אנחנו נותנים תודה מיוחדת לאיב Couder עבור רבים דיונים מועילים. אנו מודים עאטף Asnacios לכיול של הזיזים והדיון. אנו מודים לליסה וויליס, אליוט מאירוביץ, ואוליבר Hamant לקריאה ביקורתית. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי מענק RGP0062/2005-C אדם Frontier תכנית המדע; סוכנות הידיעות Nationale de la משוכלל ונדיר פרויקטי&#39;&#39; Growpec,&#39;&#39; ו&#39;&#39; Mechastem&#39;&#39;.

1. הכן זכוכית שקופיות להרכבה לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן imbedding תקשורת agarose: 0.7% agarose התכה הנמוך במניטול 10% (במים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מכשיר מתכת חזק (טיפ לדוגמא: תרגיל, סיד), לחרוט את אזור סנטימטר 0.5 x 0.5 במרכז שקופית זכוכית מיקרוסקופית. או במקום, להדביק חתיכה קטנה של lamella זכוכית (כ -20 x 200 מיקרומטר) לשקופית הזכוכית באמצעות דבק Araldite. הערה: זה לחספוס פני השטח על מנת להקל את ההדבקה של agarose כדי להבטיח כי מקלות agarose תקשורת או תיקונים לשקופית. ניתן לעשות שימוש חוזר שקופית זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם טיפה של כ -20 μl של imbedding תקשורת agarose על האזור הצרוב של שקופית הזכוכית. זה נותן שכבה דקה של agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את שקופיות הזכוכית בקופסא לחה ולחכות לתקשורת agarose כדי לחזק. </li></ol> 2. ביתור והרכבת דוגמאות meristem <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> meristems Microdissect לImagi confocalng: להסיר את ניצני פרחים אחד אחד מהגזע על ידי משיכת אותם עם פינצטה העדינה במיוחד. חשוב להסיר את כל ניצני הפרחים עד הניצנים שאינו מציגים עלי גביע (כלומר primordia P1 14). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין גילוח או הקצה של פינצטה, חתך את meristem מהגזע. החתך צריך להיות מקביל לאזור של פני השטח meristem שיימדד עם AFM. השיא שהושג צריך להיות בין 300 מיקרומטר ומיקרומטר 600 גבוה להתאים מתחת לקצה AFM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף את הקודקוד לסרט של מדיה agarose מוכנה בשלב 1.1.4. בחר מיקום בשקופית זכוכית / agarose ולדחוף בעדינות כך שmeristem הוא גם ישירות במגע עם שקופיות הזכוכית ובולט החוצה מן agarose. זה חיוני כדי למקם את meristem בagarose בתוך כמה שניות שאחרי החתך שלה מהגזע. הערה: זו על מנת למנוע meristem מייבוש. בשלב זה, meristem יעמוד בCRACk כי agarose שבר על הפעלת לחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כמה meristems דרך זו להדמיה אצווה, ובלבד שהם באותו הגובה וממוקמים פחות מ -500 מיקרומטר זה מזה בשקופית. שמור meristems הכין בתיבה הלחה בזמן לנתח דגימות נוספות. הערה: הוא מגביל את הווריאציה המגיעה מהכיול. באופן אידיאלי 2 דוגמאות של כל תנאי יכולה להיות מוכנות ונמדדו באופן אקראי. עד כה אין השפעה נצפית של הדמיה אצווה על המדידה (תגובת לחץ מושרה). זה יכול להיות הודות לדילול של מולקולות איתות מתח באגר ו / או הפתרון הגובר. לחלופין תגובת הלחץ היא זהה, ללא קשר לכמות המדגם מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שעברתי לשלב הבא, ודא שהגבול בין meristem וניצני פרחים יבש. אם