אנו אסירי תודה לד&quot;ר סטיבן רובינסון והגב &#39;הניה צ&#39;רבינסקה (אוניברסיטת מונאש) לאספקה ​​הנדיבה של תרבויות astrocyte.

1. קבע Ascorbate תאיים בתאים בתרבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבית תאים וקציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול השעיה (למשל erythroleukemia האנושי, K562) או תאים חסיד (למשל האסטרוציטים ראשוניים) באמצעות נהלי תרבות סטנדרטיים 19-21,32,38. הערה: כדי להבטיח תאים מכילים ascorbate, טענו תאים בתרבית עם ascorbate או כascorbate או DHA 33,39. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת תמצית סלולרית המכיל ascorbate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מספר מתאים של פוספט שנאגרו מלוח השעיה (PBS) דהוי או תאים חסיד עם 450 μl של תא קר כקרח permeabilization הצפת [CPB; 0.1% saponin (w / v) ב-PBS; 4 ° C]. הערה: קבע את מספרם של התאים הנדרשים להשגת ערך הספיגה בטווח ליניארי של assay (ראה להלן) באופן אמפירי על ידי משתמש הקצה. הערה: ניתן להשתמש גם בתמציות רקמה (ראה דיון לפרטים נוספים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Agitaתאי te על קרח דק 10 כדי להבטיח תמוגה הסלולרית יסודית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת תמצית תאית המכיל ascorbate הובהרה על ידי הסרת פסולת תאית על ידי צנטריפוגה של lysate הגולמי בגרם × 16,000 במשך 5 דקות בmicrocentrifuge בקירור (4 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות 4 x 100 aliquots μl מכל מדגם ולהוסיף רצף אופקי של בארות בצלחת תחתונה 96 היטב שטוחה המכילה גם 25 μl / טוב של PBS (&quot;-AO&quot;) בלבד או 25 μl / טוב של 45.5 U / מיליליטר פתרון מניות של L-ascorbate-מונואמין (AO) ב-PBS (&quot;+ AO&quot;). הערה: זה צריך להיעשות במקביל להכנת התקנים (ראה להלן). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבנייה סטנדרטית עקומת ascorbate (חייבת להיות בנויה מחדש לכל assay) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של חומצה אסקורבית 10 מ&quot;מ קר כקרח PBS. הערה: בדוק את הריכוז של ascorbate spectrophotometrically באמצעות קובט קוורץ עם 1סנטימטר נתיב באורך ב265 ננומטר (מקדם הכחדה = 14.5 מ&quot;מ -1 סנטימטר -1) 40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין בקפידה סדרה של סטנדרטים ascorbate בין 0 ל 20 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל לצעד 1.2.4, להסיר בזהירות 4 × aliquots 100 μl מכל תקן ולהוסיף רצף אופקי של בארות בצלחת תחתונה 96 היטב שטוחה המכילה 25 μl / טוב של PBS (&quot;-AO&quot;) או 45.5 פתרון מניות U / מיליליטר של AO ב PBS (&quot;+ AO&quot;). הערה: בסטנדרטים ascorbate מעל 100 μl יכיל 0-2 nmole של ascorbate. שים לב, המטרה של AO היא לשלוט על התרומה של reductants הלא ascorbate לferricyanide הפחתה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע ascorbate תאיים - שלב 1: להסיר באופן סלקטיבי ascorbate וכמותית לחמצן ascorbate עם ferricyanide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Orbitally לערבב את צלחת 96 היטב ב550 סל&quot;ד בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות בחושך על ידי כיסוי את הצלחת בנייר כסף. הערה: Tהצעד שלו צריך לחמצן כל ascorbate בבארות &quot;+ AO&quot; לDHA. בארות &quot;-AO&quot; אינן צריכות להיות מושפעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של 3.5 ferricyanide אשלגן מ&quot;מ (המכונה במסמך בשם &quot;ferricyanide&quot;) ב-PBS לכל הבארות. מ&quot;מ הסופי [ferricyanide] = 1. שים לב: השתמש multipipettor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Orbitally לערבב את הצלחת ב550 סל&quot;ד בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות נוספות בחושך. הערה: צעד זה אמור לגרום להפחתת ferricyanide לשל ברזל על ידי ascorbate ביחס stoichiometric של 2 מולקולות של ferricyanide מופחתות לכל מולקולה 1 של ascorbate חמצון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להוסיף 25 μl של פתרון זה עתה נבנה מכיל 50% (v / v) חומצה אצטית ו30% (w / v) חומצת Trichloroacetic (TCA). שים לב: השתמש multipipettor. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע ascorbate תאיים - שלב 2: לכמת את כמות של הברזל נוצרה 37 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של פתרון נחישות של ברזל 37 100 μl לדוארACH כן. הערה: פתרון עבודה צריך להיעשות מייד לפני שימוש: 2 מיליליטר של 3 M Na-אצטט (pH 6.0); 0.5 מיליליטר של חומצה אצטית קרחונית (~ 17.4 M חומצה אצטית); 2 מיליליטר של 0.2 M חומצת לימון; 2 מיליליטר של 3.3 מ&quot;מ FeCl 3 ב0.1 חומצה אצטית M; 1 מיליליטר של 30 מ&quot;מ ferene-S. הנפח הסופי של פתרון עובד זה צריך להיות 7.