Name: quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro
Uploaded: 2015-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro at JoVE.com

We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. הכנת Coverslips הזכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר קוטר 12 מ&quot;מ עגול coverslips זכוכית ידי טבילתם באתנול 70% לפחות 10 דקות, כאשר מדי פעם תסיסה על מנת להבטיח חשיפה כוללת של כל coverslips לאתנול. יוצקים coverslips הזכוכית ואתנול לתוך צלחת תרבית תאים סטריליים (או 6 סנטימטר או 10 סנטימטרים קוטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג 5 מלקחיים עדינים סטריליים, להרים ולמקם את כל coverslip זכוכית בודד לתוך באר של צלחת גם אשכול 24. תשמור על מנת להבטיח שcoverslips אינו נוגע בצדי היטב והם בערך באמצע של הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הצלחת גם אשכול 24 מכוסה האו&quot;ם עם coverslips זכוכית לייבוש בזרימת הממשלה. זה לוקח בערך 10 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו, להכין את תערובת הציפוי על ידי דילול 10 מ&quot;ג / מיליליטר פיברונקטין אדם בפתרון של האנק מאוזן מלח (HBSS) 0.1 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר coverslips יבש, של פתרון ציפוי פיפטה 100 μl על כל שיתוף זכוכיתverslip כך הפתרון מכסה רק את הזכוכית ללא איגום סביב החלק החיצוני של הבאר. מניחים את הצלחת 24 גם אשכול המכוסה בתרבית תאי חממה לשעה לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני השימוש, להסיר את פתרון הציפוי. אותו פתרון הציפוי יכול להיות מועבר לצינור סטרילי ומשמש עד שלוש פעמים ללא הפסד גלוי של יעילות. </li></ol> 2. הכנת חד שכבתי תא האנדותל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תרבות אנושיים כליליים אנדותל העורק (EC) במדיום על 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת ותרבות ולשטוף monolayer EC עם 10 מיליליטר HBSS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את HBSS ולהוסיף 2 מיליליטר 0.5% טריפסין, 0.2% פתרון EDTA. לדגור על RT עבור כ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ניתן וחילצה EC על ידי ברז לצד השני של הבקבוק, להוסיף 5 מיליליטר של מעכבי טריפסין סויה ועם פיפטה להשפריץ את פני השטח של הבקבוק כדי לסלק נוסף התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים לתוך צינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות הצינורב XG 200 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את supernatant ו resuspend גלולה בר ב5 מיליליטר של תקשורת. ספירת התאים עם haemocytometer ולהתאים את ריכוז התאים 50,000 EC לכל מיליליטר של תקשורת EC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 1 מיליליטר של ההשעיה התא לבאר כל הצלחת גם 24 המכילה coverslips זכוכית מצופה. דגירה תאי O / N בתרבית תאי החממה ב 37 מעלות צלזיוס בתוספת 5% פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים מוכנים לשימוש בניסויים כאשר monolayer ומחוברות נוצר, תוך 3 ימים. </li></ol> 3. הכנת מונוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את HL-60 תאים בתרבית שבRPMI בתוספת 10% עגל בסרום עוברי, כתרבות השעיה, לתוך צינור 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תאי supernatant ו resuspend ב 5 מיליליטר תקשורת ולהתאים את ריכוז תאים עם תקשורת 2 מיליון תאים / מיליליטר. אם תיוג הקרינה של HL-60 הוא רצוי, resuspend תאי RPMI ללא סרום ויחסי הציבורoceed כאמור בסעיף 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של HL-60 השעיה תא לבאר כל צלחת 24 גם אשכול המכילה monolayer EC דגירה הצלחת בתרבית תאי חממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני לנבחרה לתקופה קצובה של זמן בין 1 ו -3 שעות. הבדל קטן הוא ציין בין שעה 1 ונקודת זמן 3 שעות, שבו רוויה מחייבת מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכונו לשטיפה / קצירת תא: מלא צינור 120 מיליליטר עם של HBSS 100 מיליליטר. לוותר על 1 מיליליטר של פורמלין לבאר כל צלחת גם טרי 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה, להשתמש זוג מלקחיים חדים ולהרים את coverslip הזכוכית מהבאר והחזק את coverslip אנכי ומורחים את הקצה של coverslip על פיסת הרקמה על הספסל במשך 3 שניות, נזהר שלא לגעת ב משטח מכוסה תא של coverslip עם הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק coverslip היטב עם זוג המלקחיים, להטביע את coverslip ובמתוך HBSS חמש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דאנק החמישיבHBSS, מורח את הקצה של coverslip על הרקמה במשך 3 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הנהלים הטובלים וספיגה מתואר ב3.6 ו -3.7, מה שהופך את הסכום כולל של שלושה סטים של 5 הטבעות אחרי טיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את coverslip לפורמלין 10% המכיל גם כדי לתקן את התאים ב RT. Coverslip מוכן לספירה, לאחסון לטווח ארוך או להיות נתון להליכים אחרים שיתוארו להלן. </li></ol> 4. תיוג של HL-60 תאים עם Tracker הנייד (לא חובה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוזן ולהעביר כמות מתאימה של HL-60 תאים (למשל, 10 מ&#39;) לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. צנטריפוגה HL-60 תאים ב XG 200 במשך 5 דקות. הסר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה גלולה תא במעקב סלולארי בתקשורת RPMI ללא סרום בריכוז של 1 מיליון תאים / מיליליטר. דגירה תאים בתרבית תאי חממה עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות וזורקים supernatant. גלולה תא גלולה בתקשורת לריכוז של 2 מיליון ג/ אמות מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של שכותרת Tracker הנייד HL-60 לכל תאי האנדותל המכילים גם גדלו על coverslip זכוכית. המשך על 3.3. </li></ol> 5. ספירת תאי האנדותל דבק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslips על שקופיות מיקרוסקופ עם נגדי כתם DAPI לזהות תאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ הפוכה עם מטרת 4X או 10X, לרכוש תמונות של כמה שדות (לדוגמא, 5 שדות) ולספור את המספר הגבוה ביותר של מונוציטים שמצטברים בתאי האנדותל בלתי מוקרן (זה צריך להיות בדרך כלל 3-5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע פעמיים מספר זה כסף של מונוציטים בתא האנדותל להיות שהוגדר כאשכול. אם נדרש, קריטריון שונה יכול לשמש להגדרת אשכול בהתאם לאופי של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר האשכולות ואת מספר תאי אנדותל בתחום. מחלקים את לשעבר ע&quot;י האחרון כדי להשיג את אחוז תאי האנדותל דבקים. ציוןשדות רבים כדי להשיג סטייה ממוצעת וסטנדרטית של הספירה. </li></ol> Counterstaining 6. עם נוגדנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר assay ההידבקות והתאים על coverslip תוקנו בפורמלין 10% במשך 15 דקות ב RT, להכפיף את coverslips לimmunofluorescence באמצעות הליך סטנדרטי 10 ונוגדנים של בחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה והסרה של הפתרונות השונים מאוד בעדינות כדי למנוע פירוק מונוציטים שמחוברים לתאי אנדותל. </li></ol> 7. counterstaining לפעילות בטא-galactosidase הקשורים הזדקנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר assay ההידבקות ותאים על coverslip תוקנו בפורמלין במשך 15 דקות, כתם לפעילות בטא galactosidase הקשורים הזדקנות כפי שמתואר בהוראות המלוות את ערכת הצביעה. הוספה והסרה של הפתרונות השונים מאוד בעדינות כדי למנוע פירוק מונוציטים שמחוברים לתאי אנדותל. </li></ol>