לא, להסיר בעדינות את המים העודפים באמצעות נייר סינון. זה צריך למנוע בשלב הבא שנמסagarose מציף המדגם בשל כוחות נימיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם טפטפת 20 μl, להוסיף מספיק נמס ההרכבה agarose כדי למלא את הסדק שנוצר בשלב 1.2.3. ולהקיף את כל meristem. Agarose צריך להגיע לרמה של הצלקת של הניצן שהוסר הפרח (primordium). כדי להשיג זאת, ייתכן שיהיה צורך להוסיף agarose בכל קצה של הסדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר agarose הוא הוסיף, זה יציף במהירות לתוך הסדק; באמצעות פיפטה, למצוץ את חלק מומס ההרכבה agarose כדי להבטיח שmeristem הוא הנקודה הגבוהה ביותר בשקופית. זה מתקן את meristem כך שהוא לא יכול לזוז במהלך הדמיה. </li></ol> 3. דוגמאות שורש או hypocotyl הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשורשים וhypocotyls, לא לנתיחה היא הכרחית. בשכבה הדקה של agarose בשקופית הזכוכית מוכנה, לעשות חריץ באופן ישיר מעל לחרוט בזכוכית או יחד lamella זכוכית. מקם את השורש או hypocotyl בחריץ זה להבטיח כי היא נמצאת בקשר עםזכוכית לכל אורכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שעברתי לשלב הבא, לוודא כי המדגם הוא יבש על פני השטח שלה. אם לא, בעדינות להסיר את עודפי מים באמצעות נייר סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה נמס הרכבה agarose סביב המדגם כמו בשלב 1.2.6. </li></ol> 4. AFM הכנה ורגישות כיול (לJPK Nanowizard AFM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר שלוחה על AFM. שלוחה צריכה להיות מותקנת עם indenter בצורה עגולה. הרדיוס יקבע את x, y, z ברזולוציה ועומק הכניסה שבמדידה מדויקת יכולה להיות בארכיון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקחת מידות טווינה-ננו על פני השטח של האפידרמיס, השתמש indenter עגול 50 רדיוס ננומטר; לקחת מידות mesoscale, השתמש indenter עגול מיקרומטר רדיוס 0.5; לקחת מידות microscale (מול 2-3 תאים), השתמש indenter עגול 2.5 מיקרומטר רדיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הלייזר בקצה שלוחה. יישר את הלייזר לאמצעשל השובה באמצעות המראה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם כוס נקייה מתחת AFM. הערה: את הפעולות הבאות מוגדרת להפוך את האות של עמדת הלייזר על קולט AFM לעיוות של שלוחה, ועל ידי הערכת קבוע הקפיץ של שלוחה, לתרגם אותה לכוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גישה עם &quot;נקודה להגדיר&quot; כוח היעד של V. 1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;ספקטרוסקופיה כוח&quot;. האם כניסה על ידי קביעת &quot;הנקודה להגדיר יחסי&quot; המקסימלי ל2 V, &quot;להרחיב את המהירות&quot; ל40 מיקרומטר / שנייה, ואת &quot;אורך z&quot; עד 5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתפריט &quot;כיול מנהל&quot;, בחר את החלק הליניארי של העקומה קדימה כדי להתאים את הרגישות באמצעות הכפתור &quot;בחר טווח בכושר&quot;. &quot;הנקודה להגדיר יחסי&quot; צריכה להפוך מ&quot; וולט &quot;ל&quot; מטר &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתפריט &quot;מנהל כיול&quot;, בחר &quot;קבוע קפיץ&quot; כדי להעריך את אלasticity של