תמיכה כספית עבור רוב המחקרים סופק על ידי המועצה למחקר רפואי שוודית (מענק 5942).

1. בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכרסמים קטנים, כגון חולדות, עכברים, שרקנים, שימשו במודלים של בעלי חיים. למרבה הצער, עכברים בוגרים (זנים עכבר רבים כבר העריכו) נוטים חוסר או יש רק מספר נמוך מאוד של פוטנציאל הוריות microvessels (שממנה יכולה לנבוע אנגיוגנזה) בתוך חלונות mesenteric שלהם, מה שהופך את לימודי באמצעות עכברים אמין. לכן, assay פותחה בעיקר חולדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החולדות, אשר התאקלם לסביבה תקן לפחות 7 ימים לאחר הלידה מתוך המגדל, הם שוכנו בדרך כלל בכלוב סטנדרטי בזוגות תחת מחזור אור / חושך 12 שעות עם גישה חופשית למים כדורי. כל חיה מסומן. אנו משתמשים בעיקר חולדות מבוגרים צעירים (בדרך כלל 7-10 שבועות של גיל של זנים שונים, אך בדרך כלל זכר Sprague-Dawley חולדות; אצל חולדות צעירות יותר 5-6 שבועות של גיל מספר microvessels יליד נוטה להיות נמוך) המתקבל מגדלים שונים. בתקופה לפני הניסוי ובמהלך הניסוי, החיות הם שקלו כל יום שני, תמיד ביום של הקרבה. כאשר בעלי החיים מטופלים ip במקביל (לזירוז של אנגיוגנזה, ראה להלן) או sc iv או פו, הם שקלו כל יום. זה מאפשר הקמת קבוצות הניסוי והבקרה של משקל הגוף שווה בתחילת הניסוי, ומאפשר ניטור של השפעת הטיפול על הגוף, משקל לזכות במהלך הניסוי. מאז חולדות זכרים בוגרים לגדול וחסונה פיזיולוגית (צובר כ 40-60 גרם בשבוע, תלוי בסוג של מתח), משקל לזכות פיגור הוא סמן רגיש תחליף של רעילות, מערכתיות רווחה, אנורקסיה, וכישלון לשגשג. </li></ol> אנחנו עובדים מתקן ברמה גבוהה טיפול בבעלי חיים מאמצים רבים נעשים כדי לצמצם את רמות הלחץ שחווים בעלי החיים. קווים מנחים אתיים הנוכחי הם אלה שהקימו וורקמן פ et al. (הנחיות לרווחת ואת השימוש בבעלי חיים בחקר הסרטן. Br. J. Cancer 102, 1555-1577, 2010). ועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטת גטבורג אישרה את המחקרים הללו. 2. Pro-angiogenic intraperitoneal טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעד מועמד angiogenic גורם להיבדק הוא מומס בדילול מלא מלוחים, רעלן פנימי חינם המשמש עירוי של חולים (אפילו ברמות נמוכות מאוד, הוא רעלן פנימי הפרו angiogenic). כל הפתרונות בנויים טרי ביום ההזרקה, סטרילי, מסוננים (Millipore 0.22-מיקרומטר סינון), בדק את ה-pH נייטרלי (7.1-7.3), והשתמש בטמפרטורת החדר. סוכן הבדיקה מוזרק בריכוזים נמוכים או נמוכים מאוד. לדוגמה, החולדה rVEGF 164 (564-RV/CF; מו&quot;פ מערכות אירופה בע&quot;מ, Oxon, בריטניה), המהווה את VEGF-A השולט איזופורם בחולדות, הוא מדולל ל pmole 96 / מ&quot;ל מלוחים רעלן פנימי חינם, קפוא ו מופשר נפח של 5 מ&quot;ל מוזרק לתוך ה-IP החולדה. אנו משתמשים מזרק 5 מ&quot;ל עם מחט 0.8 מ&quot;מ (מחט ירוקים, 21G) להזרקה ip. טיפול זה, בהתחשב פעמיים ביום למשך 4.5 ימים, כלומר. מ שני בבוקר (יום 0) עד יום שישי בבוקר (יום 4), גורם לתגובה חזקה אנגיוגנזה הנבטה ברקמת מבחן mesenteric, שבשיאה הגיעה ל 21 יום מסביב. ניהול ה-IP הפתרון מבטיח כי נפח כולו מועבר לתוך חלל הצפק (ולא לתוך שלפוחית ​​השתן, המעיים או כל