We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. הכנת Coverslips הזכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר קוטר 12 מ&quot;מ עגול coverslips זכוכית ידי טבילתם באתנול 70% לפחות 10 דקות, כאשר מדי פעם תסיסה על מנת להבטיח חשיפה כוללת של כל coverslips לאתנול. יוצקים coverslips הזכוכית ואתנול לתוך צלחת תרבית תאים סטריליים (או 6 סנטימטר או 10 סנטימטרים קוטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג 5 מלקחיים עדינים סטריליים, להרים ולמקם את כל coverslip זכוכית בודד לתוך באר של צלחת גם אשכול 24. תשמור על מנת להבטיח שcoverslips אינו נוגע בצדי היטב והם בערך באמצע של הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הצלחת גם אשכול 24 מכוסה האו&quot;ם עם coverslips זכוכית לייבוש בזרימת הממשלה. זה לוקח בערך 10 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו, להכין את תערובת הציפוי על ידי דילול 10 מ&quot;ג / מיליליטר פיברונקטין אדם בפתרון של האנק מאוזן מלח (HBSS) 0.1 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר coverslips יבש, של פתרון ציפוי פיפטה 100 μl על כל שיתוף זכוכיתverslip כך הפתרון מכסה רק את הזכוכית ללא איגום סביב החלק החיצוני של הבאר. מניחים את הצלחת 24 גם אשכול המכוסה בתרבית תאי חממה לשעה לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני השימוש, להסיר את פתרון הציפוי. אותו פתרון הציפוי יכול להיות מועבר לצינור סטרילי ומשמש עד שלוש פעמים ללא הפסד גלוי של יעילות. </li></ol> 2. הכנת חד שכבתי תא האנדותל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תרבות אנושיים כליליים אנדותל העורק (EC) במדיום על 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת ותרבות ולשטוף monolayer EC עם 10 מיליליטר HBSS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את HBSS ולהוסיף 2 מיליליטר 0.5% טריפסין, 0.2% פתרון EDTA. לדגור על RT עבור כ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ניתן וחילצה EC על ידי ברז לצד השני של הבקבוק, להוסיף 5 מיליליטר של מעכבי טריפסין סויה ועם פיפטה להשפריץ את פני השטח של הבקבוק כדי לסלק נוסף התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים לתוך צינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות הצינורב XG 200 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את supernatant ו resuspend גלולה בר ב5 מיליליטר של תקשורת. ספירת התאים עם haemocytometer ולהתאים את ריכוז התאים 50,000 EC לכל מיליליטר של תקשורת EC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 1 מיליליטר של ההשעיה התא לבאר כל הצלחת גם 24 המכילה coverslips זכוכית מצופה. דגירה תאי O / N בתרבית תאי החממה ב 37 מעלות צלזיוס בתוספת 5% פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים מוכנים לשימוש בניסויים כאשר monolayer ומחוברות נוצר, תוך 3 ימים. </li></ol> 3. הכנת מונוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את HL-60 תאים בתרבית שבRPMI בתוספת 10% עגל בסרום עוברי, כתרבות השעיה, לתוך צינור 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תאי supernatant ו resuspend ב 5 מיליליטר תקשורת ולהתאים את ריכוז תאים עם תקשורת 2 מיליון תאים / מיליליטר. אם תיוג הקרינה של HL-60 הוא רצוי, resuspend תאי RPMI ללא סרום ויחסי הציבורoceed כאמור בסעיף 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של HL-60 השעיה תא לבאר כל צלחת 24 גם אשכול המכילה monolayer EC דגירה הצלחת בתרבית תאי חממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני לנבחרה לתקופה קצובה של זמן בין 1 ו -3 שעות. הבדל קטן הוא ציין בין שעה 1 ונקודת זמן 3 שעות, שבו