שלוחה באמצעות תנודות תרמיות. לחץ על &quot;הפעל&quot; כדי להשיג את עלילת הצפיפות ספקטרלית של שלוחה. מצא את שיא התהודה עם התדר הנמוך ביותר. להתאים אותו באמצעות הכפתור &quot;בחר טווח בכושר&quot;. הערה 1: לפרטים נוספים על כוונון תנודות תרמיות, לקרוא קוק ואח&#39; 15. הערה 2: עדיף להשתמש בשיטה ישירה כדי להעריך את האלסטיות של שלוחה באמצעות שלוחה התייחסות (או חומר עם קשיחות ידועה). אחד משמש כאן נתרם באדיבות על ידי עאטף Asnacios 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של 10% פתרון מניטול תחת קצה שלוחה. ליישר מחדש את הלייזר לאמצע השובה באמצעות המראה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל מחדש את הרגישות: מתפריט &quot;כיול מנהל&quot;, לחץ על הכפתור &quot;לא ידוע&quot;; חזור על שלבים 2.3 דרך ל2.5. </li></ol> . 5 קליטים נתונים: מודול מיפוי של יאנג לכאורה <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הדגימות הרכובים תחת AFM ולהוסיף טיפת 500 μl של 10% פתרון מניטול על המדגם. פתרון מניטול plasmolyzes התאים בתוך דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גישה עם כוח יעד (&quot;להגדיר נקודה&quot;) של 20 ננ (&quot;נקודה מוגדרת&quot; לא צריכה להיות יותר מ 3 V) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כניסה עם &quot;נקודת מערכת יחסי&quot; של 200 NN, &quot;להרחיב את המהירות&quot; של 40 מיקרומטר / sec, ו&quot; אורך z &quot;של 5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את &quot;נקודה להגדיר יחסי&quot; על מנת לקבל כניסה של 100 ננומטר ל200 ננומטר רכובים שלוחה או 0.5 מיקרומטר לשלוחה רכוב 1 מיקרומטר / 5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במצב &quot;כוח מיפוי&quot;, בחר אזור לסריקה: לmeristems, 70 מיקרומטר x מיקרומטר 70 עם רזולוציה (&quot;פיקסלים&quot;) של 64 x 64; לhypocotyls ושורשים, עם רזולוציה של 64 x 64 100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העיתונות לסרוק להשיק את הניסויים. שמור את הפלט. </li&gt; </ol> . 6 ניתוח נתונים: חישובי מודול יאנג לכאורה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ הנתונים בתוכנה לניתוח נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;עיבוד אצווה&quot; כדי להחיל את אותו ניתוח לכל העקומות של מפה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;לתקן את הגובה עבור הכיפוף של שלוחה&quot; כך כדי לחלץ את עומק הכניסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;הפונקציה של יאנג מודולוס כושר&quot; שתניח הכוח הוא פרופורציונאלי לאזור של כניסה. הגדר את &quot;צורת הקצה&quot; לParabolic להניח שצורת הכניסה היא parabolic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציין את הרדיוס של הקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מעדיף את העקומה &quot;לסגת&quot; לניתוח משום שהוא פחות רגיש לטופוגרפיה מאשר עקום &quot;להאריך&quot;. עם זאת, אם יש דבק משמעותי של החללית במהלך &quot;לסגת&quot;, להשתמש בעקומה &quot;להאריך&quot;, שאינה רגיש לדבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערכהיחס פואסון ל0.5. לחץ על לנתח ולשמור את הפלט. </li></ol>

