The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.

הנהלים כל חיה שבוצעה במחקר זה מאושרים על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת Keio ועדת שימוש (IACUC - מספר אישור: 09,221) ופעל לפי הנחיות מוסדיים על ניסויים בבעלי חיים ב Keio University לשימוש בבעלי חיים למחקר. דגימות אנושיות בודדו פגר נתרם המחלקה לאנטומיה, אוניברסיטת Keio לרפואה, ושימשו בהתאם לתקנות מוסדיים. 1. ניתוק של שמיעתי בולה ו Capsule <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים בתוך צנצנת המכילה פלטפורמה מעל מגבות נייר ספוגה isoflurane או sevoflurane עד אוורור הנשימה נפסקת למשך יותר דקות ולאחר מכן לבצע פריקה צוואר הרחם. היזהר, כדי למנוע מגע ישיר של עכברים עם מגבות נייר ספוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך רוחבי קטן על הגב בצד של הצוואר ומושך עור בנפרד לכיוון הראש והזנב בשני הידות לחשוף mu צוואר הבסיסירקמת scle. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף עכברים באזור צוואר הרחם באמצעות 14 ס&quot;מ מספריים כירורגיות חדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עור פיל לחלוטין לכיוון האף. חותכים כל העור יחד עם החוטם ו החותכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מספרי לתוך הפה ופצע שרירי masseter משני הצדדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הלסת בזהירות להסיר את הלשון והלסת התחתונה יחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים חדים, גולגולת פיצול ובסיס גולגולת לשני חצאים לאורך מטוס midsagittal (איור 1 א &#39;, ב&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להסיר את אונות המוח והמוח קטנות ואת גזע המוח. הבולה ואת הקפסולה השמיעה ממוקמים לרוחב במוח הקטן גזע המוח. ראוי לציין, כי הבולה השמיעתית היא עוד לרוחב הקפסולה השמיעה (איור 1 ג &#39;, ד&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הבולה ואת הקפסולה עם עצם הגולגולת שמסביב (איור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הדגימה כדי בצלחת המכילה פוספט שנאגר המלוח (PBS) pH 7.4 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Under מיקרוסקופ לנתח משקף, להשתמש במלקחיים כדי לפרק את העצמות ומספריות סביב לחתוך את הגבול התיר סביב בולה ואת הקפסולה (האיור 1F). העצמות שמסביב הסיר הם basioccipital (גבול גחון), exoccipital (הגבול אחורי-ventro), supraoccipital (גבול אחורי), interparietal, הקודקודית (גבול גב), squamosal (גבול dorso-קדמי), alisphenoid (גבול קדמי), ו basisphenoid (אנטרו-גחון גבול) עצמות. ראוי לציין, כי תהליך דְמוּי חֶרֶט (SP), התומך פתיחת התוף של חצוצרת השמע 41, היא נבדלת תהליך styloid של העצם הטמפורלית. </li></ol> בידוד 2. השמיעתי ossicles: &quot;פטיש, Incus ו מִשׁוֶרֶת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;פטיש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשני מספרי מלקחיים קטנים, הוצא את החלק של לרוחב תעלת שמע החיצוני אל tympanicus מענית כך התוף גלוי (איור 2 א &#39;, ב&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור חלק עור התוף ועצמות הטימפאנית ליד malleal processus brevis (apophysis והמעוגל, ראה דיון), הוא על הגחון (מנוקד) ואת אחורי (#) קירות (איור 2 ג). שריר tympani &quot;פטיש ו מותח צריך להיחשף עכשיו (איור 2 ד, ה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את &quot;פטיש (איור 2F) וחותכים את השריר tympani מותח עם הקצה המחודד של מחט 27 G (איור 2G). ראוי לציין, כי manubrium malleal מייחס בחוזקה אל עור התוף, כפי שנראה יונקים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את עור התוף בקפידה מתוך manubrium, שהוא שברירי. הסר את העצם הטימפאנית לחשוף שלושה ossicles השמיעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקוע &quot;פטיש מן incus במפרק ossicular (2H איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את &quot;פטיש ידי שבירה בתהליך הקדמי ליד goniale. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Incus ו מִשׁוֶרֶת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד tהוא incus ידי ניתוק הרצועה האחורית של incus על היחידות להחלפה עצמית הקצרות (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את מִשׁוֶרֶת ידי ניתוק העורק stapedial ליד מִשׁוֶרֶת אחדות מן הקצה המחודד של מחט 27 G (איור 3B, C). במידת הצורך, לחתוך את הגיד של השריר stapedial לעבר תהליך של שרירי מִשׁוֶרֶת עם המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט תפירה (או סיכה לציון) לתוך נקב האטם של מִשׁוֶרֶת והרמת את מִשׁוֶרֶת. לאחר הסרת מִשׁוֶרֶת, פתיחת החלון הסגלגלה צריכה להיות גלוי לעין (איור 3D). </li></ol></li></ol> Embedding 3. שמיעתית בולה ו Capsule <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה להטבעה בבלוקי פרפין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את הבולה ואת הקפסולה כמתואר בסעיף 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הקצה הקדמי של בולה (תהליך דְמוּי חֶרֶט) במספריים, לטבול את הבולה ואת הקפסולה paraformaldehyde 4% (PFA) ב- PBS ב 4 °C, ולאפשר מקבע להיכנס הבולה. אם האוויר הופך לכוד בתוך בולה, להסיר אותו עם מחט ומזרק. השאירו את הבולה ואת כמוסה מקבע ב 4 ° CO / N על הכתף צינור. זהירות: PFA הוא רעיל וצריך להיות מטופל בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Decalcify הבולה ואת הקפסולה במשך שבוע ב 4 ° C ב 10% מימית מלח ethylenediaminetetraacetic חומצה Disodium (EDTA-2Na), 100 מ&quot;מ טריס בסיס, pH 7.0, בתוך שפופרת מ&quot;ל 2. שינוי למאגר בכל יום אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם עם PBS. דוגמאות ניתן לאחסן 70% אתנול במים על 4 מעלות צלזיוס. לחלופין, להעביר אתנול 70% באמצעות סדרת אלכוהול מדורג (30%, 50%, 70% במים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מעבד רקמות, מייבש דגימות בסדרה מדורגת של פתרונות אתנול (70%, 2x 95%,% 3x 100, כל 1 ח), ברורות קסילן (4x, כל h 1 ב 40 ° C), ולחדור דגימות עם שעוות פרפין מותך 42. לחלופין, קסילן תחליף עם להכשיר רקמות מסחריותפתרון g (למשל, HISTO-נקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרוק