אנו מודים למתקן אוניברסיטת אוהיו המקיף סרטן מרכז אנליטי Cytometry Core, במיוחד קתרינה מור, לקבלת סיוע טכני עם ניתוח FACS. בנוסף אנו מכירים ד&quot;ר ויליאם פו וקבוצתו לתובנה המדעיות שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי NIH HL091878 (JL) ומרכז הלב בבית החולים לילדים בפריסה ארצית.

.1 הכנת הציוד ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הכלים לנתיחה - מספריים רקמה עדינים כדי לחלץ את לב מבוגר ו2 מלקחיים עדינים לנתיחה באזור מסתמית - ידי מעוקר במגש כלי מכוסה. תרסיס כלים עם 70% אתנול (EtOH) לפני לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל הפתרונות באופן מיידי לפני הניסוי ולעקר פתרונות על ידי עובר אותם דרך מסנן 0.2 מיקרומטר סטרילי. שמור פתרונות על קרח עד לשימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטרילי דיסוציאציה חוצץ (15 מ&quot;ל בסך הכל / מדגם). לשלב 1.2 מ&quot;ל IV collagenase, 300 טריפסין μl 2.5% ו150 סרום חומוס μl. תביא נפח עד 15 מ&quot;ל עם תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטרילי מיון חוצץ (12 מ&quot;ל בסך הכל). לשלב 25 μl 0.5 חומצת M ethylenediaminetetraacetic (EDTA) וDNase μl 12 אני (RNase חינם). תביא נפח עד 12 מ&quot;ל עם HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> VEC תרבות מדיה. Gro אנדותל Mixwth תקשורת על פי הוראות היצרן (ראה גיליון אלקטרוני חומר) על ידי הוספת רכיבי aliquoted מהערכה ל500 מ&quot;ל של תקשורת EBM2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלילית תרבות מדיה GFP (תקשורת מסוג תאים לא אנדותל). מערבבים 445 מ&quot;ל של מדיום 199 1x עם 5 מ&quot;ל של פניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס) (1% ריכוז סופי) ו50 FBS מ&quot;ל (10% ריכוז סופי). </li></ol></li></ol> .2 Dissection של האזור מסתמית מעכברים בוגרים וE14.5 עובר <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נהלי כל החיה אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות בית החולים למחקר מכון IACUC הילדים הארצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברי Tie2-GFP נרכשו מג&#39;קסון מעבדות (מספר מניות 003,658) 14 ונשמרו כגנוטיפים הומוזיגוטים על רקע FVB / N, ולכן להבטיח כי כל GFP המפורש מחוץ האביב בתאי האנדותל Tie2 חיובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיון FACS, להכין samp השלילי גיל מתאים אחדle שאינו מכיל GFP כגון C57 / BL6 לפרמטרים שנקבע שער GFP למיון FACS. הערה: פרוטוקול זה ותוצאות נציג מבוססים על שימוש בשלושה, עכברים בוגרים ארבעה בן חודש או המלטה אחת ביום עוברי (E) 14.5. </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים בוגרים: הקרבה על ידי CO 2 אנוקסיה מייד לאחר, להשתמש במספריים לנתיחה כדי לפתוח בעדינות את חלל החזה ולחשוף את הלב וריאות. ברגע שנחשף, אחיזת הלב עם מלקחיים בעורקים הגדולים ולהתרחק מהגוף. הסרה של רקמת ריאה, אם בשלמותה, ואת לבם מקום בHBSS הקר כדי לשטוף. הסר את החדר ולהתרחק אטריה עוזב &#39;הזירה&#39; התעלה בין העליות וחדרים ואזורי אב העורקים ללא פגע. לעשות חתך אחד למטה בצד של תעלה בין עליות וחדרים כדי לפתוח את &#39;הזירה&#39; ולחשוף את המבנים מסתמית. הסר את שריר הלב ואזורי אב העורקים הפרוקסימלי בעדינות על ידי מתגרה משם עם מלקחיים. זהה את עלוני שסתום כמו רקמה לבנה, צפופה מעל שריר הלב הוורוד. בעדינות DETACH tendinae chordae מהשסתומים בין העליות וחדרים ולהסיר כמה שיותר שריר הלב שנותר ככל האפשר. היה זהיר שלא למשוך או לגרד את עלוני שסתום במהלך תהליך זה מאז VECs ניתן וחילצה. הנח אזורים מסתמית גזוזות בצינור 1.5 Eppendorf מ&quot;ל המכיל 1 מ&quot;ל HBSS ולשמור על קרח. הערה: לנתיחה זהירה היא קריטית לחיסול תאי האנדותל אינו מסתמית שיכול לזהם את הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים: קורבן נקבות עכברים 14.0 ימים לאחר תקע ההזדווגות הוא ציין (בבוקר של תקע הזדווגות = 0.5 ימים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר הקרבה, לנתח את הרחם (המכיל עובר) ולשטוף בHBSS הקר. לנתח את עוברים בודדים מהרחם ולהסיר את שק החלמון העוברי המקיף את כל עובר. הסר את הלבבות מכל אחד מהעוברים ובצעו את שלב 2.1. (הערה: לוחץ בעדינות את העובר עם מלקחיים ממש מתחת לאיברים העליונים אמורים לעזור כדי לחשוף את הלב ולעשות הסרה קלה יותר.) </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. דיסוציאציה תא והכנה לFACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת הטיפים פיפטה סטרילית, להסיר HBSS מצינור Eppendorf המכיל את האזורים מסתמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף עם חיץ ניתוק 1 מ&quot;ל ואני DNase 4 μl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הצינורות ב37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה מעלה ומטה 3 פעמים ואז לתת לי המדגם להסתפק 15 שניות. לאסוף את supernatant (המכיל את התאים ניתק) לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעצור את תגובת collagenase, להוסיף 125 μl של סרום סוס לצינור האיסוף. שמור צינור איסוף על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרו על שלבי ניתוק (3.2-3.5) תשע פעמים כדי לאסוף תשעה שברים של supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את אוסף fractioned דרך מסנן ניילון 70 מיקרומטר לתוך צינור איסוף חדש כדי להבטיח השעיה תא בודדת על ידי הסרת כל פסולת וגושים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ההשעיה ב400 גרם במשך 5 דקות עד גלולה התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 1 מ&quot;ל מיון הצפת ולשמור על קרח עד FACS. </li></ol> .4 FACS מיון VECs GFP החיובי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע שערים לקדימה ופיזור בצד להוציא פסולת וללכוד תאים בודדים; לא לכלול כפילויות באמצעות gating אפליית כפיל. רשום את מדגם ביקורת השלילי ולהגדיר הגדרות שער כדי להשוות ולהגדיר במדויק את אוכלוסיית תאי GFP החיובי במדגם Tie2-GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח תאי GFP חיוביים באמצעות FACS ולחדד את הגדרות שער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין המדגם וTie2-GFP לאסוף שני תאי GFP החיובי וGFP-שלילי. אם תאים ישמשו להפקת RNA, סוג ישירות למאגר המיון. לתאי תרבות אחרי FACS, לאסוף תאי GFP חיוביים בצינור סטרילי המכיל 1 מ&quot;ל תקשורת VEC עם 1 FBS מ&quot;ל, ולאסוף תאים שליליים GFP ב 1 מ&quot;ל של תקשורת הלא אנדותל עם FBS 1 מ&quot;ל. השתמש 50% שילוב סרום מדיה / 50% זה כדי לשפר את כדאיות תא. שמור על קרח עד לניתוח שלאחר FACS. </li></ol> .5 ההודעה FACS Analysiשל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת RNA: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר FACS, תאים חיוביים ושליליים GFP צנטריפוגות ב 1,500 XG במשך 8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה בזהירות את supernatant (חיץ מיון) וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה (גלולה אינה גלויה לגודל המדגם המומלץ כאן) ב200 μl Trizol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס או להתחיל מיצוי פנול, כלורופורם סטנדרטי לבודד mRNA כולל, כפי שתואר בעבר על ידי המעבדה שלנו 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 50-200 ng של רנ&quot;א לסינתזת cDNA באמצעות Mastermix על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cDNA בכפוף להגברת PCR כמותי באמצעות בדיקות IDT Primetime qPCR נגד סמני תא האנדותל עכבר (CD31, פון Willebrand פקטור (vWF)), סמני תא ביניים שסתום (אקטין שריר α-חלק (α-SMA), Periostin (Postn)), myocyte סמנים (Mhc6, Mhc7) וGAPDH. </li></ol&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Culturing Murine VEC: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מיון FACS וגביית תא (שלב 4.3), תאי צנטריפוגות ב XG 300 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות פיפטה את supernatant (מיון החיץ + מדיה) וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה GFP חיובי התא ב1 מ&quot;ל של תקשורת VEC וגלולה GFP-שלילי ב 1 מ&quot;ל תקשורת הלא אנדותל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת מדגם זה ובאחד משקופיות קאמריות פלסטיק ולגדול עד מחוברות. תרבות כ 1 שבוע לתאים שליליים GFP להפוך מחוברות ויותר מ -2 שבועות לתאי GFP חיוביים להפוך מחוברות (ממדגם של 3, עכברים בוגרים). שינוי בתקשורת בכל יומיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים Immunofluorescent: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מהתאים ולתקן paraformaldehyde 4% (PFA) ל30 דקות ב RT. שטוף תאים קבועים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד בפתרון בופר פוספט (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בארות קאמריות משקופיות ולחסום ב5% בסרום שור אלבומין / 1x PBS עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירהשקופיות O / N ב 4 ° C. עם נוגדנים ראשוניים (CD31, 1: 1,000 או אקטין α-שריר החלק (α-SMA), 1: 100). לשטוף 3x עבור 5 דקות בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנוגדנים משני (Alexa פלואוריד 568 עז אנטי העכברוש) 1: 400 בPBS, להוסיף לשקופיות, ודגירת שעה 1 בRT. שקופיות לשטוף 3x עבור 5 דקות בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההר בVectashield המכיל DAPI דגירה שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס לפני הצפייה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Tao, G., Kotick, J. D., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+development,+maintenance,+and+disease:+the+role+of+endothelial+cells.">Heart valve development, maintenance, and disease: the role of endothelial cells.</a> Current topics in developmental biology. 100, 203-232 (2012).</li><li>Lincoln, J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+developmental+mechanisms+of+congenital+heart+valve+disease.+Birth+defects+research.">Molecular and developmental mechanisms of congenital heart valve disease. Birth defects research.</a> Part A, Clinical and molecular teratology. 91, 526-534 (2011).</li><li>Tao, G., Levay, A. K., Gridley, T., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mmp15+is+a+direct+target+of+Snai1+during+endothelial+to+mesenchymal+transformation+and+endocardial+cushion+development.">Mmp15 is a direct target of Snai1 during endothelial to mesenchymal transformation and endocardial cushion development.