רוויה מחייבת מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכונו לשטיפה / קצירת תא: מלא צינור 120 מיליליטר עם של HBSS 100 מיליליטר. לוותר על 1 מיליליטר של פורמלין לבאר כל צלחת גם טרי 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה, להשתמש זוג מלקחיים חדים ולהרים את coverslip הזכוכית מהבאר והחזק את coverslip אנכי ומורחים את הקצה של coverslip על פיסת הרקמה על הספסל במשך 3 שניות, נזהר שלא לגעת ב משטח מכוסה תא של coverslip עם הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק coverslip היטב עם זוג המלקחיים, להטביע את coverslip ובמתוך HBSS חמש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דאנק החמישיבHBSS, מורח את הקצה של coverslip על הרקמה במשך 3 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הנהלים הטובלים וספיגה מתואר ב3.6 ו -3.7, מה שהופך את הסכום כולל של שלושה סטים של 5 הטבעות אחרי טיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את coverslip לפורמלין 10% המכיל גם כדי לתקן את התאים ב RT. Coverslip מוכן לספירה, לאחסון לטווח ארוך או להיות נתון להליכים אחרים שיתוארו להלן. </li></ol> 4. תיוג של HL-60 תאים עם Tracker הנייד (לא חובה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוזן ולהעביר כמות מתאימה של HL-60 תאים (למשל, 10 מ&#39;) לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. צנטריפוגה HL-60 תאים ב XG 200 במשך 5 דקות. הסר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה גלולה תא במעקב סלולארי בתקשורת RPMI ללא סרום בריכוז של 1 מיליון תאים / מיליליטר. דגירה תאים בתרבית תאי חממה עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות וזורקים supernatant. גלולה תא גלולה בתקשורת לריכוז של 2 מיליון ג/ אמות מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של שכותרת Tracker הנייד HL-60 לכל תאי האנדותל המכילים גם גדלו על coverslip זכוכית. המשך על 3.3. </li></ol> 5. ספירת תאי האנדותל דבק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslips על שקופיות מיקרוסקופ עם נגדי כתם DAPI לזהות תאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ הפוכה עם מטרת 4X או 10X, לרכוש תמונות של כמה שדות (לדוגמא, 5 שדות) ולספור את המספר הגבוה ביותר של מונוציטים שמצטברים בתאי האנדותל בלתי מוקרן (זה צריך להיות בדרך כלל 3-5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע פעמיים מספר זה כסף של מונוציטים בתא האנדותל להיות שהוגדר כאשכול. אם נדרש, קריטריון שונה יכול לשמש להגדרת אשכול בהתאם לאופי של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר האשכולות ואת מספר תאי אנדותל בתחום. מחלקים את לשעבר ע&quot;י האחרון כדי להשיג את אחוז תאי האנדותל דבקים. ציוןשדות רבים כדי להשיג סטייה ממוצעת וסטנדרטית של הספירה. </li></ol> Counterstaining 6. עם נוגדנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר assay ההידבקות והתאים על coverslip תוקנו בפורמלין 10% במשך 15 דקות ב RT, להכפיף את coverslips לimmunofluorescence באמצעות הליך סטנדרטי 10 ונוגדנים של בחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה והסרה של הפתרונות השונים מאוד בעדינות כדי למנוע פירוק מונוציטים שמחוברים לתאי אנדותל. </li></ol> 7. counterstaining לפעילות בטא-galactosidase הקשורים הזדקנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר assay ההידבקות ותאים על coverslip תוקנו בפורמלין במשך 15 דקות, כתם לפעילות בטא galactosidase הקשורים הזדקנות כפי שמתואר בהוראות המלוות את ערכת הצביעה. הוספה והסרה של הפתרונות השונים מאוד בעדינות כדי למנוע פירוק מונוציטים שמחוברים לתאי אנדותל. </li></ol>

