מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תכנית מחקר המיפוי של המכון הלאומי לסרטן במכון הלאומי לבריאות, ועל ידי NCI להעניק UA5CA152907.

1 האוסף של מדיה אוויר לבדיקת פוטנציאל angiogenic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים ראשוניים או הונצחו להיבדק לפוטנציאל angiogenic או אנטי אנגיוגנזה בתקשורת בסרום ילידים נמוכה או לאסוף את התקשורת ממוזגת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, שימוש מותנה בתקשורת באופן מיידי, או aliquoted ומאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים. השתמש בתקשורת בסרום ילידים נמוכה או nonconditioned כביקורת שלילית, ולהשתמש במדיה מיזוג אינם מלאים צמיחה (10% FBS, או ריכוז מתאים) כביקורת חיובית. לחלופין, כדי לבדוק את גירוי פוטנציאל של אנגיוגנזה, תקשורת הפשיטה פחם תוספת חסרת גורמי גדילה עם ריכוזים ידועים של חלבונים ספציפיים של עניין ולהשוות לתקשורת חופשית גורם גדילה לבד. </li></ol></li></ol> .2 הכנת תאי האנדותל לפני Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לפני assay, מעבר 3B-11 תאים לתוך T-75 בקבוק חדש. מספר מעבר של תאים חשוב. assay זה עובד הכי טוב כאשר תאים הם בין הקטעים השניה והשישי. Assay לא יעבוד גם אם תאי האנדותל משמשים לפני השני או לאחר המעבר עשירית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים ל24 שעות DMEM בתוספת 10% FBS, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, פירובט נתרן 1 מ&quot;מ, 100 U / ml פניצילין, ו100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני assay, סרום להרעיב 3B-11 תאים כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב מתאי 3B-11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיה סרום מופחתת של DMEM בתוספת FBS 0.2%, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, פירובט נתרן 1 מ&quot;מ, 100 U / ml פניצילין, ו100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים ל24 שעות נוספות. </li></ol></li></ol> .3 הכנת ריאגנטים לפני Assay הערה: ריכוזי BME הם משתנים מאוד תלויים בהרבה. BME לא עובד טוב אם הריכוז הוא פחות מ -10 מ&quot;ג / מ&quot;ל, ולכן יצרן BME יש לפנות לפני רכישה על מנת להבטיחרכישה של הרבה מרוכז כראוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה מופחתת גורם גדילת BME במקרר. BME מתמצק כאשר חם, ולכן הוא חייב להיות כל הזמן קר לפני השימוש. ניתן לאחסן BME תחת קירור במשך כמה שבועות, או aliquoted וקפוא ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גורם גדילה מופחת BME עדיף על פני BME המסורתי. חוסר גורמי angiogenic בBME יעשה את זה קל יותר להבחין בהשפעה שיש לי גורמים מהתקשורת המותנה בהיווצרות צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת הפשרה להיבדק. </li></ol> .4 הכנת תאי האנדותל מייד לפני Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3B-11 תאים בDPBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הדמיה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal היא רצויה, לפני הכביסה 3B-11 תאים, להוסיף AM calcein לתאי האנדותל בכלי תקשורת בריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל. הנח תאי שכותרתו calcein בחושך ב37 ° C ו 5% CO 2 לפני תחילת assay. לפזר calcein המניהAM בDMSO ופעם calcein מדולל בריכוז סופי תקשורת של DMSO לא יעלה על 0.1%. אחרי 30-45 בבוקר calcein לשטוף דקות מהתאים (שלב 4.1 לעיל) ולהמשיך בניסוי הבא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאים על ידי הוספת 1 מ&quot;ל טריפסין-EDTA לT-75 בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר trypsinization הוא מלא, לנטרל טריפסין על ידי resuspending תאים לנפח סופי של 10ml בDMEM, 10% FBS, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, פירובט נתרן 1 מ&quot;מ, 100 U / ml פניצילין, ו100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי סינון דרך מסננת תא 100 מיקרומטר כדי להסיר גושים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים ותאי resuspend לריכוז סופי של 7.5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל בDMEM, 10% FBS, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, פירובט נתרן 1 מ&quot;מ, 100 U / ml פניצילין, ו100 מיקרוגרם / מ&quot;ל סטרפטומיצין. </li></ol> Assay גיבוש .5 Tube <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח טיפים 24 גם צלחת ו1 מ&quot;ל במקרר או על קרח למשך 20-30 דקות לפני טעינת הצלחת כך שBME לא Prematurely לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 250 μl של גורם גדילה המופחת BME לבאר כל צלחת 24 גם. הימנע מיצירת בועות על ידי לא מדכא פיפטה לתחנתה הסופית בעת הניפוק. תשמור על עצמך שBME מספיק נשאר במרכז גם כאשר צורות המניסקוס; אם המטריצה ​​היא רזה מדי, התאים רק יוצרים שכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת 24 גם על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות כדי לגבש את BME. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שBME קבע, לערבב כ 300 μl של תקשורת ממוזגת עם 10 μl של 3B-11 תאי resuspended (כ 75,000 תאים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את עוצמת הקול של מדיה ומספר התאים מצופים בהתאם לסוג תא האנדותל בשימוש מותנים, ולבדוק את דילולים סדרתי של התקשורת המותנה להפגין פעילות. אם תאי השוואה גדלו בתנאים שונים, לנרמל התנה תקשורת נפח למספר התאים ששימשו להתנות את התקשורת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> wil צינורותl מתחיל להיווצר בתוך 2-4 שעות. בהתאם לריכוז גורם angiogenic בתקשורת המותנה, היווצרות צינור שיא עלולה להתרחש בין 3 ל 12 שעה והעיתוי של assay יצטרך להיות מותאם. אם עובד עם תאי האנדותל עיקריים במקום תאים הונצחו, היווצרות צינור ראשונית עשויה להתעכב בכמה שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות לעתים קרובות יתחילו להתדרדר בתוך 18 תאי שעה ואנדותל יעבור אפופטוזיס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת היווצרות צינור שיא, תקשורת לשאוב בזהירות מהבאר כדי למנוע שיבוש רשת הצינור על BME. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב עם כל 1 DPBS מ&quot;ל, ואז לשאוב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדמיה מיידית, להוסיף 1 מ&quot;ל DPBS הטרי לכל רשת צינור היטב ותמונה באמצעות מיקרוסקופ הפוך מצורף למצלמה דיגיטלית, או הקרינה / מיקרוסקופ confocal אם התאים היו מוכתמים בבוקר calcein כמו ב4.1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתקן את רשת הצינור להדמיה מאוחר יותר, ולהוסיף paraformaldehyde 4% לכל אחדלהישאף היטב דגירה ל15 דקות בטמפרטורת חדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר paraformaldehyde, לשטוף פעמיים עם DPBS, ולאחר מכן להוסיף 1mL DPBS הטרי היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה מיקרוסקופית לפני הקיבוע ככמה צינורות עשויים לשבור במהלך הליך זה. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> .6 כימות רשת Tube <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את רשת הצינור במספר דרכים שונות בהתאם להעדפותיו של החוקר, ויש לי כמה תוכנות מחשב יכולת למדוד את הפרמטרים הבאים: מספר הצינורות; מספר לולאות / רשתות; מספר אתרי סניף / צמתים; אורך של צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת מחשב נציג כגון J תמונה עם תוסף אנגיוגנזה Analyzer 16 לכימות של רשתות צינור. </li></ol>