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Orbitally לערבב את הצלחת בחושך ב550 סל&quot;ד במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את ערכי הספיגה של הבארות ב593 ננומטר (כלומר המקסימום ספיגת של Fe (II) (ferene-S) 3 המורכבים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את כמות ascorbate תאית כascorbate nmoles למיליון תאים בתחילה על ידי הפחתת 593 ערכי ננומטר לבארות &#39;+ AO&#39; ממקבילים - הבארות &quot;AO&quot; עבור כל דגימה ולאחר מכן ביון מעקומת סטנדרט ascorbate (ראה שלב 1.3 ). בעת בניית עקומת הסטנדרט, עלילה &quot;ערך הבדל&quot; זה עבור כל תקן כנגד הסכום של ascorbאכלתי בכל טוב. </li></ol></li></ol> 2. קביעת Ascorbate-זרימה מתאים בתרבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבית תאים וקציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול השעיה או תאים חסיד כאמור לעיל (ראה שלב 1.1). הערה: לבצע את assay להלן בפורמט פלאט 24 גם עם השעיה ותאים חסיד לתוצאות הטובות ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי השעיה resuspend, או כיסוי תאים חסיד, עם 400 μl של מראש חיממתי פתרון שנאגר מלוח HEPES, עם או בלי סידן ומגנזיום, ומכילים 5 מ&quot;מ D-גלוקוז (HBS / D; pH 7.3, 37 מעלות צלזיוס) בבארות של 24 גם צלחת. מוסיף את אותו הנפח של HBS / D לבארות ללא תא שצוינו על כל צלחת 24 גם להיבדק. הערה: יהיה זה האחרון משמש כשולט ללא תא לתגובה הבסיסית (ראה להלן). </li></ol></li></ol> 3. לקבוע את סכום Ascorbate פורסם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צריכים להיות מוכנים פתרונות המניות הבאים מראש: 120U / AO מיליליטר בHBS / D (להכין טרי); 2.4 מ&quot;מ Ferene-S בHBS / D; 120 מיקרומטר FeCl 3 ו600 מיקרומטר Na-ציטראט בHBS / D (להכין באופן מיידי מפתרונות מניות מרוכזים יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את תגובת ferrireduction (נפח סופי לכל גם צריך להיות 600 μl), להוסיף הכמויות של חומרים כימיים לבארות בודדות כבר מכילות 400 μl של HBS / D הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של AO (120 U / ml) או HBS / D כדי לזווג בארות בשלושה עותקים. ריכוז AO הסופי צריך להיות 10 U / ml. הערה: לייבל לזווג בארות כ&quot; - AO &quot;ו&quot; + AO &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הצלחות עם ערבוב מסלולית עדין במשך 5 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של 2.4 מ&quot;מ ferene-S לכל הבארות. ריכוז ferene-S הסופי צריך להיות 200 מיקרומטר. מערבבים את הצלחות כאמור במשך 5 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של ציטרט וברזל 120 מיקרומטר מוכן טרי. הברזל הסופי וריכוזי ציטראט צריך להיות 10 ברזל מיקרומטר ו50 ציטראט מיקרומטר. מערבבים היטב. </li></ol&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלוש בארות שליטה בשלושה עותקים, לשאוב את המדיום שמעליה ולהוסיף 600 HBS / D μl מכיל saponin .0.1%. הערה: אלה ישמשו פקדי &quot;100% תא תמוגה&quot; לקטט דהידרוגנז LDH () assay שחרור שנערך במקביל (ראה בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 60 דקות בחושך על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של assay ascorbate-בזרימת, במהירות לשאוב 500 μl מכל טוב ולהוסיף לכותרתו כראוי בארות בצלחת 24 גם. הערה: לתאי השעיה, בתחילה להסיר את התאים על ידי צנטריפוגה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 300 aliquots μl של supernatant לצלחת 96 היטב ולאחר מכן קרא ב593 ננומטר. </li></ol> 4. קביעת Ascorbate התאי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את ערכי הספיגה של הבארות ב593 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את כמות ascorbate תאי כascorbate nmoles לחלבון מ&quot;ג (או למיליון תאים) כפי שתואר לקביעת ascorbate תאיתבשלב 1.5.4. הערה: למשתמש הקצה צריך לייעל את תנאים, כך ששחרור ascorbate אינו מוגבל על ידי ascorbate תאיים. </li></ol> 5. קביעת שחרור LDH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם 200 μl הנותר של פתרון תאי מכל מדגם לנהל assay שחרור LDH 32,41 כדי לקבוע את מידת תמוגה הסלולרית. הערה: לחשב כ% מLDH releasable המוחלט. לקבוע LDH releasable מהדגימות שטופלו בsaponin .0.1%. </li></ol>