<ol>
	<li>Ortega-Gomez, A., Perretti, M., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+inflammation:+an+integrated+view.">Resolution of inflammation: an integrated view.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 661-674 (2013).</li><li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+cardiovascular+disease+mechanisms.">Inflammation and cardiovascular disease mechanisms.</a> Am J Clin Nutr. 83 (2), 456S-460S (2006).</li><li>Ikuta, S., Kirby, J. A., Shenton, B. K., Givan, A. L., Lennard, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cells:+effect+of+TNF-alpha+on+peripheral+blood+mononuclear+cell+adhesion.">Human endothelial cells: effect of TNF-alpha on peripheral blood mononuclear cell adhesion.</a> Immunology. 73 (1), 71-76 (1991).</li><li>Watson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6+acts+on+endothelial+cells+to+preferentially+increase+their+adherence+for+lymphocytes.">IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes.</a> Clin Exp Immunol. 105 (1), 112-119 (1996).</li><li>Sans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM-1+and+ICAM-1+mediate+leukocyte-endothelial+cell+adhesion+in+rat+experimental+colitis.">VCAM-1 and ICAM-1 mediate leukocyte-endothelial cell adhesion in rat experimental colitis.</a> Gastroenterology. 116 (4), 874-883 (1999).</li><li>Su, Y., Lei, X., Wu, L., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+cell+adhesion+molecules+P-selectin,+E-selectin+and+intercellular+adhesion+molecule-1+in+leucocyte+recruitment+induced+by+exogenous+methylglyoxal.">The role of endothelial cell adhesion molecules P-selectin, E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal.</a> Immunology. 137 (1), 65-79 (2012).</li><li>Hallahan, D., Kuchibhotla, J., Wyble, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+mediate+radiation-induced+leukocyte+adhesion+to+the+vascular+endothelium.">Cell adhesion molecules mediate radiation-induced leukocyte adhesion to the vascular endothelium.</a> Cancer Res. 56 (22), 5150-5155 (1996).</li><li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion.">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> J Immunol Methods. 159 (1-2), 93-100 (1993).</li><li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature.">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvasc Res. 82, 210-220 (2011).</li><li>Lowe, D., Raj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+aging+induced+by+radiation+exhibits+pro-atherosclerotic+effects+mediated+by+epigenetic+activation+of+CD44+expression.">Premature aging induced by radiation exhibits pro-atherosclerotic effects mediated by epigenetic activation of CD44 expression.</a> Aging Cell. 13 (5), 900-910 (2014).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