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438, 932-936 (1038).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473, 298-307 (2011).</li><li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis.">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146, 873-887 (2011).</li><li>Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+and+VEGF+in+vascular+development.">Endothelial cells and VEGF in vascular development.</a> Nature. 438, 937-945 (2005).</li><li>Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+pro-+and+anti-angiogenic+factors+as+targets+of+clinical+intervention.">A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention.</a> Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).</li><li>Ausprunk, D. H., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+and+proliferation+of+endothelial+cells+in+preformed+and+newly+formed+blood+vessels+during+tumor+angiogenesis.">Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis.</a> Microvascular research. 14, 53-65 (1977).</li><li>Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+tumour+vasculature:+insights+from+physiological+angiogenesis.">Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis.</a> Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).</li><li>Chung, A. S., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+pathological+angiogenesis.">Developmental and pathological angiogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 563-584 (2011).</li><li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis.">Tumor angiogenesis.</a> The New England journal of medicine. 358, 2039-2049 (2008).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+therapeutic+implications.">Tumor angiogenesis: therapeutic implications.</a> The New England journal of medicine. 285, 1182-1186 (1056).</li><li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures.">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).</li><li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+cell+tube+formation+assay+on+basement+membrane+turns+20:+state+of+the+science+and+the+art.">The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art.</a> Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature protocols. 5, 628-635 (2010).</li><li>Walter-Yohrling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+endothelial+cell+lines+as+models+of+tumor+endothelial+cells.">Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).</li><li>Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells.">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> Journal of immunology. , 144-521 (1950).</li><li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+contribution:+Angiogenesis+Analyzer.">ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer.</a> ImageJ News. , (2012).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

אנגיוגנזה היא מעורבת בשני תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים. חקר מנגנונים המעורבים באנגיוגנזה דורש השימוש במבחנים שיסכמו את השלבים העיקריים באנגיוגנזה. Assay היווצרות צינור תא האנדותל מציע מספר יתרונות על פני מבחני אחרים. זה קל להגדרה, הוא זול יחסית, מייצר tubules בתוך שעות...