<ol>
	<li>Ortega-Gomez, A., Perretti, M., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+inflammation:+an+integrated+view.">Resolution of inflammation: an integrated view.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 661-674 (2013).</li><li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+cardiovascular+disease+mechanisms.">Inflammation and cardiovascular disease mechanisms.</a> Am J Clin Nutr. 83 (2), 456S-460S (2006).</li><li>Ikuta, S., Kirby, J. A., Shenton, B. K., Givan, A. L., Lennard, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cells:+effect+of+TNF-alpha+on+peripheral+blood+mononuclear+cell+adhesion.">Human endothelial cells: effect of TNF-alpha on peripheral blood mononuclear cell adhesion.</a> Immunology. 73 (1), 71-76 (1991).</li><li>Watson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6+acts+on+endothelial+cells+to+preferentially+increase+their+adherence+for+lymphocytes.">IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes.</a> Clin Exp Immunol. 105 (1), 112-119 (1996).</li><li>Sans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM-1+and+ICAM-1+mediate+leukocyte-endothelial+cell+adhesion+in+rat+experimental+colitis.">VCAM-1 and ICAM-1 mediate leukocyte-endothelial cell adhesion in rat experimental colitis.</a> Gastroenterology. 116 (4), 874-883 (1999).</li><li>Su, Y., Lei, X., Wu, L., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+cell+adhesion+molecules+P-selectin,+E-selectin+and+intercellular+adhesion+molecule-1+in+leucocyte+recruitment+induced+by+exogenous+methylglyoxal.">The role of endothelial cell adhesion molecules P-selectin, E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal.</a> Immunology. 137 (1), 65-79 (2012).</li><li>Hallahan, D., Kuchibhotla, J., Wyble, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+mediate+radiation-induced+leukocyte+adhesion+to+the+vascular+endothelium.">Cell adhesion molecules mediate radiation-induced leukocyte adhesion to the vascular endothelium.</a> Cancer Res. 56 (22), 5150-5155 (1996).</li><li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion.">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> J Immunol Methods. 159 (1-2), 93-100 (1993).</li><li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature.">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvasc Res. 82, 210-220 (2011).</li><li>Lowe, D., Raj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+aging+induced+by+radiation+exhibits+pro-atherosclerotic+effects+mediated+by+epigenetic+activation+of+CD44+expression.">Premature aging induced by radiation exhibits pro-atherosclerotic effects mediated by epigenetic activation of CD44 expression.</a> Aging Cell. 13 (5), 900-910 (2014).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