דגימות מהמעבד, ולהוציא אותם הקלטות שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מערכת קונסולת הטבעת רקמות, מקום דגימות לתוך תבניות מלאות שעוות פרפין מותכת. המשך הטבעה (סעיף 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן להטבעה בבלוקים קפוא (שיטת הסרט של קאוואמוטו) 43 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את הבולה ואת הקפסולה כמתואר בסעיף 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הקצה הקדמי של בולה (תהליך דְמוּי חֶרֶט) במספריים, לטבול את הבולה ואת הקפסולה מקבע (2% ​​או 1% PFA ולא 4% ב PBS לשמר antigenicity) בשעה 4 מעלות צלזיוס. אם נלכד אוויר בולה, להסיר אותו באמצעות מחט מזרק. השאירו את הבולה ואת כמוסה מקבע ב 4 ° CO / N על הכתף צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף הבולה ואת הקפסולה במהירות PBS ומיד לטבול במתחם הטבעה-קריו נוזלי ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב: הסר בועות אוויר אם בכלל באמצעוהחיצוניים אוזן באמצעות שאיפה ידי מחט, ועל ידי הוספת מתחם ההטבעה עם מלקחיים. המשך הטבעה (סעיף 4). </li></ol></li></ol> 4. כיווניות לדוגמא והטבעה ההערה: בולה ואת הקפסולה כולה צריכים להיות מסודרת כיוון מסוים במהלך ההטבעה לחתוך חלקים רצויים. הנהלים המפורטים להלן משמשים לבתר את &quot;פטיש אוריינטציות שונות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתך אורך (parasagittal) של &quot;פטיש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים בצד הלטרלי של בולה או meatus השמיעה החיצונית למטה פרפין חם (או תרכובת הטבעה-קריו). לשנות את הכיוון כך lamina הצוואר והרוחבי של &quot;פטיש מקביל התחתון האופקית של מנת ההטבעה (איור 4 א - ג). ראוי לציין, כי עור התוף נוטה בזווית של כ 30 מעלות אל אנכי בראש העכבר (איור 4 א; איור 59 ב Kampen <sup&gt; 44). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתך אופקי של &quot;פטיש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הרכס הגבה אופקי פרפין חם (או תרכובת ההטבעה-קריו). לשנות את הכיוון של הבולה ואת הקפסולה כך lamina הצוואר ורוחבי של &quot;פטיש הם ניצבים אל החלק התחתון של המנה הטבעה (4D איור - F). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתך פרונטלי (חתכים) של קרום manubrium ואת התוף 5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את manubrium malleal פרפין חם (או תרכובת הטבעה-קריו) כך שיהיה ניצב בתחתית צלחת הטבעה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגניב במורד הרחוב לטמפרטורות מתאימות להקשיח פראפין על מערכת קונסולת הטבעת רקמות (לחלופין, להשתמש מתחם ההטבעה-קריו באמבט קרח / הקסאן יבש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך לחסום רקמות וחתכים לחתוך באמצעות פרוצדורות שגרתיות. לדוגמה, חלקים פרפין הכתם עם hematoxylin ו eosin (H &amp; #38; E), safranin O (עבור סחוס), או לפעילות Tartrate עמיד phosphatase חומצה (TRAP) (עבור osteoclasts) 3, או על ידי אימונוהיסטוכימיה. Cryosections Undecalcified מתאימים תיוג העצם באמצעות fluorochromes 14, מכתים אדום פואית עבור סידן, immunofluorescence 42. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כאן, אנו מציגים שיטה שימושית לבודד את הבולה ואת הקפסולה שמיעה בעכברים לאחר לידה. לפני P12, רקמות שבירות ויכולות להינזק במהלך בידוד. לאחר P12, הבולה ואת הקפסולה השמיעה ניתן לבודד בקלות הרקמות הסובבות. ביתור בולה מהראש לפני החתך יש מספר יתרונות. ראשית, cavitation לאחר הלידה והצמיחה של בולה השמיעה להתרחש באופן פעיל ביותר מ P6 ואילך הושלמו על ידי P14 50. רקמת mesenchymal בין עור התוף וקיר שבלול מוחלף אוויר בתהליך cavitation. האוויר כתוצאה בחלל האוזן התיכונה יכול לעכב קשר בין רקמות ונוזלים במהלך קיבעון, decalcification והטבעה. זה קל יותר להסיר אוויר מן בולה השמיעה מבודד על ידי ניתוק (תהליך דְמוּי חֶרֶט) הקצה הקדמי במקום לנסות לעשות זאת הבולה unisolated. שנית, הכיוון של &quot;פטיש (ועם עור התוף) הוא לא אנכיבראש. לכן קל לבתר את &quot;פטיש במטוסים הרצוי על ידי טבעת הבולה ואת הקפסולה שמיעה המבודדות אורינטציה נתונה. לאחר מבודד, בולה שמיעתית קפסולות שימושיות עבור ניתוחים רבים. לדוגמה, X-ray ברזולוציה גבוהה מיקרו-CT יכול לחשוף מורפולוגיה מיקרו העצם כגון נימים osteogenic ב &quot;פטיש 14. מיקרוסקופ לנתח stereofluorescence הוא כלי רב עוצמה כדי להמחיש מבנים בהערכת עכברים הכתב להביע חלבוני ניאון באוזן התיכונה או הפנימית 33. בנוסף, שונה in vivo או vivo לשעבר שיטות תיוג קרינה וזיהוי immunofluorescence הר שלם יכול להתבצע. מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור הוא גם שימושי עבור ניתוח תלת ממדי 51. למרות שלא תואר כאן, מבנים אנטומיים מגוונים קשורים הבולה ואת הקפסולה השמיעה כגון עצבים היקפיים, כלי דם, ואתעור התוף באוזן התיכונה גם ניתן להעריך באמצעות פרוטוקול זה. שים לב חתך פרפין דורש decalcification של רקמות עצם לפני ההטבעה ולכן אינו מאפשר ניתוח של מינרליזציה. לעומת זאת, שיטת סרט קאוואמוטו 43 המשמשת להכנת חלקים קפואים יכולה להתבצע ללא decalcification והוא מתאים מחקרים מינרליזציה באמצעות טכניקות עצם תיוג vivo או צביעה מיוחדת כגון מכתים Alizarin. תנאי קריו חתך צריכים להיות מותאמים בהתאם על בסיס גיל עכבר. לדוגמה, טמפרטורה קרירה פחות בתוך החדר cryostat מומלצת דגימות עכבר מבוגר כדי למזער את הנזק סעיפים. בשנת עכבר, המונח הנכון עבור הבליטה חצי כדורי הבולטים של &quot;פטיש הוא &quot;apophysis והמעוגל&quot;. עם זאת, המונח &quot;brevis processus&quot; כבר בשימוש נרחב כדי לציין את apophysis והמעוגל עבור ה יותרלעשרים שנים, במיוחד בקרב ביולוגי התפתחותיים עכבר 16,20,22-25. &quot;Processus brevis&quot; במקור התייחס לתהליך לרוחב (processus lateralis), שונה מן apophysis והמעוגל. אצל בני אדם, מהלך רוחבי דומת הקרנת חרוטים קלה מהווה את הקו הכללי של התקשרות אל עור התוף, המשתרע manubrium (לא לראות באיור 6B, נוף המדיאלי). בעכברים, בתהליך לרוחב הוא גם השלכה של manubrium בקצה השני אל umbo 48. שהחלקי flaccida של עור התוף הוא מעל המהלך הרוחבי של &quot;פטיש. apophysis והמעוגל אינו ניכר &quot;פטיש האדם.

