المؤلفون ممتنون للدكتور يانغ يانغ يان في مختبر الدكتور فريد Sigworth في جامعة ييل للتبرع السخي من الخلايا HEK293 التعبير عن ثابت الفئران البروتين سلاك-B. وبالإضافة إلى ذلك الكتاب ممتنون للدكتور Sigworth عن البرد الإلكترون المجهري نموذج التماثل من سلاك عرض في مقدمة الفيديو. وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DH067517 وNS073943 إلى LKK

1. الثقافة الخلية (مقتبس من فليمينغ وكازماريك 18) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الثقافة في وسائل الإعلام الملائمة لأكبر من 2 ولكن أقل من 10 مقاطع قبل استخدامها في هذا الاختبار. تزرع Untransfected HEK-293 الخلايا وHEK-293 الخلايا معربا عن ستابلي الفئران البروتين سلاك-B في واحدة نصف Dulbecco والمتوسطة معدلة النسر ونصف تستكمل يبوفيتش L-15 متوسطة 10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني والمضادات الحيوية. يتم إضافة 500 ميكروغرام / مل Geneticin (G418) إلى HEK-293 الخلايا معربا عن ستابلي سلاك-B لتحديد للتعبير عن القناة سلاك. خلايا مرور في 70-90٪ التقاء بواسطة تفارق من الأطباق مع 0.25٪ التربسين-EDTA حل. </li></ol> 2. خارج الخلية مصفوفة (ECM) طلاء من تيو 2 384 جيدا لوحة biosensor البصرية مع فبرونيكتين وألبومين البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خليط فبرونيكتين ECM وألبومين البيض عرقلة الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل عمل fibronectفي في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع تركيز النهائي من 5 ميكروغرام / مل من فبرونيكتين في 20.0 مل PBS. من تركيز الأسهم 1.0 ملغ / مل، إضافة 100 ميكرولتر إلى 20.0 مل PBS لتخفيف 200 أضعاف. الحل عمل فبرونيكتين يمكن aliquoted وتخزينها في -20 درجة مئوية بعد التحضير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 5٪ محلول المخزون من ألبومين البيض الحرارة المعطل في الماء المعقم. تمييع ألبومين البيض في زراعة الأنسجة المياه الصف عقيمة عن حل 5٪ والحرارة تعطيل لمدة 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية. يبرد المحلول إلى درجة حرارة الغرفة وتصفية العقيمة الحل. قسامة الحل ألبومين البيض 5٪ وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل العاملة 2٪ من ألبومين البيض عن طريق تمييع 5٪ محلول المخزون في برنامج تلفزيوني. على سبيل المثال، إضافة 12.0 مل من 5٪ محلول المخزون ألبومين البيض إلى 18.0 مل من برنامج تلفزيوني عن الحجم النهائي من 30.0 مل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 384 جيدا لوحة biosensor البصرية طلاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيدرات لوحة تيو 2 مع 20.0 ميكرولتر / جيدزراعة الأنسجة المياه الصف معقمة لمدة 15 دقيقة. يجب أن يتم تنفيذ الخطوات التالية مع pipettor 16 قناة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل لوحة 1X مع 50.0 ميكرولتر PBS لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20.0 ميكرولتر من الحل العمل فبرونيكتين إلى كل بئر واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة لإنشاء ECM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل لوحة 1X مع 50.0 ميكرولتر PBS لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40.0 ميكرولتر من الحل العمل ألبومين البيض إلى كل بئر واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لمنع اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 3X وحة مع 50.0 ميكرولتر PBS لكل بئر. ويمكن تخزين ECM المغلفة لوحات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة. </li></ol></li></ol> 3. البذر من الخلايا الضوئية على جهاز الاستشعار البيولوجي 384 جيدا لوحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائط النمو من الخلايا وإضافة التربسين لإزاحة الخلايا من لوحة. جمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 