<ol>
	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+in+vitro+extensibility+of+growing+plant+cell+walls.">Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls.</a> Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).</li><li>Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+plant+cell+wall+extension+(creep)+induced+by+acidic+pH+and+by+alpha-expansin.">Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263 (2009).</li><li>Durachko, D. a. n. i. e. l. M., C, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Plant+Cell+Wall+Extension+(Creep)+Induced+by+Acidic+pH+and+by+Alpha-Expansin.">Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin.</a> J. Vis. Exp.. , 25 (2009).</li><li>Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onion+epidermis+as+a+new+model+to+study+the+control+of+growth+anisotropy+in+higher+plants.">Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants.</a> Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).</li><li>Parre, E., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin+and+the+role+of+the+physical+properties+of+the+cell+wall+in+pollen+tube+growth+of+Solanum+chacoense.">Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense.</a> Planta. 220, 582-592 (2005).</li><li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties.">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental biology. 334, 437-446 (2009).</li><li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth.">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).</li><li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy.">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).</li><li>Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanical+contributions+of+the+pectin+matrix:+Insights+for+cell+growth.">Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth.</a> Plant signaling &amp; behavior. 7, 1037-1041 (2012).</li><li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics.">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).</li><li>Agudelo, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TipChip:+a+modular,+MEMS-based+platform+for+experimentation+and+phenotyping+of+tip-growing+cells.">TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).</li><li>Miedes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xyloglucan+endotransglucosylase/hydrolase+(XTH)+overexpression+affects+growth+and+cell+wall+mechanics+in+etiolated+Arabidopsis+hypocotyls.">Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls.</a> Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).</li><li>Byrne, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+leaves1+mediates+leaf+patterning+and+stem+cell+function+in+Arabidopsis.">Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis.</a> Nature. 408, 967-971 (2000).</li><li>Cook, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+implementation+of+dynamic+methods+for+measuring+atomic+force+microscope+cantilever+spring+constants.">Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants.</a> Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).</li><li>Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creep+function+of+a+single+living+cell.">Creep function of a single living cell.</a> Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).</li><li>Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+mechanics+and+growth+control+in+plants:+the+role+of+pectins+revisited.">Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited.</a> Frontiers in plant science. 3, 121 (2012).</li><li>Mittler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+signaling:+the+new+wave.">ROS signaling: the new wave.</a> Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).</li><li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana:+the+relationship+between+auxin+and+pectin.">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> PLoS. 8, e57813 (2013).</li><li>Asnacios, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanics+behind+cell+polarity.">The mechanics behind cell polarity.</a> Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).</li><li>Meister, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FluidFM:+combining+atomic+force+microscopy+and+nanofluidics+in+a+universal+liquid+delivery+system+for+single+cell+applications+and+beyond.">FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond.</a> Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).</li><li>Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ball+tonometry:+a+rapid,+nondestructive+method+for+measuring+cell+turgor+pressure+in+thin-walled+plant+cells.">Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells.</a> Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).</li><li>Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulator+or+driving+force?+The+role+of+turgor+pressure+in+oscillatory+plant+cell+growth.">Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth.</a> PloS one. 6, e18549 (2011).</li><li>Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+extraction+of+Arabidopsis+cell+turgor+pressure+using+nanoindentation+in+conjunction+with+finite+element+modeling.">In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