השלושה ossicles השמיעה של האוזן התיכונה, כלומר &quot;פטיש, incus, ו מִשׁוֶרֶת, יוצרת שרשרת שמיעה יונקת ספציפית המשדר צלילים מן התוף אל האוזן הפנימית, או שבלול 1,2. פונקציה שמיעה ניתן להעריכם עכברים על ידי מדידת בדיקת ABR (ABR) ספי 3-6, ורעידות של &quot;פטיש מאחורי עור התוף ניתן לנטר באמצעות לייזר דופלר Vibrometry (LDV) 7. על ידי שילוב של ABR, LDV, ועיוות מוצרי Otoacoustic הפליטה (DPOAE) מדידות, אובדן שמיעת מוליך יכול להיות מופלה מירידה חושית-8. במודלים של בעלי חיים בתנאי אוזן הנדרשים, בשים לב לחשיבות של שמיעת בריאות מאוזנת לרווחתם של חולים בכל הגילים. לדוגמא, דלקת אוזן תיכונה היא דלקת אוזניים נפוצה מאוד לראות תינוקות אנושיים וילדים, וחמור, דלקת אוזן תיכונה חריפה וסיבוכיה יכולים להתרחש אם קונדיtion אינה מטופלת עם antimicrobials 9 המתאים. מודלי עכבר של דלקת אוזן תיכונה יכולים להיות שימושיים בהבנת המחלה ו בפיתוח טיפולים 10,11. Ossicles Murine, אשר (למעט חלק goniale של &quot;פטיש) נוצרים על ידי התאבנות endochondral 12,13, רלוונטי מאוד בחקר מטבוליזם ומורפוגנזה עצם. ראשית, גודלם הקטן מאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה של עצמות עם periosteum שלם באמצעות רנטגן או פלואורסצנטי מיקרוסקופיה 14. שנית, עצם מטבוליות סוטה, כגון ספיגת עצם מוגזמת או חסרה, או אינטראקציות נפגעות בין תאי עצם 15, ניתן לנתח כתורם פוטנציאלי לשמוע 3,4,7 פסד. Morphogenesis ossicle שלישית, חריגה מדווח בכמה עכברים הגן מחסר, כגון בעלי חיים ללא Hoxa2 16-19, Msx1 20-22, 23 Prrx1, Goosecoid(GSC) 24,25, 13 Bapx1, 26 Tshz1, Dusp6 (Mkp3) 27, שהגולגולת (נוג) 28, 29 Fgfr1, קולטני הורמון בלוטת התריס (Thra, Thrb) 5, Bcl2 30 ואחרים 1,31, או בעכברים overexpressing Hoxa2 32. לבסוף, למרות גודלם הקטן, מבנים הקשורים ossicles כגון שרירים ומפרקים 33 34,35 נגישים. ossicles העכבר הם קטנים יותר מאשר ossicles אדם, אך ראוי לציין כי אוזן העכבר האמצעית אינה גרסה מיניאטורית של מקבילו האנושי שלה. לדוגמא, בעכברים, עורק stapedial, אשר עובר דרך הטבעת של מִשׁוֶרֶת, נמשך לאורך כל חיים 36, ואילו אצל בני אדם, עורק stapedial העוברי נעלם במהלך הריון. בנוסף, את המורפולוגיה של &quot;פטיש העכבר שונה מזו של הדואר עצמות אדם (ראה איור 6). בעכברים, הבולה השמיעתית (תוף) המקיפה את חלל האוזן התיכון מלא האוויר, ואילו בבני אדם, תאי אוויר פטמו מורכב עצם trabecular בתוך עצם הטמפורלית בתי ossicles ולא בולה 37. בשני המינים, הקפסולה השמיעה (קפסולה otic, מבוך גרמי) סוגרת שבלול ותעלות חצי עגולות של האוזן הפנימית. ביולוגיה השוואתית האבולוציונית של האוזן התיכונה נבדקה בהרחבה 38-40. פרוטוקול להלן הראשון מתאר כיצד לנתח את הבולה ואת הקפסולה השמיעה, אשר מורכב בעיקר של האוזן התיכונה והאוזן הפנימית, בהתאמה. פרוטוקול זה גם מדגים כיצד לבודד את &quot;פטיש, incus ו מִשׁוֶרֶת מן בולה השמיעה. לבסוף, הוא מראה כיצד לכוון את הבולה השמיעתית הקפסולה להטבעה כהכנת חתך רקמות של ossicles שמיעה.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Tools/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paper towel</td><td>Daio Paper Corporation</td><td>703347</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Glass Jar</td><td>Various</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>14 cm surgical scissors</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>91400-14</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Extra fine scissors-straight</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>14084-08</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fine Forceps Angled 45&lt;b&gt;&amp;deg;&lt;/b&gt;</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>11063-07</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>for routine dissection</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>for movies&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Injection needle 27 G</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>Syringe (1 mL)</td><td>TERUMO</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Marking Pin</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator RT-50</td><td>TAITEC</td><td>0000165-000</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/</td></tr><tr><td>TC-65 Tungsten blade</td><td>Leica</td><td>14021626379</td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Stainless containers</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Cryofilm type IIC</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Silane coated slide (New Silane II)</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>511617</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Matsunami</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Tissue processor</td><td>Sakura Finetek</td><td>VIP-5</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Tissue Embedding Console System</td><td>Sakura Finetek</td><td>Tissue-Tek TEC 5&amp;nbsp;</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sliding microtome for paraffin</td><td>Yamato Kohki Industrial</td><td>REM-710</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Path Blade+pro for hard tissue</td><td>Matsunami</td><td>PB3503C</td><td>for paraffin section</td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>RIGAKU</td><td>R_mCT2</td><td>http://www.rigaku.com/en</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Maruishi pharmaceutical Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>wako</td><td>191-01665</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>wako</td><td>285-14</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 12H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>wako</td><td>196-02835</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>wako</td><td>287-21</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA, EM Grade)</td><td>TAAB</td><td>P001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-2Na</td><td>wako</td><td>15111-45</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Super Cryoembedding Medium</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Dry Ice</td><td>Various</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>wako</td><td>080-03423</td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Super Cryomouting Medium type R2</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sakura Finetek</td><td>781001A0107</td><td></td></tr><tr><td>Histo-Clear</td><td>NDS</td><td>HS-200</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>DOJINDO</td><td>340-00433</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin&amp;nbsp;</td><td>wako</td><td>131-09665</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>wako</td><td>051-06515</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection of the auditory bulla in postnatal mice: isolation of the middle ear bones and histological analysis