1 دقيقة. ازالة وسائل الإعلام التربسين والخلايا resuspend في وسائل الاعلام النمو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام عدادة الكريات أو الآليمكافحة الخلايا، تحديد تركيز الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحد من آثار التبخر أثناء التحضين، سيتم استخدام 50.0 ميكرولتر من متوسط ​​النمو لكل بئر. وينبغي أن تضعف الخلايا لتحقيق العدد المطلوب من الخلايا لكل بئر في حجم 50.0 ميكرولتر من النمو المتوسط. لهذه التجارب، كانت مطلية 1،000 خلية / جيدا على جهاز الاستشعار البيولوجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح للخلايا المصنف لاحتضان بين عشية وضحاها في النمو المتوسطة عند 37 درجة مئوية في ظل الجو / 5٪ CO 2. </li></ol> 4. إعداد جهاز الاستشعار البيولوجي ومجمع لوحات لفحص RWG البصرية جهاز الاستشعار البيولوجي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة من الحاضنة وإزالة وسائط النمو من الخلايا. غسل الخلايا 1x أخرى مع هانكس محلول الملح المتوازن (HBSS). إضافة 25.0 ميكرولتر من HBSS إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة جهاز الاستشعار البيولوجي على الماسح BIND وتسمح للخلايا لكي تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحة المركبة منفصلة عن التي بروابط الفائدة سيكون الإعلاندائرة التنمية الاقتصادية على لوحة جهاز الاستشعار البيولوجي أثناء الفحص. لهذه المقايسات، تم إضافة 25.0 ميكرولتر من محلول يحتوي على مركب إلى كل بئر على لوحة جهاز الاستشعار البيولوجي لإجمالي حجم 50.0 ميكرولتر. على هذا النحو، تم إعداد المركبات في حل 2X في التركيز النهائي المطلوب. </li></ol> 5. إجراء الفحص البصري RWG جهاز الاستشعار البيولوجي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ قياس خط الأساس مع نظام الماسح الضوئي للآبار A1-P12 (نصف SBS لوحة 384 أيضا) باستخدام الحد الأقصى من القرار 3.75 ميكرون / بكسل لوسط 1.5 ملم من كل بئر باستخدام برنامج BIND المسح الضوئي. وهذا المسح الأساسية أن تأخذ حوالي 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25.0 ميكرولتر من الحلول مجمع إلى كل بئر للآبار A1-P12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ قياس خط الأساس الآبار A13-P24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25.0 ميكرولتر من الحلول مجمع إلى كل بئر للآبار A13-P24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ القياس بالإضافة مركب آخر للآبار A1-P12، وتكرار للآبار A13-P24. </li></ol> 6. Analysis دمغ المصوغات البيانات مع BIND مشاهدة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح البيانات BIND فحص لقياس خط الأساس في نظام التشغيل Windows، وانقر على زر &quot;محرر الشبكة&quot; لتمكين تحديد الخلية. يقوم البرنامج حساب مقاييس المصالح التي يحددها المستخدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح &quot;بلج انس&quot;، والتي تشمل &quot;الباحث عن خلية&quot; وظيفة &quot;الخط الخلفي&quot;. مجموعة المعلمات في &quot;مكتشف الخلية&quot; بحيث خلايا يمكن تمييزها من خلفية جهاز الاستشعار البيولوجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير ملف مخطط الخلية التي تحتوي على البيانات &quot;الباحث عن خلية&quot; لقياس خط الأساس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 6،1-6،2 للبيانات بالإضافة مركب آخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح &quot;الخط الخلفي&quot; في المكونات واستيراد خريطة خلية من قياس خط الأساس. يقوم البرنامج حساب التحول في PWV بين البيانات الأساسية ومجمع آخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;Δ خلية متوسط&quot; لإخراج هذا التحول يعني في PWV للخلايا. ويمكن بعد ذلك يتم تصدير البيانات إلى Microsoft مريض بالحبش لمزيد من التحليل. </li></ol>