Assay הידבקות מונוציטים שתואר לעיל שימש בהצלחה בניסויים שנועדו לחקור את ההשפעות הביולוגיות של קרינה מייננת על monolayers אנדותל 10. אמנם זה לא השיטה היחידה העומדת לרשות להעריך את הדביקות של monolayer האנדותל, היא השיטה היחידה המאפשרת כימות של החלק או אחוז תאי אנדותל בmonolayer כי הוא דבק. זו הבחנה חשובה כמו שינוי הכמותי עולמי בהידבקות של מונוציטים, כפי שנמדד על ידי שיטות אחרות ניתן לייחס גם לעלייה כללית בדביקות של כל התאים של monolayer האנדותל או לדביקות הגידול של תת-אוכלוסייה של תאי האנדותל בתוך monolayer, כפי שמוצג בדוגמא לעיל. הערך שיש במידע זה בא לידי ביטוי בעובדה שהיכולת לכמת אחוז תאי האנדותל שהציגו דביקות משופרת לאחר ההקרנה הובילה לאינסמסוגל מסקנה שהשפעה זו אינה נובעת ממוטציה הגנטית של גן מסוים כאחוז התאים שהיו דבקים היתה מאוד מעל (מעל 1,000 פעמים יותר) שבו ניתן היו לצפות מן המוטציה של גן אקראי על ידי X-קרינה במינון ש . הגורם המאפשר שחזור טוב של התוצאות הוא משטר הכביסה. כנוהל השטיפה כרוך הטבילה של coverslip הזכוכית לחיץ לשטוף אחריו מספיגה על רקמה, השתנות במערבולת החיץ שמתעוררת באופן בלתי נמנע מהשיטה של ​​pipetting של החיץ לשטוף לתוך באר הישנה הוא נמנע. ואכן זה היה התצפית של השתנות מוגזמות בין משכפל שהושג באמצעות שיטת pipetting שאלצה אותנו לתכנן הליך כביסה שהסיר את האלמנט השונות מהשלב הכביסה. אמנם, המגבלות של שקר assay זה בצורך לבצע ספירה ידנית של אשכולות מונוציטים, שעושה not לאפשר לו להיות מותאם לתפוקה גבוהה מנתח. שנית, ההחלטה על אופן מונוציטים רבים מהווים אשכול יש שתיקבע באופן שרירותי וחצי הרמה ניתן להגדיר גבוהה מדי ולגרום להרחקה של כמה אשכולות אמיתיים. יכול גם להיות שנצפה החוסר בכוח גזירה בשיטה זו כהגבלה בניסויים שבהם דביקות משופרת גס של תאי האנדותל מושרה (למשל, + TNFα). במצבים אחרים לעומת זאת, החוסר בכוח הגזירה הוא יתרון שכן היא מאפשרת זיהוי של הגדלת פחות מוגזמת של דביקות. עלייה צנועה בדביקות מונוציטים יכולה להיות חשובה ורלוונטית במיוחד. בvivo, מונוציטים לא (בזמן ניסוי טיפוסי) צפוי לצרף במספרים גדולים לתאי אנדותל עם עלייה צנועה בדביקות, במידה רבה בשל הגזירה כוח. בזמן עם זאת, כמה מונוציטים כנראה הייתם, וזה סביר יותר מייצג את הסביבה של דלקת כרונית. כמו,העדר כוח גזירה יכול להיות יתרון כפי שהוא מספק הזדמנות לעליות קטנות בדביקות תא האנדותל להתגלות במסגרות זמן ניסיוניות שהן בדרך כלל קצרים ואולי גם חולפים כדי לאפשר גידול צנוע בדביקות שנצפה תחת מאמץ גזירה. היכולת להכפיף את התאים לאחר assay זה לניתוחים אחרים כגון assay הזדקנות ומכתים immunofluorescence מגדילה את התועלת של שיטה זו שכן היא מאפשרת את הקשר של דביקות של תאי האנדותל ספציפיים לחלבונים תאיים מסוימים או מדינות סלולריות כפי שהודגם לעיל, תכונה ש אינו זמין עם מבחני הידבקות המבוגרים. שיטה זו נעשתה שימוש בתאים-הונצח est2 אדם כלילית אנדותל ותוצאות דומות התקבלו גם בתאים ראשוניים אדם כלילית אנדותל 10, מדגים שזה לא ספציפי רק קו תא מסוים. כמו כן, ADOption של שיטה זו של מנסה לאמוד דביקות של תאי האנדותל אינו מונע העמדת אותם תאים לassay ההידבקות הסטנדרטי שמודד הקרינה של immunocytes שכותרת. יחד, דוח זה מוכיח כי שיטה זו היא תכליתית, כוללת ומספקת הרבה יותר מידע מאשר assay ההידבקות הסטנדרטי.