ברוב היונקים, ossicles השמיעה באוזן התיכונה, כולל &quot;פטיש, incus ו מִשׁוֶרֶת, הם העצמות הקטנות ביותר. בעכברים, מבנה גרמי שנקרא בולת שמיעת בתי ossicles, ואילו הקפסולה השמיעה המקיפה את האוזן הפנימית, כלומר השבלול ותעלות בצורת חצי עיגול. ossicles Murine חיוניים לדיון ובכך עניין רב החוקרים בתחום אף אוזן גרון, אבל חילוף החומרים, פיתוח, וההתפתחות שלהם רלוונטיות מאוד בתחומים אחרים. מטבוליזם העצם שינה יכול להשפיע על תפקוד שמיעה בעכברים בוגרים, ועכברי גן מחסר שונים להראות שינויי morphogenesis של ossicles שמיעה ברחם. למרות ossicles שמיעה בעכברים הם זעירים, המניפולציה שלהם אינה ריאלית אם אחד מבין אורינטציה אנטומיים שלהם ומבנה 3D. כאן אנו מתארים כיצד לנתח את הבולה השמיעתית הקפסולה של עכברים לאחר לידה ולאחר מכן לבודד ossicles פרט על ידי הסרת חלק הבולה. אנו גם לדון כיצד emבולה ואת הקפסולה המיטה נטיות שונות כדי ליצור פרפין או חלקים קפואים מתאים להכנת סעיפים אורכים, אופקיים, או חזיתיים של &quot;פטיש. לבסוף, אנו למנות הבדלים אנטומיים בין עכבר ossicles שמיעה האנושי. שיטות אלו תהיינה שימושיות בניתוח היבטים פתולוגיים, התפתחותיים האבולוציונית של ossicles שמיעתי באוזן התיכונה בעכברים.