איבר אחר). הזרקה מהירה של 5 מ&quot;ל מאפשר מישוש אישור על ידי המפעיל כי סילון הנוזל עבר דרך דופן הבטן לתוך חלל הבטן. בהמשך, לפני או במקביל לטיפול הפרו angiogenic ip, סוכן בכל מבחן של הבחירה יכול להינתן באופן מערכתי. </li></ol> 3. Administation מערכתית של אנגיוגנזה-ויסות סוכנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתיב אחר מלבד דרך ה-IP יכולה לשמש, שכן טיפול ip עשוי להשפיע על תגובת angiogenic מתמשך באמצעות אינדוקציה של דלקת או אולי על ידי הפעלת תא הפיטום ברקמות הבדיקה, אשר יכול להוביל לתגובה הפרו angiogenic חזק. מלבד אוראלית או בהזרקה sc יחיד או iv, אנו מרבים להשתמש sc הממשל באמצעות minipumps אוסמוטי (אחד או יותר, עם כמויות משתנות ושאיבה פעמים) כדי לספק את הפתרון בקצב קבוע לתקופה של עד שנתיים או מספר שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אינפוזיה תת עורית ממושכת של סוכנים מבחן מילוי השתלת minipumps האוסמוטי בדרך כלל ב 5 יום, כלומר יום אחד לאחר סיום הטיפול VEGF ip, minipumps אוסמוטי (לדוגמה, דגם 2ML2, עם קצב שאיבה קבועה של 5.0 μl / שעה במשך 14-15 ימים; משאבות אוסמוטי Alzet, Mountain View, CA , ארה&quot;ב) מלאים בתנאים סטריליים עם סוכן הבדיקה או את הרכב המתאים. לאחר אחסון סטריליים 0.9% (w / v) NaCl לילה בשעה 37 ° C, את המשאבה (ים) מושתל בניתוח sc על הגב (בצד של colu השדרהmn באזור השכמות) של חולדות שהיו בהרדמה באמצעות גז isoflurane (Isoba וטרינר, שרינג פלאו לבריאות בעלי חיים, Merck &amp; Co, Inc, Whitehouse Station, ניו ג&#39;רזי, ארה&quot;ב), תחילה בחדר שקוף אטום ו לאחר מכן באמצעות מסכה (כדי לצמצם את הלחץ שנגרם לבעל החיים הבא, החדר הוא הסמיק עם אוויר לפני שהוא בה שימוש חוזר). החתך בעור עשה עבור השתלת המשאבה הוא sutured מיד לאחר ההשתלה באמצעות חוט משי. מאז החיות במשקל פיזיולוגית במהלך תקופת הניסוי סוכני הבדיקה ניתנות בקצב קבוע, המינון שנבחר בפועל עבור התרופה מבחן לכל ק&quot;ג משקל גוף גבוה יותר מאשר המינון הממוצע בתחילת התקופה עירוי נמוכה מאשר המינון הממוצע בסוף התקופה עירוי. עירוי רציף, כפי שתואר כאן, ניתן לראות בצורה ממושכת של טיפול מטרונום. </li></ol> 4. סיום הניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיה אחת בכל פעם מושם בתא אטום ושקוף, אשר סמוקות עם גז CO 2, אשר במהירות הורג את בעלי החיים. החדר הוא הסמיק עם אוויר לפני בשימוש שוב. </li></ol> 5. רקמות דוגמאות קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שניתן לראות ב-DVD, דופן הבטן היא פתחה את mesentery קטן בבטן מזוהה, כולל החלק הדיסטלי ביותר המגיעה שסתום ileo-cecal (בצומת של המעי הדק למעי הגס). ארבעה (או יותר) של רוב ממוקם distally &quot;חלונות&quot; ממוספרים, להפיץ על המטרה Superfrost מטופל רגיל פלוס שקופיות (DAKO דנמרק A / S, Glostrup, דנמרק). חשוב להימנע, במידת האפשר, זיהום עם דגימות דם, תוכן המעיים או נוזלי גוף אחרים, כמו חומרים אלה עשויים להיות מוכתם לא במיוחד, אם כי זה לא לפסול את להדמיה immunohistochemical הבאות של microvessels. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדגימה לכל חלון mesenteric עם קטע מעי המצורפת קטן מתפשט בשקופית מיובשים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. ואז, גדם המעי מנותקת, ואילו דגימות שלם mesentery קרומי מאוחסנים ב -20 ° C לפרקי זמן ממושכים. זו מוצגת ב-DVD. </li></ol> יצוין כי vasculature רקמות פטנט ניתן דמיינו לפני הקציר עם מיקרוסקופיה מועבר intravital אור. 6. פרוטוקול מכתים immunohistochemical של Microvessels <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 0 דגימות מותר להפשיר מ -20 ° C לטמפרטורת החדר, מיובשים בארון ב 60 ° C עבור 1 שעה, ושמרו בטמפרטורת החדר למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1 מניחים את השקופיות מכתים מחזיקי שקופיות (במסלול בכל שנייה) בצנצנת מכתים ולשטוף פעמיים עם TBS (pH 7.8) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הפתרון הוא מושלך ובמקומו לפתרון הבא, וכן הלאה עבור כל השלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טריפסין טיפול מלאו את הצנצנת מכתים כי יהיה הנמל מחזיק שקופיות מכתים עם פתרון טריפסין (25 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות). מחק את הפתרון ואת לדגור פעמיים עם פתרון סוכרוז 2.5% (בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בכל פעם). מחק את הפתרון ולשטוף כמה פעמים אקווה DEST (בטמפרטורת החדר במשך כמה דקות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימת מלאו את הצנצנת מכתים כי יהיה הנמל מחזיק שקופיות מכתים עם 0.5% H 2 O 2 ב מתנול (בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות). מחק את הפתרון ולשטוף עם אקווה DEST (בטמפרטורת החדר במשך כמה דקות). מחק את הפתרון ולשטוף פעמיים עם TBS (pH 7.4) (בטמפרטורת החדר למשך 8 דקות בכל פעם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה Incubations כל בתא humidified בטמפרטורת החדר. כ 150 μl של כל אחד הפתרונות המפורטים להלן משמשים לכל שקופית. השקופיות ממוקמים בתא humidified ואת הפתרונות הם pipetted אל דגימות (הלא קרומי חלקים לא צריך להיות מכוסה על ידי הפתרונות). עבור כל אחת מהפעולות הבאות, בזהירות להתנער כל פתרון לפני הפתרון לאחר מכן הוא הוסיף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם רגיל (חסימה) בסרום (סוס) (ABC בערכה) 3 טיפות פתרון צהוב / 10 מ&quot;ל דילול חיץ במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן ראשוני ARU0181, אשר תוויות וסקולרית עכברוש לתאי אנדותל. הנוגדן הוא מדולל 1:600 ​​עם חיץ דילול (Biosource) (100 μl מדולל פי 40 [קפוא] בתוספת 900 חיץ דילול μl) ו הדגירה מתרחשת בן לילה ב 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2 מגלשות יוסרו מן החדר humidified, הנוגדן העיקרי נמחקת, וגם את השקופיות ממוקמים בעל מכתים שקופיות, אשר שקוע בצנצנת מכתים ושטף פעמיים עם כפות(PH 7.8) במשך 8 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן biotinylated (ABC ערכת) השקופיות מונחות אופקית בתא humidified ו מודגרות עם ירידה של 1 פתרון כחול / 10 מ&quot;ל דילול חיץ במשך 30 דקות. מחק את הפתרון ואת המקום שקופיות בעל מכתים שקופיות שקוע בצנצנת מכתים ולשטוף פעמיים עם TBS (pH 7.4) במשך 