<ol>
	<li>Buettner, G. R., Schafer, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Albert+Szent-Gy&#246;rgyi:+vitamin+C+identification.">Albert Szent-Gy&#246;rgyi: vitamin C identification.</a> Biochem. J. , (2006).</li><li>Padayatty, S. J., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+physiology+and+pharmacology+of+vitamin.">New insights into the physiology and pharmacology of vitamin.</a> C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).</li><li>Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+dependence+of+the+hypoxia-inducible+factor+hydroxylases+(factor+inhibiting+HIF+and+prolyl+hydroxylase+domain+2)+on+ascorbate+and+other+reducing+agents.">Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents.</a> Biochem. J. 427, 135-142 (2010).</li><li>Manning, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+Promotes+Maturation+of+T-Cells.">Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells.</a> Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).</li><li>Asard, H., et al., Banerjee, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Redox Biochemistry. , 22-37 (2007).</li><li>Aguirre, R., May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+the+vascular+bed:+Importance+of+vitamin.">Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin.</a> C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).</li><li>May, J. M., Qu, Z. -. c., Mendiratta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+and+recycling+of+a-tocopherol+in+human+erythrocytes+by+intracellular+ascorbic+acid.">Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid.</a> Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).</li><li>Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+some+major+functions+of+vitamin+C+in+animals.">Synthesis and some major functions of vitamin C in animals.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).</li><li>Rumsey, S. C., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absorption+transport+and+disposition+of+ascorbic+acid+in+humans.">Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans.</a> J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).</li><li>Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+chromosomal+mapping+of+the+human+nonfunctional+gene+for+L-gulono-g-lactone+oxidase,+the+enzyme+for+L-ascorbic+acid+biosynthesis+missing+in+man.">Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man.</a> J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).</li><li>Challem, J. J., Taylor, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviruses,+ascorbate,+mutations,+in+the+evolution+of+Homo+sapiens.">Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens.</a> Free Radic. Biol. Med. 25, 130-132 (1998).</li><li>Nishikimi, M., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+the+deficiency+in+humans+of+gulonolactone+oxidase,+a+key+enzyme+for+ascorbic+acid+biosynthesis.">Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis.</a> Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).</li><li>Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. i. t. a. m. i. n. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=recycling+and+degradation+in+mammals.">recycling and degradation in mammals.</a> FEBS J. 274, 1-22 (2007).</li><li>May, J. M., Qu, Z. -. c., Qiao, H., Koury, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturational+loss+of+the+vitamin+C+transporter+in+erythrocytes.">Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).</li><li>Wilson, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vitamin+C+transport.">Regulation of vitamin C transport.</a> Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).</li><li>Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pecking+order+of+free+radicals+and+antioxidants:+lipid+peroxidation,+a-tocopherol,+and+ascorbate.">The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate.</a> Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).</li><li>May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+ascorbic+acid+an+antioxidant+for+the+plasma+membrane.">Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane.</a> FASEB J. 13, 995-1006 (1999).</li><li>Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+-+important+for+iron+metabolism.">Ascorbic acid - important for iron metabolism.</a> Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-transferrin+iron+reduction+and+uptake+are+regulated+by+transmembrane+ascorbate+cycling+in+K562+cells).">Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells).</a> J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).</li><li>Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+routes+of+iron+accumulation+in+astrocytes:+ascorbate-dependent+ferrous+iron+uptake+via+the+divalent+metal+transporter+(DMT1)+plus+an+independent+route+for+ferric+iron.">Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron.</a> Biochem. J. 432, 123-132 (2010).</li><li>Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+iron+uptake+is+stimulated+by+ascorbate+via+an+intracellular+reductive+mechanism.">Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).</li><li>Lawen, A., Lane, D. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+iron+homeostasis+in+health+and+disease:+uptake,+storage,+transport,+and+molecular+mechanisms+of+action.">Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action.</a> Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).