בצמחים, תכונות מכאניות משתנות לשחק תפקיד מרכזי בהכוונת צמיחה והמורפוגנזה. נכון להיום חלה התקדמות רבה בהתרת הרשתות הגנטיות וכימיות השולטות בגידול צמחים, אבל הידע של איך רשתות אלה תורמות ל, ומושפע משינויים בתכונות מכאניות שלנו הוא מתוצרת מקומית. שיטה זו אמורה לאפשר לנ...

צמיחה בצמחים מושגת על ידי ההרחבה מתואמת של קירות תא הנוקשה המקיפים כל תא ותא של האורגניזם. צבירת ראיות מצביעה על כך שזאת היא באמצעות השינוי של דופן תא כימיה שצמחים מקומיים לשלוט התרחבות זו. הוא חשב ההתרחבות שמונעת בעיקר על ידי לחץ על דפנות תאים, הנגרמות על ידי לחץ turgor הגבוה של התא; תגובת זן זה ללחץ turgor נשלטת על ידי התכונות מכאניות של קירות תא 1. מעט ידוע על התכונות מכאניות הללו וכיצד הם משתנים במהלך התפתחות. יתר על כן מעט מאוד ידוע על איך התכונות מכאניות האלה נשלטות והאם פידבקים לתרום לשנות דופן תא כימיה באופן שמתואם, ככל הנראה, על פני רקמה. אם אנו רוצים להבין את הקשר בין שינויים כימיים ומכאניים בקירות תא צמח במהלך פיתוח, וסופו של דבר איך האינטראקציות מיקרוסקופיות האלה למשול צמחצמיחה מקרוסקופית של, שיטה שיכולה לפקח על תכונות מכאניות של קירות תא בפיתוח איברים בקנה המידה התאי או רקמות נדרשת. שיטת מיקרוסקופ כוח האטומי (AFM) שתוארה כאן, המבוססת על לחיצות רקמת מיקרומטר או ננומטר או חריצים, פותח בדיוק כדי למדוד את התכונות מכאניות של קירות תא בפיתוח איברים בו זמנית ברזולוציות subcellular ועל פני אזורים שלמים של רקמות. יש שיטות אחרות או ברזולוציה שהיא נמוך מדי או גבוהה מדי: extensometer היא רק מסוגלת למדוד את התכונות מכאניות הממוצעת של כל רקמה בקנה מידת מילימטר 2-4, בקנה מידה שהיא למשל גדול מדי כדי למדוד את האירועים בתחילת organogenesis; microindenter יכול לקחת מדידות ברזולוציה subcellular בקנה המידה ננומטרי, אבל זה מוגבל למדידת תאים מבודדים ולא קבוצות של תאים או איברים 5-7. עם AFM, דורשרקמת ד, סלולרית, והחלטות subcellular יכולים להיות מושגת על 8-10. לאחרונה כמה פרוטוקולים פותחו במיוחד כדי למדוד את המכניקה של רקמות צמחים שיכולים לשמש גם 11, 12. אנו נציג כאן כיצד להעריך את האלסטיות של הרקמות באמצעות מדידה של מודול יאנג לכאורה 13. מודול יאנג משמש בדרך כלל כדי לתאר את הקשיחות של חומר. במהלך עיוות קטנה את הכוח הדרוש כדי לעוות חומר הוא יחסי לאזור של כניסה. מודול יאנג הוא מקדם זה. במקרה של חומר הומוגני רציף אותו מקדם יימדד ללא קשר לסוג הכניסה (גודל וצורה), אבל ישתנה עם המהירות של המדידה. במקרה של המבנה המורכב של רקמת צמחים, ראה עד כה כי הכוח הוא פרופורציונאלי לעיוות המאפשרת הקביעהמקדם של מידתיות שאנחנו שם &quot;מודול הצעיר לכאורה&quot;. בניגוד לכך מבמדיות מתמשכת בצמחים, מודול הצעיר לכאורה זו הוא רגיש לגודל של הכניסה. זה לא מתאימות לmoduli הצעיר של דופן תא טהורה. זה הכי טוב מתאר את האלסטיות של הפיגומים של תא הקיר של הרקמה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="850">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">NanoWizard</td>
			<td style="width:167px;">All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM stage</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">CellHesion</td>
			<td>Required for sample withe low topography (les then 11&#181;m between the lowest and the highest point in the aria of force scanning).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM optics</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">Top View Optics&#160;</td>
			<td>Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereo Microscopes&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M125</td>
			<td>Any type of stereo microscopes could do.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">150nm mounted cantilever&#160;</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">R150-NCL-10</td>
			<td>To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1&#181;m mounted cantilever&#160;</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td>SD-Sphere-NCH-S-10&#160;</td>
			<td>to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tipless cantiliver</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td>TL-NCH-20&#160;</td>
			<td>to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5&#181;m mounted cantilever. We attached a 5&#181;m borasilicate bead to a tipless cantiliver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5&#181;m silicon microspheres</td>
			<td style="width:348px;">Corpuscular</td>
			<td style="width:119px;">C-SIO-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aradilte&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Bartik S.A. 77170 Coubet France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;low melting Agarows</td>
			<td style="width:348px;">Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410</td>
			<td style="width:119px;">BP160-100</td>
			<td>34-45 Gelation Temperature</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">D-Mannitol</td>
			<td style="width:348px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA)</td>
			<td style="width:119px;">M4125-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">2&#160; Stainless Steel No. 5 Tweezers</td>
			<td style="width:348px;">Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland&#160;</td>
			<td align="right">951199</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