Assay הידבקות מונוציטים שתואר לעיל שימש בהצלחה בניסויים שנועדו לחקור את ההשפעות הביולוגיות של קרינה מייננת על monolayers אנדותל 10. אמנם זה לא השיטה היחידה העומדת לרשות להעריך את הדביקות של monolayer האנדותל, היא השיטה היחידה המאפשרת כימות של החלק או אחוז תאי אנדותל בmonolayer כי הוא דבק. זו הבחנה חשובה כמו שינוי הכמותי עולמי בהידבקות של מונוציטים, כפי שנמדד על ידי שיטות אחרות ניתן לייחס גם לעלייה כללית בדביקות של כל התאים של monolayer האנדותל או לדביקות הגידול של תת-אוכלוסייה של תאי האנדותל בתוך monolayer, כפי שמוצג בדוגמא לעיל. הערך שיש במידע זה בא לידי ביטוי בעובדה שהיכולת לכמת אחוז תאי האנדותל שהציגו דביקות משופרת לאחר ההקרנה הובילה לאינסמסוגל מסקנה שהשפעה זו אינה נובעת ממוטציה הגנטית של גן מסוים כאחוז התאים שהיו דבקים היתה מאוד מעל (מעל 1,000 פעמים יותר) שבו ניתן היו לצפות מן המוטציה של גן אקראי על ידי X-קרינה במינון ש . הגורם המאפשר שחזור טוב של התוצאות הוא משטר הכביסה. כנוהל השטיפה כרוך הטבילה של coverslip הזכוכית לחיץ לשטוף אחריו מספיגה על רקמה, השתנות במערבולת החיץ שמתעוררת באופן בלתי נמנע מהשיטה של ​​pipetting של החיץ לשטוף לתוך באר הישנה הוא נמנע. ואכן זה היה התצפית של השתנות מוגזמות בין משכפל שהושג באמצעות שיטת pipetting שאלצה אותנו לתכנן הליך כביסה שהסיר את האלמנט השונות מהשלב הכביסה. אמנם, המגבלות של שקר assay זה בצורך לבצע ספירה ידנית של אשכולות מונוציטים, שעושה not לאפשר לו להיות מותאם לתפוקה גבוהה מנתח. שנית, ההחלטה על אופן מונוציטים רבים מהווים אשכול יש שתיקבע באופן שרירותי וחצי הרמה ניתן להגדיר גבוהה מדי ולגרום להרחקה של כמה אשכולות אמיתיים. יכול גם להיות שנצפה החוסר בכוח גזירה בשיטה זו כהגבלה בניסויים שבהם דביקות משופרת גס של תאי האנדותל מושרה (למשל, + TNFα). במצבים אחרים לעומת זאת, החוסר בכוח הגזירה הוא יתרון שכן היא מאפשרת זיהוי של הגדלת פחות מוגזמת של דביקות. עלייה צנועה בדביקות מונוציטים יכולה להיות חשובה ורלוונטית במיוחד. בvivo, מונוציטים לא (בזמן ניסוי טיפוסי) צפוי לצרף במספרים גדולים לתאי אנדותל עם עלייה צנועה בדביקות, במידה רבה בשל הגזירה כוח. בזמן עם זאת, כמה מונוציטים כנראה הייתם, וזה סביר יותר מייצג את הסביבה של דלקת כרונית. כמו,העדר כוח גזירה יכול להיות יתרון כפי שהוא מספק הזדמנות לעליות קטנות בדביקות תא האנדותל להתגלות במסגרות זמן ניסיוניות שהן בדרך כלל קצרים ואולי גם חולפים כדי לאפשר גידול צנוע בדביקות שנצפה תחת מאמץ גזירה. היכולת להכפיף את התאים לאחר assay זה לניתוחים אחרים כגון assay הזדקנות ומכתים immunofluorescence מגדילה את התועלת של שיטה זו שכן היא מאפשרת את הקשר של דביקות של תאי האנדותל ספציפיים לחלבונים תאיים מסוימים או מדינות סלולריות כפי שהודגם לעיל, תכונה ש אינו זמין עם מבחני הידבקות המבוגרים. שיטה זו נעשתה שימוש בתאים-הונצח est2 אדם כלילית אנדותל ותוצאות דומות התקבלו גם בתאים ראשוניים אדם כלילית אנדותל 10, מדגים שזה לא ספציפי רק קו תא מסוים. כמו כן, ADOption של שיטה זו של מנסה לאמוד דביקות של תאי האנדותל אינו מונע העמדת אותם תאים לassay ההידבקות הסטנדרטי שמודד הקרינה של immunocytes שכותרת. יחד, דוח זה מוכיח כי שיטה זו היא תכליתית, כוללת ומספקת הרבה יותר מידע מאשר assay ההידבקות הסטנדרטי.