</a> Developmental biology. 359, 209-221 (2011).</li><li>Weinberg, E. J., Mack, P. J., Schoen, F. J., Garcia-Cardena, G., Kaazempur Mofrad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+environments+from+opposing+sides+of+human+aortic+valve+leaflets+evoke+distinct+endothelial+phenotypes+in+vitro.">Hemodynamic environments from opposing sides of human aortic valve leaflets evoke distinct endothelial phenotypes in vitro.</a> Cardiovasc Eng. 10, 5-11 (2010).</li><li>Hinton, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+and+organization+in+developing+and+diseased+aortic+valves.">Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves.</a> Circulation research. 98, 1431-1438 (2006).</li><li>Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+and+cellular+response+feedback+in+calcific+aortic+valve+disease.">Hemodynamic and cellular response feedback in calcific aortic valve disease.</a> Circulation research. 113, 186-197 (2013).</li><li>Bosse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+nitric+oxide+signaling+regulates+Notch1+in+aortic+valve+disease.">Endothelial nitric oxide signaling regulates Notch1 in aortic valve disease.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. 60, 27-35 (2013).</li><li>Laforest, B., Andelfinger, G., Nemer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Gata5+in+mice+leads+to+bicuspid+aortic+valve.">Loss of Gata5 in mice leads to bicuspid aortic valve.</a> The Journal of clinical investigation. 121, 2876-2887 (2011).</li><li>Hofmann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+deletion+of+murine+Jag1+leads+to+valve+calcification+and+congenital+heart+defects+associated+with+Alagille+syndrome.">Endothelial deletion of murine Jag1 leads to valve calcification and congenital heart defects associated with Alagille syndrome.</a> Development. 139, 4449-4460 (2012).</li><li>Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. H., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitral+valve+endothelial+cells+with+osteogenic+differentiation+potential.">Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 598-607 (2011).</li><li>Gould, R. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+valvular+endothelial+cells.">Isolation of valvular endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2010).</li><li>Butcher, J. T., Penrod, A. M., Garcia, A. J., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+morphology+and+focal+adhesion+development+of+valvular+endothelial+cells+in+static+and+fluid+flow+environments.">Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 24, 1429-1434 (2004).</li><li>Cheung, W. Y., Young, E. W., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+isolating+and+purifying+porcine+aortic+valve+endothelial+cells.">Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells.</a> The Journal of heart valve disease. 17, 674-681 (2008).</li><li>Motoike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+GFP+reporter+for+the+study+of+vascular+development.">Universal GFP reporter for the study of vascular development.</a> Genesis. 28, 75-81 (2000).</li><li>Peacock, J. D., Lu, Y., Koch, M., Kadler, K. E., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spatial+expression+of+collagens+during+murine+atrioventricular+heart+valve+development+and+maintenance.">Temporal and spatial expression of collagens during murine atrioventricular heart valve development and maintenance.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 3051-3058 (2008).</li><li>Levay, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scleraxis+is+required+for+cell+lineage+differentiation+and+extracellular+matrix+remodeling+during+murine+heart+valve+formation+in+vivo.">Scleraxis is required for cell lineage differentiation and extracellular matrix remodeling during murine heart valve formation in vivo.</a> Circulation research. 103, 948-956 (2008).</li><li>Lincoln, J., Alfieri, C. M., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+and+FGF+regulatory+pathways+control+cell+lineage+diversification+of+heart+valve+precursor+cells.">BMP and FGF regulatory pathways control cell lineage diversification of heart valve precursor cells.</a> Developmental biology. 292, 292-302 (2006).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nfatc1+coordinates+valve+endocardial+cell+lineage+development+required+for+heart+valve+formation.">Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation.</a> Circulation research. 109, 183-192 (2011).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