</li><li>Gr&#252;newald, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+in+the+brain.">Ascorbic acid in the brain.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).</li><li>Harrison, F. E., May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+function+in+the+brain:+vital+role+of+the+ascorbate+transporter+SVCT2.">Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2.</a> Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).</li><li>Rebec, G. V., Pierce, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vitamin+as+neuromodulator:+ascorbate+release+into+the+extracellular+fluid+of+the+brain+regulates+dopaminergic+and+glutamatergic+transmission.">A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission.</a> Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).</li><li>Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+view+at+C.">New view at C.</a> Nat. Med. 8, 445-446 (2002).</li><li>Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid:+Chemistry,+biology+and+the+treatment+of+cancer.">Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).</li><li>Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+stimulates+ascorbate+transport+by+astrocytes.">Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes.</a> Brain Res. 858, 61-66 (2000).</li><li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+uptake.">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li><li>May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -. c. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+transport+and+recycling+by+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells:+response+to+glutamate+toxicity.">Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity.</a> Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).</li><li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+regulation+and+its+neuroprotective+role+in+the+brain.">Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain.</a> Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glutamate+aspartate+transporter+(GLAST)+mediates+L-glutamate-stimulated+ascorbate-release+via+swelling-activated+anion+channels+in+cultured+neonatal+rodent+astrocytes.">The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes.</a> Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+and+plasma+membrane+electron+transport+-+enzymes+vs+efflux.">Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux.</a> Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).</li><li>Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume-sensitive+organic+osmolyte/anion+channels+in+cancer:+novel+approaches+to+studying+channel+modulation+employing+proteomics+technologies.">Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).</li><li>Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC+methods+for+simultaneous+determination+of+ascorbic+and+dehydroascorbic+acids.">HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids.</a> Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).</li><li>Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+sensitive+assay+for+ascorbate+using+a+plate+reader.">A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader.</a> Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+colorimetric+microplate+ferrocyanide+assay+applied+to+ascorbate-stimulated+transplasma+membrane+ferricyanide+reduction+and+mitochondrial+succinate+oxidation.">A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation.</a> Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).</li><li>Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Na+/H++exchangers+and+intracellular+pH+in+regulating+vitamin+C-driven+electron+transport+across+the+plasma+membrane.">A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane.</a> Biochem. J. 428, 191-200 (2010).</li><li>Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+for+transport+and+efflux+of+ascorbate+and+dehydroascorbate.">Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate.</a> Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).</li><li>Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electron+spin+resonance+spectra+of+radical+intermediates+in+the+oxidation+of+ascorbic+acid+and+related+substances.">The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances.</a> J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).</li><li>Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detoxification+of+exogenous+hydrogen+peroxide+and+organic+hydroperoxides+by+cultured+astroglial+cells+assessed+by+microtiter+plate+assay.">Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplasma+membrane+electron+transport+comes+in+two+flavors.">Transplasma membrane electron transport comes in two flavors.</a> Biofactors. 34, 191-200 (2009).</li><li>Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+the+effects+of+cytochalasin+B+on+transport+and+motile+processes.">Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).</li><li>May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+decreases+oxidant+stress+in+endothelial+cells+caused+by+the+nitroxide+tempol.">Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol.</a> Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).</li><li>Avron, M., Shavit, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+simple+method+for+determination+of+ferrocyanide.">A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide.</a> Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