<html> הסתננות של תאים חיסוניים כגון מונוציטים פני שכבת תאי האנדותל המרפדים את כלי דם היא צעד חשוב בתהליך של דלקת 1. זה מאפשר הביות של תאי מערכת חיסון (immunocytes) לאתר של פציעה. במקרים אחרים ובמקומות כגון עורקים הכליליים ועורק הראשי, חדירה של מונוציטים דרך שכבת האנדותל יכולה להוביל למגורים לטווח ארוך רצויים של תאים אלה בקיר של העורק, שעלול להוביל להיווצרות הפלאק 2. בכל המקרים של חדירת immunocyte, הצעד הראשון כרוך בהפעלתם של תאי האנדותל באזור מקומי של כלי הדם. תאי האנדותל מופעלים על ידי ציטוקינים פרו-דלקתיים כגון TNF-α ו- IL-6 להגדיל ביטוי של חלבונים בתא שטח כגון VCAM, ICAM ו- E-selectin המאפשרים הגיוס וקשר של immunocytes על פני השטח של תאי אנדותל 3 6. = &quot;Jove_content&quot; ילדה&gt; בתחילה, מדידה של הידבקות תא אנדותל בוצעה על ידי ספירת מונוציטים שדבקו אנדותל monolayer 7. מגבלותיה של שיטה זו במונחים של דיוק הובילו לשימוש בהלימפוציטים שכותרתו ברדיו או במונוציטים, ואחריו כימות של חומר רדיואקטיבי אשר תואם לימפוציטים או מונוציטים הידבקות 4. שיטה זו הוחלפה סופו של דבר על ידי שיטת הקרינה מבוססת, לפיה immunocytes עניין תויגה עם צבע פלואורסצנטי וכפוף לאותו ההליך כאמור לעיל עם ההבדל הוא הקרינה שבמקום רדיואקטיביות נמדדה 8. כיום שיטה זו התגלתה כנוחה ביותר ונמכר בצורת ערכה על ידי מספר ספקים מסחריים. בעוד assay זה יכול למדוד את הרמות יחסי של דביקות בין בקרות ודגימות ניסוי, זה לא לגלות אם שינוי בקרינה נובע משינוי אחיד בדביקות על פני כל הדואראוכלוסיית תא ndothelial או אם השינוי נובע מהבדל של דביקות בתת-אוכלוסייה של תאים. זה ניכר גם שהחומרה של שטיפה מפעילה השפעה עמוקה על התוצאה, ויותר חשוב מכך, את האחידות של שטיפה את מונוציטים מאוגד בין monolayers תא אנדותל שונה תשפיע במידה רבה על הקרבה של תוצאות ממשכפל והשחזור של התוצאות בין דגימות . לאחרונה, מספר מערכות שלשאוב מונוציטים בתקשורת ברחבי monolayer תא האנדותל שמשו כדי לטפל בבעיה זו 9. בנוסף, זרימת מערכות אלה גם לשחזר את האפקט של כוח גזירה על תאי האנדותל. למרות היתרונות של מערכות כאלה הם ברורים ומאוד אטרקטיביים, זה גם חשוב להבין כי בעוד דביקות תא האנדותל יכולה להיות מוגברת באופן משמעותי, כמו במקרה של דלקת חריפה ב, על ידי גורמים כגון TNFα, כמה מפעילים אחרים, כגון קרינה מייננת 10 לעורר שינויים לאכובע אינו מזוהה בקלות בתוך מבחנה מסגרות זמן ניסיונית על ידי מערכות מאוד מחמירות אלה. בעוד כגון שינויים של הרגע של דביקות תא האנדותל הם החמיצו או פוטרו במבחנה בקלות, זה לא פיר בהכרח in vivo, שבו שינויים קטנים כאמור בתוך זמן חיים, שהוא אופייני לדלקת כרונית, יכולים להפעיל תוצאות מאוד משמעותיות. לפיכך שיטה חזקה, עדיין רגישה, וספציפית כדי לזהות ולמדוד נחוצה דביקות תא האנדותל. כאן, אנו מדווחים על שיטה למדידת דביקות של תאי האנדותל ישירות. שיטה זו אינה מסתמכת על מדידת הקרינה כאינדיקטור פונדקאית עקיף של דביקות תא האנדותל. הוא מגלה אם שינויים בדביקות הם עקב שינוי אחיד על פני כל התאים או מרותק לתת-אוכלוסייה. יתר על כן, היא מאפשרת שיתוף צביעת תאי אנדותל עם סמנים כמו בטא galactosidase הקשורים הזדקנות, מר כדאיות תאker, Calcien בבוקר ונוגדנים נגד פני תא וחלבונים תאיים, המאפשרים לעמותה של תאי האנדותל דבקים פרט למדינות תא מסוימים או ביטוי של חלבונים ספציפיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips Round 12mm Diameter</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>CB00120RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cluster plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meso-Endo Cell media</td>
			<td>Cell Applications</td>
			<td>212-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17075-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Calf Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta glasctosidase Assay kit&#160;&#160;</td>
			<td>CellSignaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro

אחד התהליכים העיקריים של דלקת היא החדירה של תאי מערכת חיסון מלומן של כלי הדם לרקמות שמסביב. מצב זה מתרחש כאשר תאי אנדותל, אשר מרפדים את כלי דם, הפכו לדבק במחזור תאים חיסוניים כגון מונוציטים. מדידה במבחנה של הדביקות הזאת עד עכשיו נעשתה על ידי כימות המספר הכולל של מונוציטים שלדבוק שכבת האנדותל או כספירה ישירה או על ידי מדידה עקיפה של הקרינה של מונוציטים חסיד. בעוד מדידות כאלה לעשות לציין הדביקות הממוצעת של אוכלוסיית תאי אנדותל, הם מבולבל על ידי מספר הגורמים, כגון מספר תאים, ולא לחשוף את חלקם של תאי האנדותל, כי הם דבקים למעשה. כאן אנו מתארים ומדגימים שיטה המאפשרת הספירה של תאים מודבקים בתוך אוכלוסייה שנבדקה של monolayer האנדותל. תאי האנדותל גדלים על coverslips הזכוכית והבא רצוייםטיפול מאותגרים עם מונוציטים (שעשוי להיות שכותרתו fluorescently). לאחר הדגירה, הליך שטיפה, מעורבת סבבים רבים של טבילה וניקוז, התאים הם קבועים. תאי האנדותל דבקים, אשר מוקפים במונוציטים בקלות מזוהים ומנויים, נותנים מדד הידבקות החושף את החלק הממשי של תאי האנדותל באוכלוסייה שהם דבקים.