כאן אנו מתארים בפעם הראשונה, שיטה חדשנית לבידודה של VECs העכברי העוברי ובוגרת מעכברי Tie2-GFP. בעוד קו עכבר זה נעשה שימוש נרחב לבידוד של אוכלוסיות תאי אנדותל, זה הדו&quot;ח הראשון, המראה בידוד סלקטיבי של VECs. בשל שבריריותה של אוכלוסיית VEC, פיתחנו פרוטוקול מחמיר המאפשר בידוד תא בודד של GFP החיובי (ושלילי GFP) תאים מסתמי לב של עוברי עכברים ומבוגרים. בהשוואה לפרסום המקורי לשימוש בעוברים או באיברים שלמים מעכברי Tie2-GFP 14, יש לנו מותאם צעדי collagenase ונתיחה מבוססים על השפע הנמוך של אוכלוסיית תאי אנדותל השבירה הזה כדי לבודד אוכלוסייה נבחרת של תאים. בידודי VEC בעבר כבר דיווחו רק במודלים של בעלי חיים גדולים עם כלים גנטיים וbiomolecular מוגבלים. כלים אלה מבוססים היטב בעכברים, ולכן, ABIlity לבודד VECs העכברי מאפשר לקבוצה מורחבת של עיצובים ניסיוניים שישמשו לשסתום לב מחקר. לכן, יתרון משמעותי של גישה זו הוא כי ניתן לבודד VECs temporally מעכברים פראיים סוג, ומודלים של מחלת שסתום ופציעה. יתרון שני הוא שיכול להיות מבודד VECs ונותח כמעט מייד לאחר נתיחה, שימור דפוסי ביטוי שמשקפים את מצב in vivo בצורה מדויקת יותר. יתר על כן, פרוטוקול הבידוד די בכך כדי לחסל תרבית תאים להרחבת מספר ושינויי פנוטיפי לכן פוטנציאל הנגרמים על ידי הסביבה במבחנה מנועים. למרות החידושים והטבות ניסיוניות של פרוטוקול זה, אנחנו מכירים בכך שמגבלות עדיין קיימות. ראשית, גודלה של אוכלוסיית VEC בתוך שסתומים עכבריים הוא מאוד קטן, ולכן, יש צורך בהמלטות עוברית מתוזמן מרובים על מנת ליצור RNA מספיק לניתוח ביטוי גנים. בעוד thiים ניתן להתגבר באמצעות מגדלים מרובים, עשוי להיות לכך השפעה על היישום של כמה כלי ניתוח שלאחר בידוד. מגבלה זו כבר אתגר במיוחד להקמת תרבויות ומחוברות של VECs GFP החיובי על מנת לבצע יותר ניתוחים מעמיקים של פנוטיפים VEC כוללים פרופילים מולקולריים ומבחנים פונקציונליים. לכן אנו מכירים בכך שלא כל הקשיים היו להתגבר על ידי הגישה שלנו, אבל זה שטח של עניין שאנו שואפים להתגבר. גישה זו של בידוד VECs מאזורים מסתמית מציגה את האפשרות של זיהום מתאי העניבה-GFP -positive, שאינם מסתמית האנדותל של endocardium, או מבנים של כלי דם בתוך שריר הלב של החדר. נכון להיום, הבחנה מולקולרית של VECs מאוכלוסיות תאים אחרות לב אנדותל לא זוהתה. עם זאת אזור משפר של גן Nfatc1 זוהה ומוצג לתייג במיוחד VECs שלאעובר EMT, ולא אוכלוסיית תאי אנדותל אחרת בתוך הלב 18. כמודל Cre (Nfatc1 enCre) זמין, מחקרים עתידיים יכולים לנצל את הספציפיות של קו זה כדי להקטין את סיכוני זיהום. בנוסף לתאים חיוביים Tie2-GFP- לא מסתמית, תמיד יש את האפשרות של זיהום מmyocytes בנקודה שבי עלוני השסתום לצרף לאזור טבעתי של המחיצה וקירות שריר לב ציור קיר. במידע לא מוצג כאן, אנחנו בהתחלה החלו את הלימודים כדי לבודד VECs מאזורים מסתמית גזורים באמצעות חרוזים נוגדן מצומדות- מצופים באנטי-GFP ואנטי CD31. בעוד גישה זו הייתה מוצלחת לבידוד תאי האנדותל, שחווינו בצעדים כבדים תא משמעותיים מסוגים סמוכים, שאינו אנדותל תא ולכן Vics ותאי שריר לב מזוהמים מדגם הניסוי שלנו. זה כבר נמנע מלהשתמש בניתוח FACS כפי שנקבעו פרמטרים לבודד את ההשעיה תא בודדת בלבדים וניתוח PCR לזיהוי הביטוי של גני myocyte ספציפי שולט למגבלה זו (איור 3). בעוד הזיהום שלנו יכול להיחשב כמינימאלי, הוא נשאר מורכבות ניסוי פוטנציאליות אשר יכול להימנע בעתיד עם הבחירה הכפולה של GFP וסמנים פני תא ספציפי אנדותל. שימוש בפרוטוקול זה, יש לנו VECs המבודד בהצלחה מעכברים עובריים ובוגרים ודוגמאות הניתנות לאופן שגישה זו יכולה לשמש לבידוד RNA ותרבית תאים של אוכלוסיות תאים שליליים חיוביות וGFP GFP. עם זאת, גישה זו אינה מוגבלת ליישומים אלו וניתן להשתמש בו לשפע של גישות מולקולריות, תאיות ופונקציונליות. בנוסף, רקע Tie2-GFP ניתן התרבה ​​עם מודלים עכבר גנטיים שיאפשר למחקרים השוואתיים של אוכלוסיות VEC בבריאות ובחוליים. פיתוח מתודולוגיה רומן זה, בפעם הראשונה, לאפשר ללימודים ממוקדיםבחינת התרומה של VECs בפיתוח שסתום ותחזוקה ויכול לחשוף את מנגנונים שלא מעריכים את העבר של מחלת שסתום אנדותל תלוי.