במאמר זה אנו מציגים שני מבחני microplate colorimetric מהירים, ספציפיים ורגישים יחסית לקביעת ascorbate נגזר מתאי התוך וחוץ תאיים בתאים בתרבית. ניתן להשלים מבחני עם גישה לציוד מעבדה סטנדרטית וחומרים כימיים. מגיב רק יקר באופן מתון הנדרש לassay הוא AO, שהוא חיוני כפי שהוא מקנה גבוהה מידת הס...

גילוי האופי הכימי של חומצה אסקורבית (ויטמין C), וזיהוי שלה בתור &quot;הגורם אנטי scorbutic&quot; המיוחל, על ידי אלברט Szent-ג&#39;ורג&#39;י ואחרים במאמרים שפורסמו 1928-1934 1 היה אירועי ציון דרך בהיסטוריה לביוכימיה. ואכן, תגליות אלה תרמו לSzent-ג&#39;ורג&#39;י שזכה בפרס נובל לפיזיולוגיה ורפואה בשנת 1937. החבילה המתרחבת של תפקידים לascorbate בפיזיולוגיה של בעלי חיים וצמחים, כמו גם על בריאות אדם, תמשיך להיות הנושאים מדעיים פעילים חקירה ומחלוקת. L-Ascorbate הוא reductant פיסיולוגי בשפע ואנזים cofactor במערכות יונקים, ותורם לתגובות אנזימטיות מוגדרות היטב רבות מעורבים הידרוקסילציה קולגן, קרניטין וביוסינתזה נוראפינפרין, חילוף חומרים טירוזין והורמון פפטיד amidation 2. מסקרן, evide הרכבהNCE עולה כי ascorbate משחק תפקיד בגירוי dioxygenases ברזל תלוי אחר, כגון hydroxylases prolyl וasparaginyl המעורב בהידרוקסילציה ומיקוד של גורמי היפוקסיה מושרה 1α (HIFs) ו2α 3. דו&quot;ח שפורסם לאחרונה מצביע על כך שascorbate משחק תפקיד בהבשלת תאי T המשפיע על דרך demethylation הכרומטין באמצעות פעילותו במגרת hydroxylases הגרעיני, Jumonji C חלבוני תחום (JmjC); האחרון שבם מופיעים לדרוש ascorbate לפעילות מלאה 4. ואכן, הגירוי של אנזימים כגון על ידי ascorbate נראה להתרחש על ידי מנגנון דומה לגירוי על ידי ascorbate של hydroxylases HIF וקולגן. בין השפעות קלאסיות אחרות, ascorbate תורם באופן משמעותי לantioxidation הסלולרי כמחסל 5 רדיקלי מסיסים במים שבירת שרשרת ולמחזור של קרום הפלזמה α-טוקופרול (ויטמין E) באמצעות ההפחתה של α-tocopheroxyl 6 רדיקלי, Which חשוב בהגנה מפני חמצון של שומנים בממברנה 7. חשוב מכך, למרות שרוב היונקים מסוגלים סינתזה כבדית דה נובו של ascorbate מD-גלוקוז, פרימטים גבוהים יותר, שרקנים ועוד כמה עטלפים תלויים במקורות תזונתיים של הוויטמין 8. זאת בשל איון של גן GULO, orthologues אשר ביונקים מושפעים לקודד האנזים, γ-gulono-lactone מונואמין 9-13. אנזים זה נדרש לתגובה האחרונה בביוסינתזה ascorbate מ13 גלוקוז. בעקבות קליטה בתיווך טרנספורטר מלומן מעיים בבני אדם, ascorbate מופץ בכל הגוף על ידי מערכת הדם. הוויטמין נמצא בדרך כלל בצורה המצומצמת שלה בmillimolar ריכוזים intracellularly (עם החריג הבולט של אריתרוציטים שבריכוזים הם בדרך כלל דומים לריכוז הפלזמה הרווח), ובקונצרט כלשהו מייקרוentrations (למשל 50-200 מיקרומטר) ברוב הנוזלים תאיים 14,15. בתנאים פיסיולוגיים, ascorbate בדרך כלל עובר חמצון אחד אלקטרונים הפיכים לרדיקלי ascorbyl בחינם (AFR; הידוע גם בmonodehydroascorbate או semidehydroascorbate). בעוד AFR הוא 16 רדיקליים יציבים יחסית, בהיעדר הירידה המהירה שלה מאלקטרון אחד האנזימטית חזרה לascorbate, שתי AFRs יכול לקדם dismutate לascorbate אחד וdehydroascorbate אחד (DHA) 9,13,17. בתוך הפנים של התא, מוצר חמצון שני אלקטרונים של ascorbate, DHA, ניתן להפחית במהירות בחזרה לascorbate ידי גלוטתיון וNAD (P) H האנזימטית תלויות ותגובות אינן אנזימטית 13. בזמן שהוא קיבל באופן קלאסי שהתפקיד המשמעותי היחיד של ascorbate במטבוליזם של ברזל הוא כדי לעורר ספיגה תזונתית של ברזל מהמקור צמחי 18, אנחנו ואחרים סיפקנו ראיות שלtrongly מצביע ascorbate שמשחק תפקיד התרחב מאוד בחילוף החומרים של מתכת זו. ראשית, ascorbate כי הוא שוחרר על ידי תאי ascorbate-גדוש מופיע לשחק תפקיד חשוב בויסות הספיגה של ברזל שאינו מאוגד transferrin על ידי תאים 19,20, וראיות מאוד לאחרונה עולה כי ascorbate גם מודולציה את הספיגה של ברזל בכריכת transferrin על ידי תאים 21, האחרון שבם מתאים למסלול פיסיולוגי עיקרי ברזל ספיגת 22. Ascorbate הוא חיוני לתפקוד תקין של מערכת עצבים מרכזי ביונקי 23,24. יחד עם luteum קליפת המוח, בלוטת יותרת המוח, בלוטת התימוס, הרשתית וקורפוס יותרת הכליה, המוח מכיל ריכוזים גבוהים של ascorbate יחסית לרקמות אחרות בגוף 23,25-27. בנוסף, החשיפה של שני האסטרוציטים 28,29 ותאים כמו נוירון 30 לגלוטמט ידוע כדי לעורר את שחרורו של ascorbate לתוך חלל החוץ תאי, שם ascorbatהוא חשב דואר כדי לעזור להגן על נוירונים נגד תפקוד עצבי הנגרם גלוטמט ביום 31. בעוד המנגנון של שחרור ascorbate-Induced גלוטמט מהאסטרוציטים המדויק אינו ידוע, יש לנו לאחרונה סיפקנו ראיות המצביעות על מעורבותם של תאי נפיחות נגרמת על ידי ספיגת גלוטמט על ידי גלוטמט astrocyte וטרנספורטר aspartate (GLAST; איזופורם הידוע גם חומצת אמינו מעוררת טרנספורטר 1 [EAAT1 ] בבני אדם) והפעלה הסוגר של osmolyte ואניון ערוצי נפח רגיש (VSOACs) שהם חדירים לאניונים אורגניים קטנים כגון ascorbate 32. הזהויות מולקולריות של תעלות קרום הפלזמה מעורבות בהיווצרות