<html> הסתננות של תאים חיסוניים כגון מונוציטים פני שכבת תאי האנדותל המרפדים את כלי דם היא צעד חשוב בתהליך של דלקת 1. זה מאפשר הביות של תאי מערכת חיסון (immunocytes) לאתר של פציעה. במקרים אחרים ובמקומות כגון עורקים הכליליים ועורק הראשי, חדירה של מונוציטים דרך שכבת האנדותל יכולה להוביל למגורים לטווח ארוך רצויים של תאים אלה בקיר של העורק, שעלול להוביל להיווצרות הפלאק 2. בכל המקרים של חדירת immunocyte, הצעד הראשון כרוך בהפעלתם של תאי האנדותל באזור מקומי של כלי הדם. תאי האנדותל מופעלים על ידי ציטוקינים פרו-דלקתיים כגון TNF-α ו- IL-6 להגדיל ביטוי של חלבונים בתא שטח כגון VCAM, ICAM ו- E-selectin המאפשרים הגיוס וקשר של immunocytes על פני השטח של תאי אנדותל 3 6. = &quot;Jove_content&quot; ילדה&gt; בתחילה, מדידה של הידבקות תא אנדותל בוצעה על ידי ספירת מונוציטים שדבקו אנדותל monolayer 7. מגבלותיה של שיטה זו במונחים של דיוק הובילו לשימוש בהלימפוציטים שכותרתו ברדיו או במונוציטים, ואחריו כימות של חומר רדיואקטיבי אשר תואם לימפוציטים או מונוציטים הידבקות 4. שיטה זו הוחלפה סופו של דבר על ידי שיטת הקרינה מבוססת, לפיה immunocytes עניין תויגה עם צבע פלואורסצנטי וכפוף לאותו ההליך כאמור לעיל עם ההבדל הוא הקרינה שבמקום רדיואקטיביות נמדדה 8. כיום שיטה זו התגלתה כנוחה ביותר ונמכר בצורת ערכה על ידי מספר ספקים מסחריים. בעוד assay זה יכול למדוד את הרמות יחסי של דביקות בין בקרות ודגימות ניסוי, זה לא לגלות אם שינוי בקרינה נובע משינוי אחיד בדביקות על פני כל הדואראוכלוסיית תא ndothelial או אם השינוי נובע מהבדל של דביקות בתת-אוכלוסייה של תאים. זה ניכר גם שהחומרה של שטיפה מפעילה השפעה עמוקה על התוצאה, ויותר חשוב מכך, את האחידות של שטיפה את מונוציטים מאוגד בין monolayers תא אנדותל שונה תשפיע במידה רבה על הקרבה של תוצאות ממשכפל והשחזור של התוצאות בין דגימות . לאחרונה, מספר מערכות שלשאוב מונוציטים בתקשורת ברחבי monolayer תא האנדותל שמשו כדי לטפל בבעיה זו 9. בנוסף, זרימת מערכות אלה גם לשחזר את האפקט של כוח גזירה על תאי האנדותל. למרות היתרונות של מערכות כאלה הם ברורים ומאוד אטרקטיביים, זה גם חשוב להבין כי בעוד דביקות תא האנדותל יכולה להיות מוגברת באופן משמעותי, כמו במקרה של דלקת חריפה ב, על ידי גורמים כגון TNFα, כמה מפעילים אחרים, כגון קרינה מייננת 10 לעורר שינויים לאכובע אינו מזוהה בקלות בתוך מבחנה מסגרות זמן ניסיונית על ידי מערכות מאוד מחמירות אלה. בעוד כגון שינויים של הרגע של דביקות תא האנדותל הם החמיצו או פוטרו במבחנה בקלות, זה לא פיר בהכרח in vivo, שבו שינויים קטנים כאמור בתוך זמן חיים, שהוא אופייני לדלקת כרונית, יכולים להפעיל תוצאות מאוד משמעותיות. לפיכך שיטה חזקה, עדיין רגישה, וספציפית כדי לזהות ולמדוד נחוצה דביקות תא האנדותל. כאן, אנו מדווחים על שיטה למדידת דביקות של תאי האנדותל ישירות. שיטה זו אינה מסתמכת על מדידת הקרינה כאינדיקטור פונדקאית עקיף של דביקות תא האנדותל. הוא מגלה אם שינויים בדביקות הם עקב שינוי אחיד על פני כל התאים או מרותק לתת-אוכלוסייה. יתר על כן, היא מאפשרת שיתוף צביעת תאי אנדותל עם סמנים כמו בטא galactosidase הקשורים הזדקנות, מר כדאיות תאker, Calcien בבוקר ונוגדנים נגד פני תא וחלבונים תאיים, המאפשרים לעמותה של תאי האנדותל דבקים פרט למדינות תא מסוימים או ביטוי של חלבונים ספציפיים.