השסתום הבוגר מורכב משלוש שכבות מרובד של מטריצה ​​מיוחדת תאית (ECM) וביניהם תאי ביניים שסתום (Vics) ומארז ידי שכבה אחת של תאי שסתום לב האנדותל (VECs) 1. התפקיד של ECM הוא לספק את כל המאפיינים ביומכנית הצורך להתמודד עם שינויים מתמידים בכוח המודינמית במהלך מחזור הלב. מחזור מסחר של ECM השסתום בשסתום המבוגר מוסדר בחוזקה על ידי Vics שהם במידה רבה שקטים ודמויים פיברובלסטים בהעדר המחלה. בנוסף לאוכלוסיית VIC, תאי שסתום לב האנדותל (VECs) יוצרים האנדותל ללא הפרעה על פני השטח של cusps השסתום 2. למרות החשיבות של ECM וVics למבנה שסתום ותפקוד תוארה על ידינו ואחרים, התפקיד של VECs ידוע פחות. עם זאת, אוכלוסיית תאים קטנה יחסית זו היא קריטית להיווצרות שסתום בעובר, והוא מתואר כמתפקד בשסתוםמחלה. היווצרות שסתום לב בעובר מתחילה כאשר תת קבוצה של תאי האנדותל באזורי תעלה ודרכי יצוא בין העליות וחדרים לעבור אנדותל לשינוי mesenchymal (EMT) ונפיחויות טופס הידוע כ כריות endocardial 1,3. תאי מזנכימה הפכו עתה בתוך מבנים אלו מאוחר יותר להתמיין Vics ויוצרים את השסתומים הבוגרים. ברגע שEMT הוא מלא, תאי האנדותל המקיפים את הכריות, כינו VECs, יוצרים שכבת תאי האנדותל רציפה המגנה על הסתום הבוגר מפני פגיעה. בנוסף, VECs לחוש את הסביבה המודינמית והוכח מולקולריים לתקשר עם Vics הבסיסי להסדיר ECM הומאוסטזיס 1,3. בשסתומים חולים, monolayer VEC מופר בשיתוף עם שינויים חריגים בארגון ECM וביומכניקה שינתה 4,5. בנוסף, מחקרים במודלים של עכברים מראים כי בעיות בתפקוד VEC היא הסיבה הבסיסית של ד השסתוםisease 1,6-9. כVECs לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות שסתום, תחזוקה, ומחלה, חשוב שאנו מגדירים באופן מלא פנוטיפים זמניים שלהם על מנת לקדם את התחום ולהבין את המנגנונים של מחלה. העבודה קודמת על ידי מספר מעבדות הצליחה לבודד בהצלחה VECs מדגמים חזירי וכבש 10-12. בשל גודלו הגדול של שסתומים האלה, בידודים דרך ו / או עיכול אנזימטי בניקוי, ואחריו במספר שיטות בידוד השונים כולל הפרדה מגנטית של תאי חרוז והרחבה משובט תא הבודד היה יעיל ליצור אוכלוסיות טהורות 11-13. עם זאת, מודלים אלו יכולים להיות מגבילים בשל הביאור שלם של הגנום החזיר וכבשים המגביל את הזמינות של כלים מולקולריים, בנוסף לעלויות גבוהות. לכן ניסויים של חזירי וVECs כבש לאחר הבידוד יכולים להיות מגבילים. מודלים עכבר עדיפים בשל אפשרויות רבות לmanipula הגנטיtion וכלים מולקולריים בעובר והמבוגר, אך עד היום, לא בידודי VEC במודלים של בעלי חיים קטנים כבר דיווחו. זה כנראה עקב הקושי של עבודה עם דגימות רקמה קטנות הכוללות אוכלוסיית תאי מיעוט שכיום אין זהות ייחודית של סמני VEC ספציפיים, ובכך למנוע שיטות בידוד מבוסס נוגדנים. במאמר זה, אנו מדווחים על שיטה חדשה לבידוד ישיר של VECs העכברי בשלבים עובריים ובוגרים. פרוטוקול זה מנצל עכברי Tie2-GFP, אשר מבטאים GFP בכל סוגי אנדותל התא ונעשה שימוש נרחב ללמוד אוכלוסיות תאי אנדותל 14. עם זאת, החידוש של המחקר הנוכחי הוא שעכברים אלה, בפעם הראשונה כבר נוצלו לבודד תאי אנדותל מהשסתומים. על ידי נתיחה מדוקדקת של רקמת השסתום וסדרה של תשעה digestions האנזימטית ואחרי מיון FACS, יכול להיות מבודד VECs ומשמש לניסיוני בטכניקות שונות בcluding מיצוי RNA ותרבות, ישירות הבא מיון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>		
<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">A-11077</td>
			<td style="width:148px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">70 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td style="width:107px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:107px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">2.5% Trypsin</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">CD31 rat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:107px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:107px;">553370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Chick Serum</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">16110-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">17104-019</td>
			<td>Prepared according to manufactuer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">DNase I, RNase free (10,000 Units)</td>
			<td style="width:107px;">Roche</td>
			<td style="width:107px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:107px;">CC3156</td>
			<td>For VEC media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">EDTA, 0.5M Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Hoefer</td>
			<td style="width:107px;">03-500-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">EGM2 SingleQuot, Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:107px;">CC-4176</td>
			<td>For VEC media</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td style="width:107px;">Hyclone</td>
			<td style="width:107px;">SH3007103IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Horse Serum</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">16050-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Hybridization Oven</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">230301V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Medium 199 1X</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cell gro</td>
			<td style="width:107px;">10-060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Paraformaldehyde 16% Solution EM grade</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:107px;">MP-Biomed</td>
			<td style="width:107px;">ICN1670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Permanox sterile chamber slide with cover</td>
			<td style="width:107px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:107px;">177429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Phosphate-Buffered Saline, 1X</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cell gro</td>
			<td style="width:107px;">21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">PrimeTime Mini qPCR Assay</td>
			<td style="width:107px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:107px;">Acta2 (&#945;SMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:107px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:107px;">4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">SuperScript VILO Mastermix</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">11755050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Tie2-GFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">3658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Tissue forceps #5 11cm</td>
			<td style="width:107px;">Dumont</td>
			<td style="width:107px;">14096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Trizol</td>
			<td style="width:107px;">Ambion</td>
			<td style="width:107px;">15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">&#945;-SMA anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">A2547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:115px;">VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:107px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine valve endothelial cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