<ol>
	<li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion Channels of Excitable Membranes. , (1992).</li><li>Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conducting+functions+of+voltage-gated+ion+channels.">Non-conducting functions of voltage-gated ion channels.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).</li><li>Levitan, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+protein+complexes+associated+with+neuronal+ion+channels.">Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels.</a> Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).</li><li>Shamah, S. M., Cunningham, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+cell-based+assays+using+photonic+crystal+optical+biosensors.">Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors.</a> Analyst. 136, 1090-1102 (2011).</li><li>Cunningham, B. T., Laing, L. M. i. c. r. o. p. l. a. t. e. -. b. a. s. e. d. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+detection+of+biomolecular+interactions:+applications+in+proteomics.">label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics.</a> Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).</li><li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays.">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).</li><li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing.">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).</li><li>Cunningham, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+assays+on+the+BIND+system.">Label-free assays on the BIND system.</a> J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).</li><li>Hessel, A. a. O., A, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Theory+of+Wood's+Anomalies+on+Optical+Gratings.">A New Theory of Wood's Anomalies on Optical Gratings.</a> Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).</li><li>Cunningham, B. T., Laing, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+application+of+label-free+detection+assays+in+drug+screening.">Advantages and application of label-free detection assays in drug screening.</a> Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).</li><li>Lee, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+optical+biosensor:+a+tool+for+G+protein-coupled+receptors+pharmacology+profiling+and+inverse+agonists+identification.">Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification.</a> J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).</li><li>Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+K++channels,+Na++is+the+new+Ca2.">For K+ channels, Na+ is the new Ca2.</a> Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).</li><li>Santi, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+regulation+of+Slick+and+Slack+K++channels+by+neuromodulators.">Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators.</a> J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).</li><li>Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slack+and+Slick+K(Na)+channels+regulate+the+accuracy+of+timing+of+auditory+neurons.">Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons.</a> J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).</li><li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+controls+gating+of+the+sodium-activated+potassium+channel.">Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel.</a> 13, 819-821 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuronal+excitability+by+interaction+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+slack+potassium+channels.">Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels.</a> J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).</li><li>Barcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+gain-of-function+KCNT1+channel+mutations+cause+malignant+migrating+partial+seizures+of+infancy.">De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy.</a> Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).</li><li>Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+optical+biosensors+to+detect+modulation+of+Slack+potassium+channels+by+G+protein-coupled+receptors.">Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors.</a> J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).</li><li>Nelson, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+diacylglycerol+degradation+to+M1+muscarinic+receptors+by+beta-arrestins.">Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins.</a> Science. 315, 663-666 (2007).</li><li>Zhang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Gribbon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+real-life+high-throughput+screening+data.">Evaluating real-life high-throughput screening data.</a> J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).</li></ol>

ستيفن M. شامة هو موظف من X-هيئة العلوم البيولوجية.

ى رئيس (Z &#39;) عامل هو طريقة إحصائية موحدة لقياس نوعية عالية الإنتاجية الفرز مقايسة 20، ولأن الفرز للمنبهات GPCR في هذا الاختبار وقع في SBS متوافق فحص 384 جيدا، ويوفر ممتازة مقياس لقوة وصحة هذا الاختبار 21. قيمة من الألف إلى الياء &quot;من 1 إلى مقايسة مثالية نظريا مع ?...