8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם ריאגנט ה-ABC מגלשות ממוקמות שוב אופקית בתא humidified ואת הפתרונות הבאים pipetted על החלקים קרומי דגימות: 2 טיפות של תמיסת כתום בתוספת 2 טיפות של חום פתרון / 10 מ&quot;ל כפות (pH 7.4) במשך 30 דקות. מערבבים היטב 30 דקות לפני השימוש! מחק את הפתרון ואת המקום שקופיות מחזיק את השקופית בצנצנת מכתים ולשטוף פעמיים עם TBS (pH 7.4) במשך 8 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים עם DAB (0.05%) צעד זה חייב להתבצע במנדף כימי מאוורר! מניחים את שקופיות ולהוסיף את 3,3-diaminobenzidine (DAB; סיגמא אולדריץ &#39;) פתרון בעזרת פיפטה: פתרון DAB 0.1% ב TBS (pH 7.4) [קפוא] הוא מדולל 01:01 בתערובת של 10 μl H 2 O 2 ו - 7.5 מ&quot;ל כפות (pH 7.4). פתרון זה רק סטרילית, מסוננים לפני השימוש (לחסל את כל חלקיקי שעלולים לטשטש את התמונה המיקרוסקופית). הכתם דגימות במשך 8 דקות. מחק את הפתרון ואת המקום שקופיות מחזיק את השקופית מכתים שקוע בצנצנת מכתים. לשטוף תחת זרם מי ברז ולאחר מכן אקווה DEST במשך כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייבשות מגלשות נשמרים מחזיק את השקופית מכתים. שטפו על ידי השלכת ומילוי מכתים את הצנצנת המכילה אקווה DEST / אתנול: אקווה DEST, אלכוהול 70%, 95% אלכוהול, אלכוהול מוחלט, עם 2 דקות כל פתרון. </li></ol> 7. הדמיה הערכת רשת כלי הדם של הדגימה כל חלון mesenteric לאחר מכתים immunohistochemical של כלי הדם לתאי אנדותל כפי שמוצג בסרט, microvessels הם מיקרוסקופית דמיינו באתרו ברקמה ללא פגע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, אנו משתמשים במיקרוסקופ ציור עם טווח הגדלה 14-34 (Leica M Wild 3Z) כדי עפרון על נייר לבן את אזור החלון כולו, כמו גם את האזור כולו vascularized (VA) לכל חלון mesenteric. VA, כאחוז האזור כולו, נמדדת בקלות באמצעות planimetry ממוחשב או לא ממוחשב (או פשוט על ידי חיתוך החוצה שקלול את התמונה של החלון כולו, את התמונות של כל vascularized שלה חלקים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ עוד ציור, פרופילים microvessel בודדים, אשר מזוהים בקלות, מצוירים בדיו שחור על נייר לבן בהגדלה 80 בתוך שדות שנבחרו באקראי. זוהי נקודת המוצא של הערכה שלאחר מכן morphometric ממוחשב של אורך כלי הדם (MVL), אשר היא בעצם מדידת צפיפות כלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, משתנים הקשורים להיווצרות דפוס כלי הדם, כמו גם להערכה של מספר נבטים כלי הדם ואורך נבטים כלי הדם היחיד (מס &#39;SP ו-Le. SP, בהתאמה) ניתן לקבוע. -הניגוד אופטימלי בין המבנים המתוארים כלי שחור על רקע לבן מקל ניתוחים מפורטים של התמונות מסחרי תוכניות ממוחשבות morphometric ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברוב המקרים, את המשתנים העיקריים הם VA ו MVL, אשר מוכפל כאשר יחד ליצור את אורך כלי הדם הכולל (TMVL). </li></ol> 8. ניתוח סטטיסטי בדרך כלל אנו משתמשים בתקן הלא פרמטרית Mann-Whitney U-מבחן לנתח מזווג (שני זנב) תצפיות. ממוצע של ארבעה חלונות mesenteric לכל חיה משמש העצמאי נתונים נקודות עבור כל משתנה של חלון mesenteric. הקריטריון של מובהקות סטטיסטית הוא P ≤ 0.05.