שיטה זו מאפשרת זיהוי של תאי האנדותל דבקים בודדים בתוך אוכלוסייה. לדוגמא, בעוד monolayer של תאי האנדותל מוקרן האו&quot;ם שמר כמה HL-60 מונוציטים סדירים הבאים דגירה וכביסה, monolayer האנדותל ב -7 ימים שלאחר הקרנת 10Gy לפני דגירה עם מונוציטים היו קשורים במונוציטים באשכולות סביב תאי האנדותל בודדים ( איור 1). למרות שתופעה זו היא לצפות בקלות תחת מיקרוסקופ לעומת שלב, מיקרוסקופ פלואורסצנטי מגלה תמונה ברורה אף יותר של אשכולות מונוציטים. לאחר ביצוע assay ההידבקות תאר, אפשר להמשיך למכתימים את התאים לממברנה, cytoplasmic או גרעיני (איור 2) חלבונים באמצעות נוגדנים מתאימים עם שיטות immunofluorescence סטנדרטיים. יתר על כן, assay אנזים מבוסס כגון בטא-galactosidase הקשורים הזדקנות (איור 3) יכול להיות גם PErformed. מאז כל אשכול מונוציטים מתאים לתא האנדותל בודד, ספירה של האשכולות תחשוף את המספר האמיתי של תאי האנדותל דבקים בתוך monolayer (איור 4), ולכן אחוז תאי האנדותל דבקים באוכלוסייה (הטבלה 1, איור 6) . זוהי השיטה היחידה עד כה שמאפשר כגון כימות של דביקות תא האנדותל. ראוי לציין כי תאי האנדותל המשמשים בניסויים הנה-עכבות קשר ולא להגדיל במספר לאחר שהשיג נקודת המפגש. זה מבטל את מורכבות פוטנציאל טמונה במספר תא האנדותל עלה בנקודות זמן מאוחר יותר. אם תרצה, מונוציטים המצורפים לmonolayers אנדותל ניתן וחילצה ב -0.5% פתרון EDTA טריפסין-0.2% (במקום 3.9 קיבעון ב) והקרינה שלהם נמדדו באמצעות קורא צלחת, כמו במקרה של בשיטות עכשוויות (איור 5). </p&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> הידבקות באיור 1. של מונוציטים על monolayer של תאי האנדותל. בתאי האנדותל בלתי מוקרן, מונוציטים דבקו כתאים בודדים באופן סדיר ואקראי (משמאל לוחות) ובאשכולות על תאי האנדותל בודדים של 7 ימים לאחר 10 Gy המוקרנים monolayer (לוחות מימין). לוחות נמוכים הם תמונות הקרינה של הפנלים העליונים, המאשרים כי התאים כדוריים הקטנים ובהירים הגלויים תחת ניגוד שלב אכן מונוציטים שמראש שכותרתו עם התא-Tracker ירוק. חלק מאשכולות מונוציטים מסומנים על ידי חצים לבנים. תמונות צולמו באמצעות מטרת 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> מכתים איור 2. תאי אנדותל עבור assay חלבונים לאחר הידבקות. לאחר ביצוע assay ההידבקות תאר, תאים על coverslips הזכוכית היו נתונים לimmunofluorescence לגילוי (א) חלבון קרום (CD44), ב) חלבון cytoplasmic (טובולין) או ג) חלבון גרעיני (γ-H2AX). לוחות שמאל של (א) ו- (ב) (ראה עם מטרת 20X) מונוציטים מופע שכותרתו מראש עם תא Tracker הירוק ותמונה דומה על הלוחות תקין לחשוף CD44 וmicrotubules (אדום) וגרעינים צבעוניים DAPI (כחול). חצים לבנים בצבע על גרעין תא אנדותל המוקרן שהוכתמו נוגדנים נגד γ-H2AX (C). גרעיני מונוציטים שהם מוכתמים בהירים כחולים על ידי DAPI בקלות להבחין בין הגרעינים הסגלגלים בצורה של תאי האנדותל. תמונות צולמו עם מטרת 20X.<html> &quot;Target =&quot; _ jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> איור 3. מכתים בטא galactosidase הקשורים הזדקנות של תאי האנדותל. לאחר assay ההידבקות, תאים על coverslips היו נתונים לצביעה לבטאו galactosidase הקשורים הזדקנות שגורם lysosomes של תאים מזדקנים להכחיל, כפי שעולים בתא אנדותל ש הוא חייב באופן סלקטיבי על ידי מספר רב של מונוציטים, אשר מזוהים בקלות בשל גודלם הקטן וצורה כדורית. תמונה נראית דרך אובייקטיבי 20X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 2,924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; ספירת 4. איור של אשכולות מונוציטים על תאי האנדותל בודדים. לאחר assay ההידבקות, תמונות של התאים נלקחו מכמה עמדות שונות ואשכולות מונוציטים המזוהים והקיפה (בירוק). אשכול הוגדר כמסכת של 10 או יותר מונוציטים בתא האנדותל. מספר אשכולות מונוציטים ומספר 12 ימי תאי האנדותל לאחר מוקרן (המנוקד באדום) בתמונה נספר ואחוז תאי אנדותל חסיד מחושבים כפי שמוצג בטבלה 1. תמונה שצולמה באמצעות אובייקטיבי 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> איור 5. כימות הקרינה של מונוציטים חסיד. adhe הבא<html> assay שיאון, תאים על coverslips זכוכית trypsinised והקרינה של מונוציטים שכותרתו מראש עם CellTracker הירוק נמדדה, באמצעות קורא צלחת הקרינה, כאינדיקציה עקיפה של הדביקות של monolayer האנדותל. תוצאות ממדידות כאלה בימים האמורים שלאחר הקרנה-התקבלו וקלוע בגרף לעיל. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> ייצוג איור 6. ציוני assay הידבקות מהטבלה 1. תאי האנדותל דבקים בחמישה מקומות שונים בשלושה coverslips זכוכית הובקעו כמתואר באיור 4 והתוצאות נספר מעל הוכחה כי 12 ימים לאחר 10 הקרנת Gy, 8 עד 10 אחוזים ממוקרנים תאי האנדותל הפכו דבק. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; אחוז דבק תאי האנדותל </td></tr><tr><td></td><td> דיסק 1 </td><td> דיסק 2 </td><td> דיסק 3 </td></tr><tr><td> שדה 1 </td><td> 8.65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> שדה 2 </td><td> 10.44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> שדה 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> שדה 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7.09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> שדה 5 </td><td> 10.55 </td><td> 9.4 </td><td> 11.61 </td></tr><tr><td> ממוצע </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8.75 </td></tr></tbody></table> עשרות assay 1. הידבקות שולחן. תאי האנדותל דבקים בחמישה מקומות שונים בשלושה coverslips זכוכית הובקעו כמתואר בFigure 4 והתוצאות נספר מעל הוכחה כי 12 ימים לאחר 10 הקרנת Gy, 8 עד 10 אחוזים מתאי האנדותל המוקרנים הפכו דבק.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro at JoVE.com