אנגיוגנזה, הפיתוח של כלי דם חדשים מכלי preexisting, הוא חיונית עבור מגוון רחב של תהליכים לרבות גידול איברים, התפתחות עוברית, וריפוי פצע 1-3. חדש שפותח כלי דם, בשורה של תאי האנדותל, חמצן אספקה ​​וחומרים מזינים לרקמות, לקדם מעקב חיסוני על ידי תאי hematopoietic ולהסיר חומרי פסולת 2,4. אנגיוגנזה היא בעל חשיבות מרכזית בהתפתחות עוברית ועוברית. עם זאת, תהליך זה נשאר רדום במבוגרים, למעט בתקופות של ריפוי פצעים, צמיחת שלד, הריון או במהלך המחזור החודשי 1-3. במהלך שני העשורים האחרונים, מנגנונים מולקולריים מרכזיים המסדירים אנגיוגנזה החלו לצוץ. אנגיוגנזה היא אירוע בחוזקה מוסדר, מאוזנת אותות פרו וantiangiogenic כוללים integrins, כמוקינים, angiopoietins, סוכני חישת חמצן, מולקולות junctional ומעכבי אנדוגני 5. ברגע שproangאותות iogenic כגון גורם בסיסי גידול פיברובלסטים (bFGF), גורם גדילה של אנדותל כלי דם (VEGF), גורם גדילה המופק טסיות דם (PDGF), וגורם הגדילה באפידרמיס (EGF) להפעיל תא האנדותל קולטניים תאי האנדותל לשחרר פרוטאזות להשפיל קרום במרתף. תאי האנדותל אז להתרבות ולהעביר, ויצרו נבטים בשיעור של כמה מילימטרים ליום 6,7. אנגיוגנזה קשורה למצבים פתולוגיים שונים, כוללים סרטן, פסוריאזיס, רטינופתיה סוכרתית, דלקת מפרקים, אסטמה, הפרעות אוטואימוניות, מחלות זיהומיות, וטרשת עורקת 8-10. בשל החשיבות של אנגיוגנזה במחלות שונות, הבנת גנים ומסלולים המווסתים את התהליך הזה הוא קריטי לעיצוב של תרופות טובות יותר. Assay היווצרות הצינור הוא שיטה מהירה וכמותיים לקביעת גנים או מסלולים מעורבים באנגיוגנזה. תואר לראשונה בשנת 1988,העקרונות שבבסיס assay זה הם שתאי האנדותל שומרים על היכולת להתחלק ולהעביר במהירות בתגובה לאותות angiogenic 11-13. יתר על כן, בתאי האנדותל הנגרמים לבדל וליצור מבנים דמויי צינור כאשר בתרבית על מטריצה ​​של תמצית קרום במרתף (BME). צינורות אלה מכילים לומן מוקף בתאי האנדותל המקושרים ביניהם באמצעות מתחמי junctional. היווצרות צינור מתרחשת במהירות עם רוב הצינורות ויוצרים בassay זה בתוך 2-6 שעות בהתאם לכמות וסוג של גירויי אנגיוגנזה. מספר סוגים של תאי האנדותל יכולים לשמש עבור assay זה כולל שני תאים ראשוניים ושורות תאים הונצחו 14,15. שורת התא המשמשת למאמר זה הייתה עכבר 3B-11, אך אותן השיטות יכולות להיות מיושמת עם קווים אחרים אנדותל תא כגון SVEC4-10 (עכבר) או תאי האנדותל עיקריים כגון HUVEC תאים (אדם). תלוי באיזה קו סלולארי משמש והאם ce אנדותלLLS הופכים או לא הופך, אופטימיזציה תצטרך להתנהל כדי לזהות את הזמן האידיאלי נחוץ להיווצרות צינור נכונה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:339px;">Item</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Manufacturer</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">Catalog #</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="93">
			<td height="114" rowspan="2" style="height:114px;width:339px;">Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">3524</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="190" rowspan="2" style="height:190px;width:339px;">BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">BD Biosciences</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">354230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="76" rowspan="2" style="height:76px;width:339px;">Gibco 0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">25300-054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="95" rowspan="2" style="height:95px;width:339px;">Gibco L-Glutamine 200mM (100X)</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">25030-081</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Gibco Pen Strep</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Gibco DMEM (1X)</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">11965-092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Gibco DPBS (1X)</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">14190-144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Atlas Biologicals</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">F-0500-A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Calcein AM</td>
			<td style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:124px;">C3100MP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMSO</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">4-X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis

אנגיוגנזה היא תהליך חיוני להתפתחות רקמות נורמלית וריפוי פצעים, אלא גם קשורה עם מגוון רחב של מצבים פתולוגיים. שימוש בפרוטוקול זה, אנגיוגנזה ניתן למדוד במבחנה באופן מהיר, לכימות. תאי האנדותל ראשוניים או הונצחו מעורבבים עם תקשורת מותנית ומצופים על מטריצת קרום במרתף. תאי האנדותל יוצרים נימים כמו מבנים בתגובה לאנגיוגנזה אותות מצאו בתקשורת מותנית. היווצרות הצינור מתרחשת במהירות עם תאי האנדותל מתחילים ליישר את עצמם בתוך שעה 1 וצינוריות המכיל לומן מתחילים להופיע בתוך 2 שעות. יכולים להיות דמיינו צינורות באמצעות מיקרוסקופ ניגוד הפוך שלב, או ניתן לטפל בתאים עם AM calcein לפני assay והצינורות דמיינו באמצעות הקרינה או confocal. מספר אתרי סניף / צמתים, לולאות / רשתות, או מספר או אורך של צינורות שנוצרו ניתן לכמת בקלות כמדד בvitrאנגיוגנזה o. לסיכום, assay זה יכול לשמש כדי לזהות גנים ומסלולים המעורבים בקידום או העיכוב של אנגיוגנזה בצורה מהירה, לשחזור, וכמותי.

עכבר 3B-11 תאי האנדותל היו זורעים על גורם גדילה מופחתת הקרושה BME - בassay זה, מוצר Matrigel שימש - ואחריו לאורך זמן. כפי שניתן לראות באיור 1, גורמי angiogenic מופרשים על ידי שני הקרטינוציטים עכבר או פיברובלסטים הם מסוגלים גרימת היווצרות צינור לאורך זמן. תאי האנדותל להגר ולהת?...

Watch this Scientific Journal Video about Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis at JoVE.com

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Assay היווצרות הצינור הוא שיטה מהירה, לכימות למדידת אנגיוגנזה במבחנה. תאי האנדותל הם בשילוב עם אמצעי תקשורת מותנה ומצופים על תמצית קרום במרתף. היווצרות צינור מתרחשת בתוך שעות וצינוריות שהוקמו זה עתה לכמת בקלות.

Assay היווצרות צינור תא האנדותל ל<em&gt; במבחנה</em&gt; חקר אנגיוגנזה

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

endothelial-cell-tube-formation-assay-for-vitro-study

Research

JoVE Journal

Biology

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

59.0K Views.  American University.  Assay היווצרות הצינור הוא שיטה מהירה, לכימות למדידת אנגיוגנזה במבחנה. תאי האנדותל הם בשילוב עם אמצעי תקשורת מותנה ומצופים על תמצית קרום במרתף. היווצרות צינור מתרחשת בתוך שעות וצינוריות שהוקמו זה עתה לכמת בקלות. 

Video: Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

כריסטופר יוז: במודל חוץ גופית לחקר אנגיוגנזה (ראיון)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

אופטימליים הפיברין ג&#39;ל ביד Assay לחקר אנגיוגנזה

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic activity of vascular endothelial cells in vitro1-5. However, recently growing evidence has shown that this assay is not limited to test vascular behavior for endothelial cells. Instead, it also has been used to test the ability of a number of tumor cells to develop a vascular phenotype6-8. This capability was consistent with their vasculogenic behavior identified in xenotransplanted animals, a process known as vasculogenic mimicry (VM)9. There is a multitude of evidence demonstrating that tumor cell-mediated VM plays a vital role in the tumor development, independent of endothelial cell angiogenesis6, 10-13. For example, tumor cells were found to participate in the blood perfused, vascular channel formation in tissue samples from melanoma and glioblastoma patients8, 10, 11. Here, we described this tubular network assay as a useful tool in evaluation of vasculogenic activity of tumor cells. We found that some tumor cell lines such as melanoma B16F1 cells, glioblastoma U87 cells, and breast cancer MDA-MB-435 cells are able to form vascular tubules; but some do not such as colon cancer HCT116 cells. Furthermore, this vascular phenotype is dependent on cell numbers plated on the Matrigel. Therefore, this assay may serve as powerful utility to screen the vascular potential of a variety of cell types including vascular cells, tumor cells as well as other cells.

A tube formation assay is used to evaluate vascular activity of tumor cells.

Matrigel מבוסס גיבוש Tube Assay להעריך את פעילות Vasculogenic של תאים סרטניים

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

עשה זאת בעצמך התקן להבראת דוגמאות Cryopreserved בטעות ירד לתוך טנקים אחסון קריוגני

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

לפדר החצנה חולדה: דגם לחקירת דינמיקה סלולר המעורבים אנגיוגנזה

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

כימות של דביקות תא האנדותל<em&gt; במבחנה</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

מבדק פשוט עבור הערכת גורמי הגדילה של אנדותל כלי דם

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.