VSOAC להישאר להיות מזוהות 33,34. למרות מבחני רבים פותחו לקביעת ascorbate בדגימות ביולוגיות, הכוללות מבחני spectrophotometric, fluorometric וchromatographic 35,36, יש הרבה גיוון בסגולי, רגישות, interferencדואר על ידי מזהמים כימיים, טווח ליניארי אפקטיבי ויציבות של אנליטי נקודת הקצה. בנוסף, גורמים משמעותיים נוספים המשפיעים על הבחירה של assay הם מהירות, קל שימוש וגישה לציוד יחסית מיוחד כגון כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים מנגנון (HPLC). כאן אנו מציגים assay microplate colorimetric פשוט ומאוד ספציפי לקביעת ascorbate תאית בתאים בתרבית, כמו גם assay נפרד לקביעת ascorbate-זרימה מהתאים בתרבית. Assay האחרון נועד לעקוף את הבעיה של הערכה נמוכה מדי של שחרור ascorbate מהתאים עקב ספיגה מחדש מהירה של ascorbate שפורסם על ידי מובילי נתרן תלוי ascorbate (SVCTs). למרות ששתי השיטות האלה הופיעו בחלק מהפרסומים הקודמים שלנו 19,20,32,37,38, כתב היד הזה מספק סט מפורש של הוראות והנחיות לביצוע היעיל שלהם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="678">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:284px;">Nunc 96-well flat-bottom plates</td>
			<td style="width:135px;">Thermo</td>
			<td style="width:127px;">269620</td>
			<td style="width:132px;">Any flat-bottom 96-well plate can be used</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:284px;">Refrigerated benchtop microcentrifuge</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:127px;">5415D</td>
			<td style="width:132px;">A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:74px;width:284px;">Refrigerated bench-top centrifuge</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:127px;">5810R</td>
			<td style="width:132px;">Swing-bucket</td>
		</tr>
		<tr height="260">
			<td height="260" style="height:260px;width:284px;">Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer</td>
			<td style="width:135px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;">Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:284px;">Ependorf MixMate (microplate orbital mixer)</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;">This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">General-purpose buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:284px;">MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;width:284px;">HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2&#8226;2 H2O, 0.8 mM MgSO4&#8226;7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">General chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:284px;">L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;">Highest purity preparations should be obtained</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:284px;">Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30790</td>
			<td style="width:132px;">Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:284px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">C6762</td>
			<td style="width:132px;">Stock solutions prepared in DMSO or ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:284px;">Ascorbate oxidase (AO)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">A0157</td>
			<td style="width:132px;">Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Potassium ferricyanide (FIC)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">455989</td>
			<td style="width:132px;">Trihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5&#8242;,5&#8242;&#8242;-disulfonic acid disodium salt)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">92940</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Sodium L-glutamate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Saponin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">47036</td>
			<td style="width:132px;">Prepare a 0.1% stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">3 M sodium acetate (pH 6.0)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">0.2 M citric acid</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:284px;">3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">30 mM ferene-S</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stock solutions for ascorbate-efflux assay</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">AO (120 U/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">2.4 mM ferene-S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and specific microplate assay for the determination of intra- and extracellular ascorbate in cultured cells