פרוטוקול זה מציג שיטה לבודדת ossicles מן בולת שמיעת עכבר. ראשית, בולה ואת הקפסולה הם גזורים החוצה כמקשה אחת מהגולגולת (איור 1). הבולה גזור לאחר מכן נעשה שימוש כדי להכין את &quot;פטיש (איור 2) ואת incus ו מִשׁוֶרֶת (איור 3). ציוני דרך של הבולה ואת הקפסולה השמיעה הם תהליך דְמוּי חֶרֶט בקצה הקדמי של בולה, הרכס הגבי, תעלה חצי עגול הקדמי, ואת fossa subarcuate (איור 1F). הדמיה טומוגרפיה Microcomputed (CT) מגלה ossicles ב הבולה השמיעה וכן אוריינטציות אופטימלי עבור חתך האורך האופקי של ossicles אלה (איור 4). עבור חתך פרפין האורך של &quot;פטיש, הבולה ואת הקפסולה היו decalcified ב EDTA על 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע, מוטבע paבלוק raffin בבית אוריינטציה שמוצג באיור 4 א &#39;- ג&#39;, מחולק ב 4 מיקרומטר, ולאחר מכן מוכתמים באמצעות H &amp; E. &quot;פטיש המצורפת עור התוף של בולה השמיעה חשף התאבנות endochondral מתמשך לעבר P14 (איור 5 א). כדי להמחיש היווצרות העצם החדש, calcein (30 מיקרוגרם / g משקל גוף) שהוזרק peritoneally לעכבר P20, ו הבולה ואת הקפסולה בודדו 24 שעות מאוחר יותר ב p21. המדגם ללא decalcification ננעץ קפוא ואז cryosectioned ב -6 מיקרומטר באמצעות סרט הדבקה על בסיס שיטת קאוואמוטו 43. לאחר מכתים הגרעיני עם DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole), בסעיף נצפה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אותות calcein (ירוק) חשפו היווצרות עצם חדשה &quot;פטיש (מ &#39;), בולה ואת הקפסולה (איור 5). עבור חתך אופקי של &quot;פטיש, הבולה השמיעתית מבודד עכבר 5 שבועות בן ננעצה קפוא ללא decalcification (עבורהנטייה לראות איור 4D - F), cryosectioned ב -6 מיקרומטר בשיטת קאוואמוטו, ומוכתמת באמצעות H &amp; E. חתך אופקי של brevis malleal processus (MPB) גם מראה שבלול (איור 5 ג). מבט המדיאלי של ossicles התקין השמיעה מבודדת עכבר P31 תערוכות מאפיינים טיפוסיים של העכבר &quot;פטיש, כלומר, &quot;דאייה מעל שחף-כנף כמו&quot; (או 45 דמוית חרב פרסי) manubrium, brevis processus בולט (apophysis ומעוגל ראו דיון), ואת lamina משוכל (איור 6). ראוי לציין, כי התהליך הקדמי (processus הקדמי) היה שבורת ההליך לנתיחה ברחבי goniale והופרד מזירת התוף (ectotympanic). מדגם מייצג זו המוצגים מפרק שלם incudomalleolar בין &quot;פטיש ו incus, ואילו המפרק incudostapedial הוסטה ממקומה. הוספות Tendinous לתוך malleal ותהליכים שרירי stapedial ניתנים לזיהוי (איור 6 א, כוכביות). איור 6 השווה עכבר ossicles שמיעה אנושי באותו ההגדלה. הבדלי מינים, מלבד גודל, כוללים את הבאים. Manubrium malleal הוא אגף דמוי בעכברים אבל במועדון כמו אצל בני אדם. הזווית בין ציר אנטומיים (או ציר הסיבוב, הקו בתהליך הקדמי של &quot;פטיש ואת התהליך הקצר של incus) ואת manubrium היא הרבה יותר קטנה בעכברים ושתיים כמעט במקביל, בניגוד כמעט בניצב בבני אדם 6,46-48. בשנת ossicles האדם, מחקרים vibrometric לחשוף כי המפרק incudo-malleolar הוא נייד ולא 49 קבוע מבחינה תפקודית. העכבר &quot;פטיש מפגין lamina משוכל רחב, רזה, שטוחה לא תמיד ניתן להבחין בבני אדם 47. בעכברים, הקדמי processus נתיכים לעצמות קרומיות, כלומר goniale ואת tympaniג טבעת, בעוד בני האדם הקדמי processus מצטמצם spicule קטן של העצם 41. מִשׁוֶרֶת של עכברים ובני אדם גם שונה: אצל עכברים, היחידות להחלפה עצמית הקדמיות מתעקמת היחידות להחלפה עצמית האחוריות היא יותר ישר ואילו אצל בני אדם, היחידות להחלפה עצמית הקדמיות היא יותר ישר מאשר היחידות להחלפה עצמית האחורית. ראוי לציין כי ביחס ראש &quot;פטיש לגודל גוף מוגדל מסיבי מינים כגון שומת הזהב, הוכחה שונה משמעותית ביחסי allometric של &quot;הקטנות&quot; עצמות 48. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig1.jpg" /> באיור 1. Dissection של השמיעתי הבולה ו כמוס. (א) הגולגולת של עכבר P31 מחולק על ימין ועל שמאל חצי. A, קדמי; P, אחוריים; L, עזב; R, נכון. (ב) משטח המדיאלי של החצי הימני של הראש נחצה, עור. Cx, קליפת המוח; Cb, המוח הקטן; Bs, brainstem. D, הגבה; V, גחון. (ג) הסרת המוח עם מלקחיים. (ד) צפה המדיאלי של הקפסולה השמיעה בגולגולת התקינה. הציצה הגבה (ראשי החץ) שוכנת בין fossa גולגולתי באמצע (MCF) ו גומץ גולגולתי האחורי (PCF) ומפרידה dorso-קדמי ומשטחי ventro-האחורי של הקפסולה השמיעה. סרגל קנה מידה, 2 מ&quot;מ. (E) גדלה גבוהה של בולה שמיעתית כמוסה (תצוגת המדיאלי). Co, שבלול; VII, עצב הפנים; VIII, vestibulocochlear עצב; AC, קדמי (מעולה) תעלה חצי עגול; SF, גומץ subarcuate, שבו שוכן paraflocculus והמוח הקטן. סרגל קנה מידה, 1 מ&quot;מ. (F) מיקרוסקופ של בולה ואת הקפסולה שמיעה מבודדת (תצוגת המדיאלי). Sp, תהליך דְמוּי חֶרֶט. סרגל קנה מידה, 1 מ&quot;מ. (A - E), עכבר P31. (F), עכבר P33. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig2.jpg" /> איור 2. Dissection של &quot;פטיש. (א) להציג ventrolateral של בולה ואת הקפסולה שמיעה תקינה. מענית tympanicus (ST, חץ מקווקו) הוא האתר המצורף של עור התוף. לרוחב העצם אל ST הוא חלק האוזן החיצונית, ואת המדיאלי עצם אל ST מהווה את הרצפה של חלל האוזן התיכונה. A, קדמי; P, אחוריים; D, הגבה; V, גחון. (ב) הצג לאחר הסרת תעלת השמע החיצונית כדי לחשוף את עור התוף (TM) כולל pars flaccida (PF) ו pars Tensa (Pt). הסרה (C) של חלקים מעצם התוף (קווים מקווקווים ו #) ליד malleal processus brevis (MPB). מ &#39;, &quot;פטיש; מ&quot;מ, manubrium malleal. חץ, בועת אוויר בתוך חלל האוזן התיכונה לראות דרך עור התוף. (ד) החשוף &quot;פטיש. ראש &quot;פטיש מותווה. מְנוּקָדקו מציין את השטח במפרק של incus. (E) גיד של שריר tympani המותח (TT) מצורף &quot;פטיש. (ו) tympani מותח נמשך כאשר &quot;פטיש יוסר. *, תהליך שרירים. (G) tympani טנסור נחתך באמצעות מחט. (H) שלושה ossicles השמיעה לאחר הסרת עור התוף. מפרק incudo-malleolar הוסט ממקומה. מ &#39;, &quot;פטיש; אני, incus; ים, מִשׁוֶרֶת; לך, goniale (התמזג טבעת &quot;פטיש ואת התוף, TR). כל ברי הסולם, 0.5 מ&quot;מ. (A, H), עכבר P33. (B - G), עכבר P31. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig3.jpg" /> איור 3. Dissection של Incus ו מִשׁוֶרֶת. (א) Incus ומִשׁוֶרֶת לאחר הסרת &quot;פטיש. העורק stapedial (SA) עובר דרך מִשׁוֶרֶת (ים). קו מקווקו מציין את פני השטח במפרק של incus. ראוי לציין, כי היחידות להחלפה עצמית הקצרות (ICB, יחידות להחלפה עצמית ברווה) של incus (i) נקבעה על ידי הרצועה האחורית (לא מוצג). אסטריסק, תהליך של שרירי מִשׁוֶרֶת. (ב) מִשׁוֶרֶת לאחר הסרת incus. קצה המחט משמש לחתוך את העורק stapedial (SA). חץ, כיוון זרימת דם. קו מקווקו מציין משטח במפרק של מִשׁוֶרֶת. (ג) העורק stapedial יוסר מִשׁוֶרֶת. X מציין את הקצוות של העורק stapedial (SA). (ד) החלון הסגלגל (ני, ovalis fenestra או vestibuli fenestra) גלוי לאחר הסרת מִשׁוֶרֶת. RW, חלון עגול (רוטונדה fenestra או cochleae fenestra). ברי סולם, 0.5 מ&quot;מ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זה</a>דמות. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig4.jpg" /> איור 4. המכוון את השמיעה הבולה ו Capsule במהלך Embedding עבור אורכית (parasagittal, A - C) אופקי (D - E) חתך של &quot;פטיש. (א - ג) lamina הצוואר והרוחבי של &quot;פטיש ממוקם במקביל לחלק התחתון של הטבעת צלחת. (א) להציג צד: image מיקרו-CT להראות הטבעה של &quot;פטיש ממש הבולה (pseudocolored כחול). &quot;פטיש ו incus הם pseudocolored ירוק. קו מקווקו, מטוס החיתוך הרצוי. קו מוצק, בתחתית הטבעת צלחת. מ &#39;, &quot;פטיש; ראשי חץ, ציצה הגבה. M, המדיאלי; L, לרוחב; D, הגבה; V, גחון. (ב) לאור למעלה: תמונה מיקרו-CT. ראוי לציין, כי הקצה הקדמי של בולה (תהליך דְמוּי חֶרֶט) הוסר. אני, incus. (ג) צפה למעלה: מיקרוסקופ (שצולמו עםמסנן צבע). AC, קדמי (מעולה) תעלה חצי עגול; SF, גומץ subarcuate; Sp, תהליך דְמוּי חֶרֶט. A, קדמי; P, אחוריים; D, הגבה; V, גחון. (D - ו) processus brevis של &quot;פטיש מושם בניצב לתחתית הטבעת צלחת. (ד) מבט צד: image מיקרו-CT להראות הטבעה של &quot;פטיש תקין. קו מקווקו, מטוס החיתוך הרצוי. קו מוצק, בתחתית הטבעת צלחת. (ה) לאור למעלה: תמונה מיקרו-CT. מ&quot;מ, manubrium malleal. (F) מבט עילי: מיקרוסקופ (נלקח עם מסנן צבע). ברי סולם, 1 מ&quot;מ. תמונות מיקרו-CT התקבלו ברזולוציה voxel של 5 מיקרומטר, כפי שתואר לעיל 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig5.jpg" /> Figure 5. היסטולוגיה. (א) H &amp; E מכתים. סעיף אורך (parasagittal) של &quot;פטיש ימנית מוטבע פרפין (מ &#39;) בולה השמיעה (הקו המקווקו) ב P14. TM, עור התוף. (ב) תיוג עצם Calcein. חתך לאורך של &quot;פטיש שמאל הקפוא, undecalcified (מ &#39;) הבולה השמיעתית ב p21. Counterstain, DAPI. (ג) H &amp; E מכתים. סעיף אופקי של קפוא, undecalcified עזב brevis processus malleal (MPB) ב בולה ואת הקפסולה השמיעה (עכבר 5 שבועות בן). Co, שבלול. ברי סולם, 1 מ&quot;מ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig6.jpg" /> איור 6. המדיאלי צפו של השמיעתית ossicles. (א) ossicles שמיעת זכות P31 עכבר. A, קדמי; P, אחוריים; D, הגבה; V, גחון. סרגל קנה מידה, 1 מ&quot;מ. ראש &quot;פטיש (בנות mallei, Capitulum mallei); הצוואר (Collum mallei); lamina (lamina משוכל); מ&quot;מ (manubrium mallei); כוכבי שחור (תהליך השרירי של &quot;פטיש); MPA (Processus הקדמי, Processus gracilis); MPB (brevis processus); גוף incus (קורפוס incudis); ICB (ברווה Crus, יחידות להחלפה עצמית קצרה, תהליך קצר); כיל (longum Crus, יחידות להחלפה עצמית ארוכות, תהליך ארוך); IPL (lenticularis Processus, תהליך עדשה, Sylvian apophysis); ראש מִשׁוֶרֶת (בנות stapedis); כוכבית לבנה (תהליך של שרירי מִשׁוֶרֶת); SCA (anterius Crus, יחידות להחלפה עצמית קדמיות); SCP (CRU posterius, יחידות להחלפה עצמית אחורית); הבסיס (stapedis בסיס, אדן); SOF (foramen אטם, foramen הירכיים). (ב) ossicles השמיעה הימני של הנקבה האנושית בן 76 שנים (באדיבות המחלקה לאנטומיה, אוניברסיטת Keio לרפואה). Ossicles של העכבר P31 (בפינה הימנית התחתונה) הם צילמו באותו ההגדלה לזה המשמש ossicles האדם. הכמתמ&quot;כחצי ed לציין את הזווית בין ציר אנטומיים ואת manubrium (קווים מקווקווים). סרגל קנה מידה, 2 מ&quot;מ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis at JoVE.com