دراسة الخلايا الحية في سياقها ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية أمر حاسم لفهم الوظائف البيولوجية للأهداف الخلوية. ومع ذلك، المقايسات دراسة التفاعل بين القنوات وبروتينات حشوية التنظيمية، مثل فحوصات coimmunoprecipitation، وتوفير عموما القليل من المعلومات على مدار الساعة من التفاعلات في الخلايا الحية. غالبية المقايسات خلية مقرها الحالي قياس حدثا الخلوية محددة، مثل إزفاء من البروتين الموسومة fluorescently من الفائدة. هذه المقايسات تتطلب إدخال تعديلات على البروتينات المثيرة للاهتمام، والتي يمكن أن يحتمل تغيير السلوك البروتين وتقلل من أهميتها الفسيولوجية للهدف. المقايسات خلية مقرها موسع، والتي لا تتطلب التلاعب في النظام، وتوفير القياس المستمر من النشاط الخلوي والسماح للخلايا في الدراسات الأكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية الدولة 4. تم تصميم أجهزة الاستشعار البصرية لإنتاجتغيير قابلة للقياس في سمة من الضوء الذي يترافق إلى السطح الاستشعار. أجهزة الاستشعار البصرية التي تستخدم موجات زائل، والتي تشمل سطح مأكل صدى (SPR) والطول الموجي صدى صريف (RWG) التقنيات، وقد استخدمت في المقام الأول للكشف عن الانتماءات وحركية جزيئات ملزم لمستقبلات بيولوجية عن أداء وظائفها على سطح جهاز الاستشعار. في الآونة الأخيرة، وقد تم تطوير أجهزة الاستشعار المتاحة تجاريا RWG للسماح للكشف عن التغير النسبي في الكتلة داخل الجزء السفلي من الخلايا الملتصقة على سطح مستشعر بدقة مكانية عالية (تصل إلى 3.75 ميكرون / بكسل) 5. ويمكن لهذه التغييرات في أجهزة الاستشعار كشف جماعية بالقرب من غشاء البلازما من الخلايا الحية التي تنتج عن التحفيز، مثل التصاق الخلية والانتشار، سمية وانتشارها ومسارات الإشارات التي تسببها مجموعة متنوعة من مستقبلات سطح الخلية بما في ذلك G-البروتين مستقبلات جانب (GPCRs) 6 . أجهزة الاستشعار RWG كشف تشان النسبيةجنرال الكتريك في مؤشر الانكسار بوصفها وظيفة من التغير النسبي في الكتلة ضمن 150 نانومتر من جهاز الاستشعار البيولوجي 7. عندما ومطلي الخلايا إلى جهاز الاستشعار البيولوجي، وهذا التغير في الرقم القياسي للانكسار يعكس التغير في كتلة بالقرب من غشاء البلازما الخلية الناتجة عن التغير في الانضمام الخليوي الى جهاز الاستشعار البيولوجي. وهذا البروتوكول مناقشة الكشف عن التفاعلات قناة البروتين باستخدام أجهزة الاستشعار RWG. تتكون مجموعة العمل الخاصة باللاجئين أنظمة الحصول على البيانات من عدة مكونات. لأن X-هيئة العلوم البيولوجية BIND الماسح الضوئي كان يستخدم لهذه التجارب، ونحن يجب الرجوع إلى مكونات هذا النظام على وجه الخصوص، والذي يتألف من قارئ لوحة، أجهزة الاستشعار المرتبطة بها، BIND المسح الضوئي البرمجيات الاستحواذ، وبرامج التحليل BIND عرض 8. وأجهزة الاستشعار الضوئية الكريستال، ويشار إليه فيما بعد أجهزة الاستشعار البصرية و، وتتكون من ترتيب الدوري لعازلة والمادية في 2 أو 3 أبعاد والذي يحول دون انتشار الضوء في محددةموجات والاتجاهات. وتستند هياكل الكريستال الضوئية على ظاهرة تسمى شذوذ وود. اكتشفت لأول مرة من قبل وود في عام 1902، وهذه الحالات الشاذة هي الآثار التي لوحظت في طيف الضوء الذي ينعكس من خلال حواجز شبكية حيود البصرية حيث تحدث تغيرات سريعة في شدة سيما أوامر حيود في بعض نطاقات التردد ضيقة. في عام 1962، قدم هيسيل وOliner نظرية جديدة من الشذوذ وود التي صريف فترة محدودة يولد طول موجة الرنين مكانة 9. في أجهزة الاستشعار البصرية وصفها هنا، وتستخدم الشذوذ وود لإنتاج جهاز الاستشعار البيولوجي RWG أنه عندما حفز مع الضوء الأبيض يعكس سوى نطاق ضيق جدا من الأطوال الموجية (عادة بين 850-855 نانومتر). تتكون أجهزة الاستشعار الفردية من مادة البلاستيك المنخفض مؤشر الانكسار مع هيكل سطح الدورية التي المغلفة بطبقة رقيقة من ثاني أكسيد عازلة مادة التيتانيوم عالية الانكسار (تيو 2). عندما biosensأو مضاءة مع مصدر ضوء طول موجي واسع، صريف البصرية من البلورات الضوئية ويعكس نطاق ضيق من موجات الضوء التي تقاس في معمل الماسح BIND. ثم يتم حساب كثافة ذروة موجات تنعكس (قمة الطول الموجي القيمة، أو PWV) من إشارة. وPWV من تحولات الضوء على تغيير في معامل الانكسار نتيجة لزيادة أو نقصان في كتلة داخل القرب (~ 150 نانومتر) من سطح جهاز الاستشعار