<table><tbody><tr><td>Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips Round 12 mm Diameter</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>24-well cluster plate</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Meso-Endo Cell media</td><td>Cell Applications</td><td>212-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Soybean trypsin inhibitor</td><td>Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Foetal Calf Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Beta glasctosidase Assay kit&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>CellSignaling</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F0895</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro

אחד התהליכים העיקריים של דלקת היא החדירה של תאי מערכת חיסון מלומן של כלי הדם לרקמות שמסביב. מצב זה מתרחש כאשר תאי אנדותל, אשר מרפדים את כלי דם, הפכו לדבק במחזור תאים חיסוניים כגון מונוציטים. מדידה במבחנה של הדביקות הזאת עד עכשיו נעשתה על ידי כימות המספר הכולל של מונוציטים שלדבוק שכבת האנדותל או כספירה ישירה או על ידי מדידה עקיפה של הקרינה של מונוציטים חסיד. בעוד מדידות כאלה לעשות לציין הדביקות הממוצעת של אוכלוסיית תאי אנדותל, הם מבולבל על ידי מספר הגורמים, כגון מספר תאים, ולא לחשוף את חלקם של תאי האנדותל, כי הם דבקים למעשה. כאן אנו מתארים ומדגימים שיטה המאפשרת הספירה של תאים מודבקים בתוך אוכלוסייה שנבדקה של monolayer האנדותל. תאי האנדותל גדלים על coverslips הזכוכית והבא רצוייםטיפול מאותגרים עם מונוציטים (שעשוי להיות שכותרתו fluorescently). לאחר הדגירה, הליך שטיפה, מעורבת סבבים רבים של טבילה וניקוז, התאים הם קבועים. תאי האנדותל דבקים, אשר מוקפים במונוציטים בקלות מזוהים ומנויים, נותנים מדד הידבקות החושף את החלק הממשי של תאי האנדותל באוכלוסייה שהם דבקים.