<ol>
	<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+testing+with+angiogenesis+models.">Drug testing with angiogenesis models.</a> Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).</li><li>Norrby, K., Jakobsson, A., Sorbo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast-cell-mediated+angiogenesis:+a+novel+experimental+model+using+the+rat+mesentery.">Mast-cell-mediated angiogenesis: a novel experimental model using the rat mesentery.</a> Virchows Arch. B Cell. Pathol. Incl. Mol. Pathol. 52, 195-206 (1986).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+and+angiogenesis.">Mast cells and angiogenesis.</a> APMIS. 110, 355-371 (2002).</li><li>Albertsson, P., Lennernas, B., Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+meteronomic+chemotherapy:+modulation+of+angiogenesis+mediated+by+VEGF-A.">On meteronomic chemotherapy: modulation of angiogenesis mediated by VEGF-A.</a> Acta Oncol. 45, 144-155 (2006).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+apo-lactoferrin+enhances+angiogenesis+mediated+by+vascular+endothelial+growth+factor+A+in+vivo.">Human apo-lactoferrin enhances angiogenesis mediated by vascular endothelial growth factor A in vivo.</a> J. Vasc. Res. 41, 293-304 (2004).</li><li>Norrby, K., Mattsby-Baltzer, I., Innocenti, M., &amp;amp, T. u. n. e. b. e. r. g., S, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orally+administered+bovine+lactoferrin+systemically+inhibits+VEGF(165)-mediated+angiogenesis+in+the+rat.">Orally administered bovine lactoferrin systemically inhibits VEGF(165)-mediated angiogenesis in the rat.</a> Int. J. Cancer. 91, 236-240 (2001).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-molecular-weight+heparins+and+angiogenesis.">Low-molecular-weight heparins and angiogenesis.</a> APMIS. 114, 79-102 (2006).</li><li>Norrby, K., Nordenhem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dalteparin,+a+low-molecular-weight+heparin,+promotes+angiogenesis+mediated+by+heparin-binding+VEGF-A+in+vivo.">Dalteparin, a low-molecular-weight heparin, promotes angiogenesis mediated by heparin-binding VEGF-A in vivo.</a> APMIS. 118, 949-957 (2010).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis.">Basic fibroblast growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res.. 48, 96-113 (1994).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis.">Vascular endothelial growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 51, 153-163 (1996).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+density+in+terms+of+number+and+length+of+microvessel+segments+per+unit+tissue+volume+in+mammalian+angiogenesis.">Microvascular density in terms of number and length of microvessel segments per unit tissue volume in mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 55, 43-53 (1998).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Assay הוצג בשנת 1986 ויש לו 3 ברציפות פותחה עוד ומעודן במעבדה שלנו 7,10-12. כפי שנאמר בעיתונים ביקורת (מוזמן) 1, 2, assay משווה גם עם יונקים אחרים assay אנגיוגנזה vivo ביחס במיוחד תכונות חשובות כגון רקמת המבחן למבוגרים הוא מקורי vascularized וחסר אנגיוגנזה פיזיולוגי; טראומה מינימלית, אם בכלל, היא שנגרם לרקמות; משתנים כמותיים נמדדים באמת, המאפשר ניתוח סטטיסטי קול לגבי מנה תגובה ופעילות מולקולרית מחקרים; אנגיוגנזה נביטה מתרחשת, אשר predominating ברקמות גידולים רגילים; נתוני רעילות מצטברים בקלות חולדות לגדול וחסונה פיזיולוגית בבגרות. תכונות נחות עשוי לכלול את העובדה assay הוא יחסית זמן רב, במיוחד כאשר בהערכת מספר ואורך מקטעי microvessel הפרט נבטים microvessel, כי הוא אינו מאפשר תצפיות real-time/serial, וכי הוא מתאים כמעט עבור עכברים מאז חלונות mesenteric רבים בעכברים חוסר microvessels הורה פוטנציאל נימים חדש שממנו יכול לנבוע. בזמן אמת תצפיות, עם זאת, מופעל על ידי מיקרוסקופיה intravital שבו חלונות mesenteric exteriorized אבל שלמים הם פרושות מעל הבמה מיקרוסקופ בעוד החיה מורדמת, כפי שפורט 1. התקדמות משמעותית במחקר אנגיוגנזה הושגו בעשורים האחרונים באמצעות מודלים כגון micropocket הקרנית, קרום חומוס chorioallantoic ו sc מבחני Matrigel תקע, אשר הם כלי שימושי אבל בסופו של דבר מוגבל. יישומים קליניים עתידיים של טיפולים אנטי angiogenic ופרו angiogenic מחייבים הקמת ואימות של יותר רגיש ורלוונטי מבחינה ביולוגית, טרום קליניים במודלים כמותיים באמת, כמו זה המתואר בדו&quot;ח הנוכחי.