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

כימות של דביקות תא האנדותל<em&gt; במבחנה</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

quantitation-of-endothelial-cell-adhesiveness-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

11.4K Views.  Centre for Radiation, Chemicals and Environmental Hazards, Public Health England. We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer. 

Video: Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

בשנת העצרת חוץ גופית גרעיני מופרדים באמצעות תמציות Xenopus ביצה

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

בידוד הרחבת בקנה מידה גדול של תאים אנושיים למבוגרים האנדותל המושבה יצירת אב

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are pluripotent, thus having the potential to differentiate into multiple lineages. Such properties make ESCs extremely attractive for cell based therapy and regenerative treatment applications 1. However for its full potential to be realized the cells have to be differentiated into mature and functional phenotypes, which is a daunting task. A promising approach in inducing cellular differentiation is to closely mimic the path of organogenesis in the in vitro setting. Pancreatic development is known to occur in specific stages 2, starting with endoderm, which can develop into several organs, including liver and pancreas. Endoderm induction can be achieved by modulation of the nodal pathway through addition of Activin A 3 in combination with several growth factors 4-7. Definitive endoderm cells then undergo pancreatic commitment by inhibition of sonic hedgehog inhibition, which can be achieved in vitro by addition of cyclopamine 8. Pancreatic maturation is mediated by several parallel events including inhibition of notch signaling; aggregation of pancreatic progenitors into 3-dimentional clusters; induction of vascularization; to name a few. By far the most successful in vitro maturation of ESC derived pancreatic progenitor cells have been achieved through inhibition of notch signaling by DAPT supplementation 9. Although successful, this results in low yield of the mature phenotype with reduced functionality. A less studied area is the effect of endothelial cell signaling in pancreatic maturation, which is increasingly being appreciated as an important contributing factor in in-vivo pancreatic islet maturation 10,11.
The current study explores such effect of endothelial cell signaling in maturation of human ESC derived pancreatic progenitor cells into insulin producing islet-like cells. We report a multi-stage directed differentiation protocol where the human ESCs are first induced towards endoderm by Activin A along with inhibition of PI3K pathway. Pancreatic specification of endoderm cells is achieved by inhibition of sonic hedgehog signaling by Cyclopamine along with retinoid induction by addition of Retinoic Acid. The final stage of maturation is induced by endothelial cell signaling achieved by a co-culture configuration. While several endothelial cells have been tested in the co-culture, herein we present our data with rat heart microvascular endothelial Cells (RHMVEC), primarily for the ease of analysis.

The current study describes a directed differentiation approach in inducing pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Of great significance is the finding that endothelial cell co-culture mediates maturation of human embryonic stem cell derived pancreatic progenitors into insulin expressing cells.

תא האנדותל שיתוף תרבות מתווכת ההבשלה של עובריים אנושיים לתאי גזע לאינסולין בתאי לבלב הפקת בגישה הבחנה בימוי

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

שיטת Quantitation רגישה וספציפית לקביעת חלבון-C שרירן לב סרום הכבילה ידי Immunoassay Electrochemiluminescence

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Assay היווצרות צינור תא האנדותל ל<em&gt; במבחנה</em&gt; חקר אנגיוגנזה

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

ניתוח של סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity greatly impacts cell behavior to regulate normal and pathologic processes including cell proliferation, differentiation, adhesion signaling and directional migration. In this regard, the innate ability of certain cell types to migrate towards a stiffer, or less compliant matrix substrate is referred to as durotaxis. This phenomenon plays an important role during embryonic development, wound repair and cancer cell invasion. Here, we describe a straightforward assay to study durotaxis, in vitro, using polydimethylsiloxane (PDMS) substrates. Preparation of the described durotaxis chambers creates a rigidity interface between the relatively soft PDMS gel and a rigid glass coverslip. In the example provided, we have used these durotaxis chambers to demonstrate a role for the cdc42/Rac1 GTPase activating protein, cdGAP, in mechanosensing and durotaxis regulation in human U2OS osteosarcoma cells. This assay is readily adaptable to other cell types and/or knockdown of other proteins of interests to explore their respective roles in mechanosignaling and durotaxis.

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

מערכת פשוטה לסלולרי הערכת Mechanosensing וDurotaxis<em&gt; במבחנה</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

כימות של ביטוי חלבון ו Co-לוקליזציה שימוש חיסונית-histochemical Multiplexed מכתים והדמיה Multispectral

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

פיתוח ואפיון של<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; וייצור Nitric Oxide

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...