البيولوجي. يتم دمج أجهزة الاستشعار البصرية الى جمعية القياسية للعلوم البيولوجية (SBS) صفيحة ميكروسكوبية 384 جيدا لالمقايسات المستخدمة في هذه التجارب. وتستخدم أجهزة الاستشعار RWV للكشف عن التغييرات على إضافة الإشارات الخارجية في الخلايا الحية 10. ومثقف الخلايا مباشرة على سطح جهاز الاستشعار البيولوجي RWG ويتم مراقبة التغير في الرقم القياسي المحلي من الانكسار عند العلاج مع المثيرات محددة. اتجاه التغيير في الكتلة في جهاز الاستشعار البيولوجي يمكن أن يكونتحديد، لأن يقاس زيادة في المؤشر المحلي من نتائج الانكسار من زيادة في الكتلة بالقرب من جهاز الاستشعار البيولوجي وحيث أن زيادة PWV. على العكس من انخفاض في كتلة تنتج انخفاضا في PWV. التغيير في الكشف عن PWV يمكن أن تنجم عن العديد من الأحداث الخلوية، بما في ذلك التغيرات في التصاق الخلية والبروتين التوظيف / الإفراج عنهم، الإلتقام وإعادة التدوير، إيماس، موت الخلايا المبرمج، وإعادة ترتيب هيكل الخلية. على سبيل المثال، يمكن فحص كشف عن تغيرات في التفاعلات قناة البروتين بين قنوات البوتاسيوم وغيرها من مكونات حشوية أو هيكل الخلية. هذا الحدث، ومع ذلك، يجب أن تحدث داخل منطقة الكشف نانومتر ~ 150 بالقرب من جهاز الاستشعار البيولوجي، وفي حالة وجود الخلية المرفقة، بالقرب من غشاء البلازما. يتم تنفيذ اكتساب الاستجابات الخلوية مع BIND المسح الضوئي البرمجيات ويتم إنشاء تمثيل صورة كل من الآبار 384 في لوحة SBS. هذا النظام لديه دقة تصل الى 3.75 ميكرون / بكسل، مما يسمح للكشف عن الأحداث في زنازين انفرادية، ويمكن استخدامها إما مع خطوط الخلايا (مثل الخلايا أو HEK293 CHO) أو مع أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية الخلايا الأولية. تحليل الصور مع BIND عرض البرنامج يسمح للكشف عن الاستجابات الخلوية في كل من الفرد والسكان من الخلايا. كما يتم دمج أجهزة الاستشعار في مستوى SBS 384 جيدا microplates، ونظام قابل للتكيف بسهولة لفحص عالية الإنتاجية (HTS). وقد سبق استخدام الرنين طول الموجة أجهزة الاستشعار البصرية صريف للكشف عن تغيرات في كتلة بالقرب من غشاء البلازما من الخلايا التالية تفعيل GPCRs 11. مختبرنا والمستنسخة اثنين من قنوات البوتاسيوم (K نا) تنشيط الصوديوم، سلاك-B والبقعة 12. وقد تبين أن نشاط كل القنوات سلاك-B والبقعة لتكون بقوة تتأثر التنشيط المباشر للبروتين كيناز C (PKC) 13. تفعيل البروتين Gα ف مستقبلات مزدوجة، مثل مستقبلات المسكارينية M1 وmGluR1 metabotropic الغلوتامات صeceptor، وينظم النشاط أكثر قدرة القناة من خلال تفعيل PKC. هذه القنوات K نا تسهم في التكيف العصبية خلال التحفيز المستمر وتنظيم دقة توقيت العمل إمكانات 14. ومن المعروف أن القنوات الركود للتفاعل مع مجموعة متنوعة من الجزيئات يشير حشوية، بما في ذلك FMRP، والهشة البروتين X التخلف العقلي 15،16. نتيجة طفرات في سلاك في ترحيل متعددة النوبات الجزئية من الطفولة (MMPSI)، وهو شكل بداية مبكرة من الصرع الذي ينتج تأخر في النمو الشديد 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="723">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Geneticin G-418 Sulfate</td>
			<td style="width:172px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB05057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">HBSS</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">DPBS</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer</td>
			<td style="width:172px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Carbamoylcholine chloride</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Finnpipette (5-50 &#181;l)</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4662090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">BIND Scanner System</td>
			<td style="width:172px;">X-BODY Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">384-well TiO2 coated plates</td>
			<td style="width:172px;">X-BODY Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">TiO-96-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of label-free optical biosensors to detect modulation of potassium channels by g-protein coupled receptors