שיטה זו מאפשרת זיהוי של תאי האנדותל דבקים בודדים בתוך אוכלוסייה. לדוגמא, בעוד monolayer של תאי האנדותל מוקרן האו&quot;ם שמר כמה HL-60 מונוציטים סדירים הבאים דגירה וכביסה, monolayer האנדותל ב -7 ימים שלאחר הקרנת 10Gy לפני דגירה עם מונוציטים היו קשורים במונוציטים באשכולות סביב תאי האנדותל בודדים ( איור 1). למרות שתופעה זו היא לצפות בקלות תחת מיקרוסקופ לעומת שלב, מיקרוסקופ פלואורסצנטי מגלה תמונה ברורה אף יותר של אשכולות מונוציטים. לאחר ביצוע assay ההידבקות תאר, אפשר להמשיך למכתימים את התאים לממברנה, cytoplasmic או גרעיני (איור 2) חלבונים באמצעות נוגדנים מתאימים עם שיטות immunofluorescence סטנדרטיים. יתר על כן, assay אנזים מבוסס כגון בטא-galactosidase הקשורים הזדקנות (איור 3) יכול להיות גם PErformed. מאז כל אשכול מונוציטים מתאים לתא האנדותל בודד, ספירה של האשכולות תחשוף את המספר האמיתי של תאי האנדותל דבקים בתוך monolayer (איור 4), ולכן אחוז תאי האנדותל דבקים באוכלוסייה (הטבלה 1, איור 6) . זוהי השיטה היחידה עד כה שמאפשר כגון כימות של דביקות תא האנדותל. ראוי לציין כי תאי האנדותל המשמשים בניסויים הנה-עכבות קשר ולא להגדיל במספר לאחר שהשיג נקודת המפגש. זה מבטל את מורכבות פוטנציאל טמונה במספר תא האנדותל עלה בנקודות זמן מאוחר יותר. אם תרצה, מונוציטים המצורפים לmonolayers אנדותל ניתן וחילצה ב -0.5% פתרון EDTA טריפסין-0.2% (במקום 3.9 קיבעון ב) והקרינה שלהם נמדדו באמצעות קורא צלחת, כמו במקרה של בשיטות עכשוויות (איור 5). </p&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> הידבקות באיור 1. של מונוציטים על monolayer של תאי האנדותל. בתאי האנדותל בלתי מוקרן, מונוציטים דבקו כתאים בודדים באופן סדיר ואקראי (משמאל לוחות) ובאשכולות על תאי האנדותל בודדים של 7 ימים לאחר 10 Gy המוקרנים monolayer (לוחות מימין). לוחות נמוכים הם תמונות הקרינה של הפנלים העליונים, המאשרים כי התאים כדוריים הקטנים ובהירים הגלויים תחת ניגוד שלב אכן מונוציטים שמראש שכותרתו עם התא-Tracker ירוק. חלק מאשכולות מונוציטים מסומנים על ידי חצים לבנים. תמונות צולמו באמצעות מטרת 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> מכתים איור 2. תאי אנדותל עבור assay חלבונים לאחר הידבקות. לאחר ביצוע assay ההידבקות תאר, תאים על coverslips הזכוכית היו נתונים לimmunofluorescence לגילוי (א) חלבון קרום (CD44), ב) חלבון cytoplasmic (טובולין) או ג) חלבון גרעיני (γ-H2AX). לוחות שמאל של (א) ו- (ב) (ראה עם מטרת 20X) מונוציטים מופע שכותרתו מראש עם תא Tracker הירוק ותמונה דומה על הלוחות תקין לחשוף CD44 וmicrotubules (אדום) וגרעינים צבעוניים DAPI (כחול). חצים לבנים בצבע על גרעין תא אנדותל המוקרן שהוכתמו נוגדנים נגד γ-H2AX (C). גרעיני מונוציטים שהם מוכתמים בהירים כחולים על ידי DAPI בקלות להבחין בין הגרעינים הסגלגלים בצורה של תאי האנדותל. תמונות צולמו עם מטרת 20X.<html> &quot;Target =&quot; _ jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> איור 3. מכתים בטא galactosidase הקשורים הזדקנות של תאי האנדותל. לאחר assay ההידבקות, תאים על coverslips היו נתונים לצביעה לבטאו galactosidase הקשורים הזדקנות שגורם lysosomes של תאים מזדקנים להכחיל, כפי שעולים בתא אנדותל ש הוא חייב באופן סלקטיבי על ידי מספר רב של מונוציטים, אשר מזוהים בקלות בשל גודלם הקטן וצורה כדורית. תמונה נראית דרך אובייקטיבי 20X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 2,924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; ספירת 4. איור של אשכולות מונוציטים על תאי האנדותל בודדים. לאחר assay ההידבקות, תמונות של התאים