תאי Tie2-GFP שיתוף למקם עם סמני תא האנדותל במסתמי לב העובריים ובוגרים. על מנת לאשר את הספציפיות של ביטוי Tie2-GFP בVECs מעכברים עובריים ובוגרים, immunofluorescence בוצע על מנת לקבוע שיתוף לוקליזציה עם סמן תא אנדותל, CD31 בסעיפי רקמות הוכנו מE14.5 והמבוגר בן 3 חודש Tie2-GFP עכברים תוך שימוש בשיטות שפורסמו בעבר על ידי המעבדה שלנו 16. כפי שניתן לראות באיור 1, GFP שיתוף מפורש VECs (איור 1, B, E, F) וCD31 (איור 1 C, D, E, F) בשני המבוגרים (איור 1 B, D, F) ועוברי ( איור 1, C, E) שלבים, ולכן אימות המודל שלנו לבידוד VEC שלאחר מכן. ניתוח FACS זיהה אוכלוסיות תאי GFP חיוביות וGFP-שלילי מובהקות במסתמי לב עובריים ובוגרים מבודדים מעכברי Tie2-GFP. t הפראיעכברי ype C57 / BL6 שמשו לפרמטרים שנקבעו GFP וכ -2% מתאים מגודרת יחידים מעכברי Tie2-GFP להראות העשרה משמעותית בתאי GFP החיובי על ידי ניתוח FACS בשתי דגימות עובריים ובוגרות (איור 2). בהתבסס על מחקרי שיתוף לוקליזציה שמוצגים באיור 1, תאים אלה נחשבים VECs ולהניב ממוצע של 61800 תאים בסך הכל (דוגמאות נעות בין 39,000-77,000 תאים / מדגם) בדגימות מבוגרות (n = 3), ו8,928 תאים (8,015- 11,000 תאים / המלטה) מהמלטה אחת E14.5 עובר. ניתוח PCR מאשר העשרה של סמני תא האנדותל בGFP חיובי תאים ותא סמני ביניים שסתום בתאי GFP-שלילי המבודדים מעכברי Tie2-GFP. ניתוח ביטוי גנים של אוכלוסיות תאים חיוביות ושליליות GFP על ידי FACS הבא qPCR להראות פרופילים מולקולריים שונים. בהשוואה לאוכלוסיות תאים שליליים GFP המבודדים מעוברי Tie2-GFP וadults, תאי GFP חיוביים מועשרים לביטוי של CD31 אנדותל סמני תא וvWF, (איור 3). יתר על כן, ביטוי של סמני myocyte (Myh6, Myh7) באוכלוסיות תאים אלה הוא נמוך מאוד, מפגין זיהום מינימאלי של תאים שאינם אנדותל. בניגוד לכך, תאים שליליים GFP המבודדים ממבוגרי עכברי Tie2-GFP וE14.5 עובר מועשרים לסמני תא ביניים (ויק) שסתום, תאים חיוביים α-SMA ויחסיים Periostin (POSTN) לGFP. העשרה של סמנים אלה היא גבוהה יותר בתאים שליליים GFP המבודדים מדגימות E14.5 בהשוואה למבוגרים בשל פנוטיפ השקטים של Vics המבוגר וביטוי ולכן נמוך של סמנים הופעלו. GFP חיובי תאים המבודדים מעכברים בוגרים Tie2-GFP יכולים להיות מתורבת במבחנה. יכולת תאי תרבות GFP חיוביים ושליליים GFP המבודדים מדגימות מבוגרות נבדקה בסיסד על מורפולוגיה של תאים ומכתים immunohistochemical. תוך שימוש בפרוטוקולים שתוארו בעבר על ידי 17 אנו