afm-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions

אנו מתארים שיטה שפותחה לאחרונה למדידת תכונות מכאניות של פני השטח של רקמות צמח באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מיקרו / ננו חריצים, לAFM JPK. באופן ספציפי, בפרוטוקול זה אנו מודדים את מודול יאנג לכאורה של קירות תא ברזולוציות subcellular על פני אזורים של עד 100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר בmeristems הפרחוני, hypocotyls, ושורשים. זה דורש הכנה מדוקדקת של המדגם, הבחירה הנכונה של מיקרו indenters ועומק כניסה. כדי להסביר את דופן תא אך ורק נכסים, מדידות מתבצעות בתמיסות מרוכזות מאוד של מניטול כדי plasmolyze תאים ובכך להסיר את תרומתו של לחץ turgor התא. בניגוד לטכניקות קיימות אחרות, באמצעות indenters שונה ועומקי כניסה, שיטה זו מאפשרת מדידות multiscale בו זמנית, <em&gt; כלומר ברזולוציות subcellular ועל פני מאות תאים המרכיבים רקמות. משמעות הדבר היא כי ניתן כעת לאפיין מרחבית-temporally שינויים המתרחשים בתכונות מכאניות של קירות תא במהלך התפתחות, המאפשר שינויים אלה כדי להיות מתואמים עם צמיחה ובידול. זה מייצג צעד מפתח כדי להבין כיצד שינויים תאיים מיקרוסקופיים מתואמים להביא לאירועי morphogenetic מקרוסקופית. עם זאת, מספר מגבלות יישארו: השיטה יכולה לשמש רק על דגימות קטנות למדי (כ -100 מיקרומטר קוטר) ורק ברקמות חיצוניות; השיטה היא רגישה לטופוגרפית רקמות; הוא מודד רק היבטים מסוימים של תכונות מכאניות המורכבת של הרקמות. הטכניקה מפותחת במהירות וסביר להניח כי רוב המגבלות האלה ייפתרו בעתיד הקרוב.

באיור 1 אנו מציגים מפות טיפוסיות יאנג moduli של meristems הפרחוני (איורים 1 א ו-1B) hypocotyls, צעיר ומבוגרת (דמויות 1C-F), וmeristem שורש (איור 1G ו1H). בכל הניסויים indenter הוא חצי כדור, אבל הרדיוס שלו שונה, כך שיכולות להיות מושגת על החלטות מרחביות שונות ?...

Watch this Scientific Journal Video about AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions at JoVE.com

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

מיפוי מבוסס AFM של תכונות אלסטיות של קירות תא: ברקמות, נייד, והחלטות subcellular

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

afm-based-mapping-elastic-properties-cell-walls-at-tissue-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Views.  Université Paris Diderot. We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Video: AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

שיטות מולקולה בודדת עבור ניטור שינויים ב bilayer תכונות אלסטיות

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק II: פחמימות

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

מתח וסידן ערוץ כפול אופטי מיפוי של תרבית HL-1 פרוזדורים Myocyte חד שכבתי

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

דיסקציה של בולה השמיעה של עכברים אחרי לידה: בידוד של עצמות באוזן התיכונה ניתוח היסטולוגית

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

ניתוח של תפקוד תאי בטא באמצעות הדמיה הסידן בתא יחיד ברזולוציה איונים דג זברה

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

הדמיית תאים חיים ברזולוציה סופר-רזולוציה של מבנים תת-תאיים

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic properties. Density is a cell type identifying property, directly related to its metabolic rate, differentiation, and activation status. Magnetic levitation allows a one-step approach to successfully separate, image and characterize circulating blood cells, and to detect anemia, sickle cell disease, and circulating tumor cells based on density and magnetic properties. This approach is also amenable to detecting soluble antigens present in a solution by using sets of low- and high-density beads coated with capture and detection antibodies, respectively. If the antigen is present in solution, it will bridge the two sets&#160;of beads, generating a new bead-bead complex, which will levitate in between the rows of antibody-coated beads. Increased concentration of the target antigen in solution will generate a larger number of bead-bead complexes when compared to lower concentrations of antigen, thus allowing for quantitative measurements of the target antigen. Magnetic levitation is advantageous to other methods due to its decreased sample preparation time and lack of dependance on classical readout methods. The image generated is easily captured and analyzed using a standard microscope or mobile device, such as a smartphone or a tablet.

This paper describes a magnetic levitation-based method that can specifically detect the presence of antigens, either soluble or membrane-bound, by quantifying changes in the levitation height of capture beads with fixed densities.

כימות של צפיפות תאית ומאפיינים אנטיגניים באמצעות ריחוף מגנטי

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...