Buffers ו ריאגנטים 0.5 מ &#39;טריס-HCl (pH 7.8) מניות פתרון טריס (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 גרם) מומס ~ 900 מ&quot;ל אקווה DEST ו ~ 45 מ&quot;ל של HCl 25% (מרוכזת) נוסף כדי להשיג את ה-pH 7.8 בעקבות דילול 1 ליטר עם אקווה DEST. טריס-חיץ מלוחים (TBS; pH 7.8) עד 200 מ&quot;ל של תמיסת המניות הוא הוסיף 18 גרם NaCl מומס ~ 1800 מ&quot;ל אקווה DEST עם התאמה של עד 7.8 pH באמצעות פתרון המניות, בעקבות דילול עד 2 ליטר עם אקווה DEST. TBS (pH 7.4) עד 200 מ&quot;ל של תמיסת המניות הוא הוסיף 18 גרם NaCl מומס מומס ~ 1800 מ&quot;ל אקווה DEST עם התאמה של עד 7.4 pH באמצעות פתרון המניות, בעקבות דילול עד 2 ליטר עם אקווה DEST. טריפסין פתרון (0.05% טריפסין, 0.1% CaCl 2) מכיל 0.1 גרם ו 0.2 גרם טריפסין CaCl 2 ב 200 מ&quot;ל כפות (pH 7.8). סוכרוז פתרון 2.5% מכיל סוכרוז 5 גרם 200 מ&quot;ל כפות (pH 7.8). במלאי פתרון של אזיד הנתרן 1% TBS (pH 7.4) מכיל 1 גרם Na-אזיד ב 100 מ&quot;ל עם TBS (pH 7.4). דילול חיץ: 0.1% BSA, 0.01% Na-אזיד (משמש לדלל נוגדנים Vectastain ערכת ה-ABC). מכיל 0.1 גרם אלבומין בסרום שור (BSA) ו 1 מ&quot;ל של 1% Na-אזיד, בדילול מלא עד 100 מ&quot;ל עם TBS (pH 7.4). ABC ערכת Vectastain PK 4002, ABC peroxidase עכבר IgG סוס בסרום רגיל; חסימת בסרום; פתרון צהוב: 3 drops/10 חיץ מ&quot;ל דילול. נוגדן Biotinylated; אנטי עכבר IgG, פתרון כחול: 1 drop/10 חיץ מ&quot;ל דילול. ABC-מגיב: פתרון תפוז, 2 טיפות פלוס פתרון חום 2 כפות drops/10 מ&quot;ל (pH 7.4). מיקס פתרונות אלו 20 דקות לפני השימוש! עכבר (חד שבטי) נגד חולדה האנדותל (Biosource הבינלאומי, Camarillo, קליפורניה, ארה&quot;ב) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> קטלוג # </td><td> ARU0181 </td></tr><tr><td> Clone # </td><td> MRC OX-43 </td></tr></tbody></table> נוגדן זה מכוון נגד כל לתאי אנדותל כלי הדם של החולדה, למעט אלה במוח. Vectastain peroxidase Avidin קומפלקס ביוטין (ABC) ערכת הערכה מכילה נוגדן ראשוני, נוגדנים משני biotinylated, avidin-biotinylated מורכבים אנזים (ABC), ואת המצע האנזים. ראה <a href="http://www.vectorlabs.com/">www.vectorlabs.com</a> או <a href="http://www.immunkemi.se/">www.immunkemi.se</a> בפרוטוקולים. שור בסרום אלבומין (BSA) (סיגמא אולדריץ, קטלוג # A-4503). DAB = 3,3 &#39;-Diaminobenzidine Isopac (סיגמא אולדריץ, קטלוג # D 9015). טריפסין מלבלב שור (סיגמא אולדריץ, קטלוג # T 4665). Vectastain peroxidase ABC-Kit, עכבר IgG (Immunkemi F &amp; D AB, Jarfalla, שבדיה)