ויטמין C (ascorbate) ממלאת תפקידים רבים חשובים בחילוף חומרים תאיים, שרבים מהם יצאו לאור רק בשנים האחרונות. לדוגמא, בתוך המוח, ascorbate פועל באופן הגנה עצבי וneuromodulatory שכרוך רכיבה על אופניים ascorbate בין הנוירונים והאסטרוציטים vicinal - מערכת יחסים שנראה כחיוני להומאוסטזיס ascorbate המוח. בנוסף, יש ראיות המתעוררות מראות כי יש ascorbate תפקיד התרחב מאוד בויסות חילוף חומרים של ברזל תאי ומערכתיים יותר מוכר בסגנון קלאסי. ההכרה הגוברת בתפקיד נפרד של ascorbate בפיזיולוגיה תאית והאורגניזם נורמלי וחוסר פיקוח ממשלתי דורשת מגוון של טכניקות אנליטיות בינונית תפוקה ורגישות גבוהה שיכולות להתבצע ללא הצורך בציוד מומחה יקר מאוד. כאן אנו מספקים הוראות מפורשות למדיום תפוקה, assay microplate הספציפי וזול יחסית לקביעת בוascorbate התוך תאי וה בתרבית תאים.

קביעת Ascorbate תאית בתאי השעיה מתורבתים ב assay הראשון (איור 1), ascorbate תאיים נקבע, בעקבות ascorbate ספציפי הפחתה (AO רגיש כלומר) של ferricyanide לשל ברזל, תוך שימוש בנחישות רגישה מאוד של של ברזל על ידי הליך שפורסם בעבר 37. זיהוי של ascorb...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells at JoVE.com