מראים באיור 4 שתאי GFP חיוביים להופיע בסיבוב במורפולוגיה (איור 4 א) וGFP שיתוף מפורש עם CD31 סמן תא אנדותל לאחר שבועיים בתרבות (איור 4C). בניגוד לכך, תאים שאינם אנדותל הם שליליים עבור GFP, להציג מורפולוגיה כמו mesenchymal-(איור 4) ולהביע את הסמן VIC α-SMA לאחר תשעה ימים (איור 4D). <img alt="איור 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" width="400" /> .1 תאים Tie2-GFP חיובי איור שיתוף למקם עם CD31 במסתמי לב עוברי ובוגר. Immunofluorescence להראות קשר בין הביטוי של GFP (Tie2-) (A, B) עם סמן תא אנדותל, CD31 (C, D) ב שלעלוני eptal של שסתום צניפי בE14.5 (A, C, E) ומבוגרים (B, D, F) שלבים. אזור השסתום מודגש, C, E. (E, F) תמונות ממוזגות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" width="500" /> ניתן לזהות 2 VECs Tie2-GFP חיובי איור על ידי FACS. בהשוואה לקבוצת ביקורת באותו גיל C57 / BL6 (A, C), שסתומים מבודדים מעוברי Tie2-GFP (B) ומבוגרים (D) מכיל GFP- מובחן אוכלוסייה חיובית תא, כפי שצוין בירוק. אירועי GFP-שלילי, מוצגים באדום נאספו כביקורת. מספרים ב( B) ו( ד &#39;) מצביעים על% הממוצע של GFP-pתאי ositive מהמספר הכולל של אירועים מסודרים על ידי FACS (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" width="500" /> 3 תאי GFP חיובי איור מועשרים לסמני תא האנדותל ואילו תאים GFP-שליליים מבטאים גנים הקשורים לתאי ביניים שסתום. נציג qPCR של סמני תא האנדותל (CD31, פון Willebrand פקטור (vWF)) ומבוגרים (Myh6) ועובריים ( Myh7) סמני myocyte בGFP חיובי התאים המבודדים מאזורים מסתמית של E14.5 () ומבוגרים (B) עכברי Tie2-GFP. העשרת הערה של סמני תא האנדותל ורמות נמוכות מאוד של גנים הקשורים myocyte. (C, D) מקפלים צ&#39;הnges בביטוי של סמני תא ביניים שסתום. α-SMA וPostn בתאי GFP-שלילי מבודדים מE14.5 (C) ומבוגרים (D) עכברי Tie2-GFP <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig4highres.jpg" width="500" /> .4 תאי Tie2-GFP חיובי איור לשמור על ביטוי של סמני תא האנדותל במבחנה. FACS בעקבות, GFP החיובי (A, C) ושלילי (B, D) אוכלוסיות תאים מעכברים בוגרים היו בתרבית עד מחוברות ובכפוף לשלב הדמיה ניגוד (A, B) וimmunostaining ניאון (C, D). GFP חיובי תאים לבטא CD31 (אדום) (ג) לאחר10 ימים של התרבות. בניגוד לכך, הביטוי של GFP לא זוהה באוכלוסיית התא השלילית, שמוכתמת חיובי עבור α-SMA, סמן של Vics מופעל (ד &#39;).