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

דיסקציה של בולה השמיעה של עכברים אחרי לידה: בידוד של עצמות באוזן התיכונה ניתוח היסטולוגית

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

dissection-auditory-bulla-postnatal-mice-isolation-middle-ear-bones

Research

JoVE Journal

Biology

29.9K Views.  Keio University School of Medicine. We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis. 

Video: Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

פרוטוקול עבור Decellularizing Cochleae העכבר עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Bioengineering

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Neuroscience

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

גישת העכבר עגול החלון לototoxic סוכן משלוח: מהיר וטכניקה אמינה גרימת ניוון תא שבלול

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

Medicine

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

הערכת פנוטיפים מישורים-Cell-קוטביות ב Ciliopathy עכבר Mutant שבלול

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is to provide a straightforward and standardized method for inner ear tissue processing for researchers, possibly new to the field, interested in working with the mouse cochlea. Included here are protocols for dissection, fixation, embedding, cryosectioning, and immunostaining. Section immunostaining is one of the best methods for examining individual cells within the context of the entire cochlea.
Key steps include dissecting the inner ear away from the skull, fixing the tissue using 4% paraformaldehyde, embedding with Optimal Cutting Temperature compound, cryosectioning, and immunostaining with antibodies targeting specific proteins expressed by the cochlea.
Included in our methods are special considerations made for the cochlea given its 
shape and structure.&#160;Reasonably good focus and dissection skills are needed, as tissue damage can affect the quality of immunostaining and consistency among samples. However, with the procedures we outline, most users can be trained in a few weeks to make beautiful preparations. Overall, this protocol offers a valuable way to promote research to understand auditory development, function, and disease in mouse models.

This protocol, intended for novice users of mouse inner ear tissue, comprehensively details steps for processing mouse inner ears at different developmental stages for section immunostaining.

הקפאה וצביעה חיסונית של רקמת האוזן הפנימית של עכבר: משלב עוברי לשלב בוגר

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Developmental Biology

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

ניתוח שתל שבלולי והקלטות תגובה חשמלית עורר גזע המוח בעכברים C57BL/6

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. The first procedure consists of perforation of the tympanic bulla, termed bullostomy; the second one is a transtympanic injection. Both emulate human clinical intratympanic procedures.
Chitosan-glycerophosphate (CGP) and Ringer&#180;s Lactate buffer (RL) were used as biocompatible vehicles for local drug delivery. CGP is a nontoxic biodegradable polymer widely used in pharmaceutical applications. It is a viscous liquid at RT&#160;but it congeals to a semi solid phase at body temperature. RL is an isotonic solution used for intravenous administrations in humans. A small volume of this vehicle is precisely placed on the Round Window (RW) niche by means of a bullostomy. A transtympanic injection fills the middle ear and allows less control but broader access to the inner ear.
The safety profiles of both techniques were studied and compared by using functional and morphological tests. Hearing was evaluated by registering the Auditory Brainstem Response (ABR) before and several times after microsurgery. The cytoarchitecture and preservation level of cochlear structures were studied by conventional histological techniques in paraformaldehyde-fixed and decalcified cochlear samples. In parallel, unfixed cochlear samples were taken and immediately frozen to analyze gene expression profiles of inflammatory markers by quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR).
Both procedures are suitable as drug delivery methods into the mouse middle ear, although transtympanic injection proved to be less invasive compared to bullostomy.

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Two microsurgery approaches for local drug delivery to the inner ear are described here and compared in terms of impact on hearing parameters, cochlear cytoarchitecture and expression of inflammatory markers.

מחקר השוואתי של שיטות שיגור תרופות אל האוזן הפנימית עכבר: Bullostomy<em&gt; Versus</em&gt; הזרקת Transtympanic

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. ...

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>נתיחת השק האנדולימפטי מעכברים

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

נתיחת השק האנדולימפטי מעכברים

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...

דיסקציה של בולה השמיעה של עכברים אחרי לידה: בידוד של עצמות באוזן התיכונה ניתוח היסטולוגית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

פרוטוקול עבור Decellularizing Cochleae העכבר עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

גישת העכבר עגול החלון לototoxic סוכן משלוח: מהיר וטכניקה אמינה גרימת ניוון תא שבלול

הערכת פנוטיפים מישורים-Cell-קוטביות ב Ciliopathy עכבר Mutant שבלול

הקפאה וצביעה חיסונית של רקמת האוזן הפנימית של עכבר: משלב עוברי לשלב בוגר

ניתוח שתל שבלולי והקלטות תגובה חשמלית עורר גזע המוח בעכברים C57BL/6

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

מחקר השוואתי של שיטות שיגור תרופות אל האוזן הפנימית עכבר: Bullostomy

נתיחת השק האנדולימפטי מעכברים

נתיחת השק האנדולימפטי מעכברים