القنوات الأيونية سيطرة على الخواص الكهربائية للخلايا العصبية وغيرها من أنواع الخلايا منفعل من خلال السماح بشكل انتقائي الأيونات في التدفق من خلال غشاء البلازما 1. لتنظيم استثارة الخلايا العصبية، يتم تعديل خصائص الفيزيائية الحيوية من القنوات الأيونية التي كتبها إشارات البروتينات والجزيئات، والتي غالبا ما ربط قنوات أنفسهم لتشكيل مغايرة التغصن 2،3 معقدة القناة. المقايسات التقليدية دراسة التفاعل بين القنوات والبروتينات التنظيمية تتطلب تسميات الخارجية التي يمكن أن يحتمل تغيير السلوك البروتين وتقلل من أهميتها الفسيولوجية للهدف، مع توفير القليل من المعلومات على مسار وقت التفاعلات في الخلايا الحية. أجهزة الاستشعار البصرية، مثل نظام X-هيئة العلوم البيولوجية BIND سكانر، استخدام خالية من التسمية التكنولوجيا الرواية، صدى الطول الموجي صريف (RWG) أجهزة الاستشعار البصرية، للكشف عن تغيرات في الرنانة الضوء المنعكس بالقرب من جهاز الاستشعار البيولوجي. يسمح هذا الفحص الكشف عن النسبيةتغيير في كتلة داخل الجزء السفلي من الخلايا الحية تمسكا سطح جهاز الاستشعار البيولوجي الناتجة عن التغيرات التي يسببها يجند في التصاق الخلية والانتشار، سمية، والانتشار، والتغيرات في البروتين البروتين التفاعلات بالقرب من غشاء البلازما. وقد استخدمت أجهزة الاستشعار البصرية RWG للكشف عن تغيرات في كتلة بالقرب من غشاء البلازما من الخلايا التالية تفعيل G مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs)، مستقبلات التيروزين كيناز، وغيرها من مستقبلات سطح الخلية. ويمكن أيضا التغييرات التي يسببها يجند في أيون قناة البروتين التفاعلات دراستها باستخدام هذا الاختبار. في هذه الورقة، فإننا سوف تصف إجراء التجارب المستخدمة للكشف عن التشكيل من سلاك-B-تنشيط الصوديوم والبوتاسيوم (K نا) القنوات بواسطة GPCRs.