rat mesentery angiogenesis assay

העכברוש מבוגר mesentery חלון assay אנגיוגנזה מתאים מבחינה ביולוגית מתאים באופן יוצא מן הכלל ללימוד הנבטה אנגיוגנזה in vivo [ראו ניירות ביקורת], המהווה את טופס שולט של אנגיוגנזה בגידולים אנושיים שאינם סרטניים ברקמות, כפי שפורט ביקורת מוזמן ניירות 1,2. אנגיוגנזה המושרית בחלקים mesenteric קרומי בזריקה (IP) intraperitoneal של גורם הפרו angiogenic יכול להיות מווסתת על ידי תת עורית (SC), תוך ורידי (iv) או דרך הפה (PO) טיפול עם סוכני שינוי של בחירה. כל חלק של קרומי mesentery הוא שקוף ממוסגר על ידי רקמת שומן, זה נותן מראה חלון דמוי. Assay יש את התכונות יתרון הבאים: (i) את הרקמה הבדיקה vascularized מקורי, אם כי בדלילות, ומאז הוא דק מאוד, רשת microvessel הוא כמעט דו מימדי, אשר מאפשר את הרשת כולה כדי להעריך מיקרוסקופית באתרו: ( ii) בחולדות המבוגר רקמות מבחן חסר אנגיוגנזה פיזיולוגי משמעותי, המאפיינת נורמלי ביותר ברקמות יונקים בוגרים, מידת כלי הדם המקומיים, עם זאת, בקורלציה עם הגיל, כפי שפורט 1 (iii) את רמת זניח של אנגיוגנזה טראומה הנגרמת מבטיחה רגישות גבוהה, (iv) assay משכפל את המצב הקליני, כפי אנגיוגנזה-ויסות תרופות הבדיקה ניתנות מערכתית ותגובות הנצפה משקף את ההשפעה נטו של כל חילוף החומרים, הסלולר, ושינויים מולקולריים הנגרמת על ידי הטיפול, (v) assay מאפשר הערכות אובייקטיביות, משתנים כמותיים משוחדת של הרחבה מרחבית צפיפות כלי הדם, דפוס הקמת הרשת, כמו גם של נימי הנבטה, ובכך מאפשרים ניתוחים סטטיסטיים חזקים של השפעה במינון מולקולרית מבנה פעילות יחסי; (ו ) assay מגלה עם רגישות גבוהה את ההשפעות הרעילות של טיפולים או מזיק במונחים של שיעור ירידה של הגוף לצבור משקל פיזיולוגי, כמו חולדות מבוגר לגדול וחסונה. תורן תאים בתיווך אנגיוגנזה הודגם הראשון באמצעות assay זה 3,4. המודל מדגים רמה גבוהה של הפליה לגבי המינון אפקט היחסים ואת ההשפעות של נמדדת באופן מערכתי כימית או תפקודית תרופות וחלבונים קשורה קשר הדוק, כולל: (i) במינון נמוך, מנוהל כמו מטרונום chemotherapeutics סטנדרטי תשואה מגוונים, תרופה ספציפית השפעות (כלומר, פעילויות אנגיוגנזה-מדכאים, ניטרלי או אנגיוגנזה מגרה 5), (ii) טבעי ברזל בלתי רוויות לקטופרין אנושי, המעורר VEGF-A-6 אנגיוגנזה בתיווך, וטבעי ברזל בלתי רוויות שור לקטופרין, אשר מעכב VEGF-A- אנגיוגנזה בתיווך 7; (iii) נמוך משקל מולקולרי שברים הפרין המיוצר על ידי אמצעים שונים 8,9. יתר על כן, assay הוא מתאים מאוד מחקרים על ההשפעות המשולבות על אנגיוגנזה של סוכנים אשר מנוהלים בצורה מערכתית במקביל או רציפים. הרעיון של הפיכת הווידאו הזאת שמקורה המנוח ד&quot;ר יהודה פולקמן כאשר ביקר במעבדה שלנו עדים מתודולוגיה שמפגינים. סקירת עיתונים (מוזמן) לדיון בהערכת assay Norrby, ק במודלים vivo של אנגיוגנזה. J. Cell. מול. מד. 10, 588-612 (2006). Norrby, בדיקות ק והתרופות עם מודלים אנגיוגנזה. מומחה Opin. והתרופות. וגיליתי. 3, 533-549 (2008).