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Valve Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

isolation-of-murine-valve-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Views.  The Ohio State University. The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Video: Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

בידוד של תאים אנדותל valvular

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) play an important role in the calcification process in aortic stenosis through the activation of their dedifferentiation program to osteoblast-like cells. Mouse VICs are a good in vitro tool for the elucidation of the signaling pathways driving the mineralization of the aortic valve cell. The method described herein, successfully used by these authors, explains how to obtain freshly isolated cells. A two-step collagenase procedure was performed with 1 mg/mL and 4.5 mg/mL. The first step is crucial to remove the endothelial cell layer and avoid any contamination. The second collagenase incubation is to facilitate the migration of VICs from the tissue to the plate. In addition, an immunofluorescence staining procedure for the phenotype characterization of the isolated mouse valve cells is discussed. Furthermore, the calcification assay was performed in vitro by using the calcium reagent measurement procedure and alizarin red staining. The use of mouse valve cell primary culture is essential for testing new pharmacological targets to inhibit cell mineralization in vitro.

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

This article describes the isolation of mouse aortic valve cells by a two-step collagenase procedure. Isolated mouse valve cells are important for performing different assays, such as this in vitro calcification assay, and for investigating the molecular pathways leading to aortic valve mineralization.

בידוד של תאי שסתום ביניים עכבר ללמוד את הסתיידות של שסתום אבי העורקים במבחנה

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve causes aortic stenosis and contributes to heart failure and stroke. Disease pathogenesis is multifactorial, and stresses such as inflammation, extracellular matrix remodeling, turbulent flow, and mechanical stress and strain contribute to the osteogenic differentiation of valve endothelial and valve interstitial cells. However, the precise initiating factors that drive the osteogenic transition of a healthy cell into a calcifying cell are not fully defined. Further, the only current therapy for CAVD-induced aortic stenosis is aortic valve replacement, whereby the native valve is removed (surgical aortic valve replacement, SAVR) or a fully collapsible replacement valve is inserted via a catheter (transcatheter aortic valve replacement, TAVR). These surgical procedures come at a high cost and with serious risks; thus, identifying novel therapeutic targets for drug discovery is imperative. To that end, the present study develops a workflow where surgically removed tissues from patients and donor cadaver tissues are used to create patient-specific primary lines of valvular cells for in vitro disease modeling. This protocol introduces the utilization of a cold storage solution, commonly utilized in organ transplant, to reduce the damage caused by the often-lengthy procurement time between tissue excision and laboratory processing with the benefit of greatly stabilizing cells of the excised tissue. The results of the present study demonstrate that isolated valve cells retain their proliferative capacity and endothelial and interstitial phenotypes in culture upwards of several days after valve removal from the donor. Using these materials allows for the collection of control and CAVD cells, from which both control and disease cell lines are established.

This protocol describes the collection of human aortic valves extracted during surgical aortic valve replacement procedures or from cadaveric tissue, and the subsequent isolation, expansion, and characterization of patient specific primary valve endothelial and interstitial cells. Included are important details regarding the processes needed to ensure cell viability and phenotype specificity.

בידוד תאי שסתום ראשוניים אנושיים למידול מחלות חוץ גופיות

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

בידוד תאי אנדותל מנימי לימפה עורית מורין

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

מחבר זרקור: בידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל לימפה עורית מורין

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...