תווית מיקרוסקופ

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...