وكانت المصنفة الركود-B ستابلي HEK-293 الخلايا والسيطرة untransfected HEK-293 الخلايا في الخلايا 1،000 / جيدا على 384 جيدا، ECM المغلفة لوحات RWG جهاز الاستشعار البيولوجي. وسجلت الصور من وسط 1.5 مم 2 للجهاز الاستشعار البيولوجي بدرجة وضوح 3.75 ميكرون / بكسل (الشكل 1). وقد تم توليد ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors at JoVE.com

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

يمكن أن تقنيات الاستشعار البيولوجي البصرية الكشف عن التغييرات في كتلة بالقرب من غشاء البلازما في الخلايا الحية وتسمح لأحد أن يتبع الاستجابات الخلوية في كل من الخلايا الفردية والسكان الخلايا. ووصف هذا البروتوكول الكشف عن التشكيل قنوات البوتاسيوم التي كتبها G-بروتين المستقبلات في خلايا سليمة إلى جانب استخدام هذا النهج.

استخدام تسمية خالية أجهزة الاستشعار البصرية لكشف التحوير من قنوات البوتاسيوم التي كتبها G-بروتين المستقبلات اقترن

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

use-label-free-optical-biosensors-to-detect-modulation-potassium

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Views.  Yale School of Medicine.  يمكن أن تقنيات الاستشعار البيولوجي البصرية الكشف عن التغييرات في كتلة بالقرب من غشاء البلازما في الخلايا الحية وتسمح لأحد أن يتبع الاستجابات الخلوية في كل من الخلايا الفردية والسكان الخلايا. ووصف هذا البروتوكول الكشف عن التشكيل قنوات الب...

Video: Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

ربط المسابر البيولوجي لأجهزة الاستشعار البصرية عن طريق وكلاء السيليكا اقتران silane

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

عدم الاتصال، تسمية خالية من رصد خلايا المصفوفة خارج الخلية، وباستخدام التحليل الطيفي رامان

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

كشف البصري<em&gt; E. القولونية</em&gt; البكتيريا عن طريق أجهزة الاستشعار السيليكون Mesoporous

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation من واحدة RNA الجزيئات بواسطة الملقط البصرية

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

وبيوشيب الكهروكيميائية استنادا ميكروفلويديك لتسمية خالية تحليل الحمض النووي التهجين

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

تقنية تسمية خالية لتصوير المكانية والزمانية لإفرازات خلية واحدة

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

تسمية خالية واحدة كشف الجزيئة عن طريق Microtoroid البصرية الرنين

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

استخدام الإنزيم بيوسينسور كوندوكتيميتريك β-lactamase المستندة إلى الكشف عن التفاعلات الجزيئية البيولوجية

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

بيب على رقاقة: دراسة خالية من التسمية من التفاعلات البروتين فسفوانوسيتيد

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations and development of microstructurally motivated mathematical models for understanding the mechanical properties of human resistance arteries in health and disease have the potential to aid understanding how disease and medical treatments affect the human microcirculation. To develop these mathematical models, it is essential to decipher the relationship between the mechanical and microarchitectural properties of the microvascular wall. In this work, we describe an ex vivo method for passive mechanical testing and simultaneous label-free three-dimensional imaging of the microarchitecture of elastin and collagen in the arterial wall of isolated human resistance arteries. The imaging protocol can be applied to resistance arteries of any species of interest. Image analyses are described for quantifying i) pressure-induced changes in internal elastic lamina branching angles and adventitial collagen straightness using Fiji and ii) collagen and elastin volume densities determined using Ilastik software. Preferably all mechanical and imaging measurements are performed on live, perfused arteries, however, an alternative approach using standard video-microscopy pressure myography in combination with post-fixation imaging of re-pressurized vessels is discussed. This alternative method provides users with different options for analysis approaches. The inclusion of the mechanical and imaging data in mathematical models of the arterial wall mechanics is discussed, and future development and additions to the protocol are proposed.

We describe simultaneous mechanical testing and 3D-imaging of the arterial wall of isolated, live human resistance arteries, and Fiji and Ilastik image analyses for the quantification of elastin and collagen spatial organization and volume densities. We discuss the use of these data in mathematical models of arterial wall mechanics.

تقييم الكولاجين والايلاستين ميكروارتشيتيكتوريس تعتمد على الضغط في الشرايين المقاومة البشرية، والعيش بالفحص المجهري Fluorescence تسمية خالية

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...