Watch this Scientific Journal Video about Rat Mesentery Angiogenesis Assay at JoVE.com

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

הרקמות מבוגר vascularized יונקים כי חסרה אנגיוגנזה פיזיולוגי שלא נחשף התערבות כירורגית משמש המחקר: (i) ייזום ופיתוח של אנגיוגנזה הבאים הממשל intraperitoneal של סוכני הבדיקה; (ii) שינוי של אנגיוגנזה הבאים מערכתית של הממשל נבחרת סוכני הבדיקה.

עכברוש mesentery Assay אנגיוגנזה

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K Views.  University of Gothenburg. הרקמות מבוגר vascularized יונקים כי חסרה אנגיוגנזה פיזיולוגי שלא נחשף התערבות כירורגית משמש המחקר: (i) ייזום ופיתוח של אנגיוגנזה הבאים הממשל intraperitoneal של סוכני הבדיקה; (ii) שינוי של אנגיוגנזה הבאים מערכתית של הממשל נבחרת סוכני הבדיקה.

Video: Rat Mesentery Angiogenesis Assay

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

כריסטופר יוז: במודל חוץ גופית לחקר אנגיוגנזה (ראיון)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

אופטימליים הפיברין ג&#39;ל ביד Assay לחקר אנגיוגנזה

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

פורסים תרבות Organotypic של E18 מוח החולדה

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

מיפוי אופטי של Langendorff-perfused לבבות עכברוש

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

לפדר החצנה חולדה: דגם לחקירת דינמיקה סלולר המעורבים אנגיוגנזה

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Assay היווצרות צינור תא האנדותל ל<em&gt; במבחנה</em&gt; חקר אנגיוגנזה

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In vivo אלקליין השביט Assay ואנזים-modified אלקליין השביט Assay עבור מדידת Breaks Strand דנ&quot;א נזק חמצוני דנ&quot;א עכברוש הכבד

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.