נלקחו מכמה עמדות שונות ואשכולות מונוציטים המזוהים והקיפה (בירוק). אשכול הוגדר כמסכת של 10 או יותר מונוציטים בתא האנדותל. מספר אשכולות מונוציטים ומספר 12 ימי תאי האנדותל לאחר מוקרן (המנוקד באדום) בתמונה נספר ואחוז תאי אנדותל חסיד מחושבים כפי שמוצג בטבלה 1. תמונה שצולמה באמצעות אובייקטיבי 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> איור 5. כימות הקרינה של מונוציטים חסיד. adhe הבא<html> assay שיאון, תאים על coverslips זכוכית trypsinised והקרינה של מונוציטים שכותרתו מראש עם CellTracker הירוק נמדדה, באמצעות קורא צלחת הקרינה, כאינדיקציה עקיפה של הדביקות של monolayer האנדותל. תוצאות ממדידות כאלה בימים האמורים שלאחר הקרנה-התקבלו וקלוע בגרף לעיל. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> ייצוג איור 6. ציוני assay הידבקות מהטבלה 1. תאי האנדותל דבקים בחמישה מקומות שונים בשלושה coverslips זכוכית הובקעו כמתואר באיור 4 והתוצאות נספר מעל הוכחה כי 12 ימים לאחר 10 הקרנת Gy, 8 עד 10 אחוזים ממוקרנים תאי האנדותל הפכו דבק. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; אחוז דבק תאי האנדותל </td></tr><tr><td></td><td> דיסק 1 </td><td> דיסק 2 </td><td> דיסק 3 </td></tr><tr><td> שדה 1 </td><td> 8.65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> שדה 2 </td><td> 10.44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> שדה 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> שדה 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7.09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> שדה 5 </td><td> 10.55 </td><td> 9.4 </td><td> 11.61 </td></tr><tr><td> ממוצע </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8.75 </td></tr></tbody></table> עשרות assay 1. הידבקות שולחן. תאי האנדותל דבקים בחמישה מקומות שונים בשלושה coverslips זכוכית הובקעו כמתואר בFigure 4 והתוצאות נספר מעל הוכחה כי 12 ימים לאחר 10 הקרנת Gy, 8 עד 10 אחוזים מתאי האנדותל המוקרנים הפכו דבק.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro at JoVE.com

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

כימות של דביקות תא האנדותל<em&gt; במבחנה</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

quantitation-of-endothelial-cell-adhesiveness-in-vitro

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

11.4K Views.  Centre for Radiation, Chemicals and Environmental Hazards, Public Health England. We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer. 

Video: Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Bioengineering

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Immunology and Infection

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

מבחני צבירת חרוז לאפיון של תא המשוערת הידבקות מולקולות

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

תזרים הידבקות Assay ללמוד יקוציט גיוס לבדית אדם סינוסי תנאי האנדותל של מתח שאר

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

אדם נויטרופילים תזרים לשכת הידבקות Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

הקרנת מבחני לאפיין הרגולטורים אנדותל הרומן מעורבים בתגובה דלקתית

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

אדהזיה דינמי Assay לניתוח פונקציונלי של טיפולים למניעת הידבקות במחלות מעי דלקתיות

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

כימות של דביקות תא האנדותל

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video