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Ascorbate משחק תפקידים חשובים רבים בחילוף חומרים תאיים, שרבים מהם מגיע רק לאור בשנים האחרונות. כאן אנו מתארים בינוני תפוקה, assay microplate הספציפי וזול לקביעת שני ascorbate התוך וחוץ תאי בתרבית תאים.

Microplate Assay מהיר והספציפי לקביעת Ascorbate Intra-ותאי בתאים בתרבית

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

a-rapid-specific-microplate-assay-for-determination-intra

Research

JoVE Journal

Biology

13.4K Views.  University of Sydney.  Ascorbate משחק תפקידים חשובים רבים בחילוף חומרים תאיים, שרבים מהם מגיע רק לאור בשנים האחרונות. כאן אנו מתארים בינוני תפוקה, assay microplate הספציפי וזול לקביעת שני ascorbate התוך וחוץ תאי בתרבית תאים. 

Video: A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

ספירת ועל קביעת הכדאיות של תאים בתרבית

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Assay Clonogenic: תאים חסיד

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

זיהוי של ביטוי גנים בתאים תאיים חיים של Murine, אדם וחזירי מקור באמצעות חלקיקים שכותרתו פלואורסצנטי

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

מהיר, שיטת Scalable עבור הבידוד, הלימוד פונקציונלי, וניתוח של מטריקס תאים שמקורם

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and the determination of the biochemical function of proteins at the sub-organismal level. Although baculovirus expression systems are increasingly used for protein production in numerous biotechnological, pharmaceutical, and industrial applications, nonlytic systems that do not involve viral infection have clear benefits but are often overlooked and underutilized. Here, we describe a method for generating nonlytic expression vectors and transient recombinant protein expression. This protocol allows for the efficient cellular localization of recombinant proteins and can be used to rapidly discern protein trafficking within the cell. We show the expression of four&#160;recombinant proteins in a commercially available insect cell line, including two aquaporin proteins from the insect Bemisia tabaci, as well as subcellular marker proteins specific for the cell plasma membrane and for intracellular lysosomes. All recombinant proteins were produced as chimeras with fluorescent protein markers at their carboxyl termini, which allows for the direct detection of the recombinant proteins. The double transfection of cells with plasmids harboring constructs for the genes of interest and a known subcellular marker allows for live cell imaging and improved validation of cellular protein localization.

Nonlytic insect cell expression systems are underutilized for production, cellular trafficking/localization, and recombinant protein functional analysis. Here, we describe methods to generate expression vectors and subsequent transient protein expression in commercially available lepidopteran cell lines. The co-localization of Bemisia tabaci aquaporins with subcellular fluorescent marker proteins is also presented.

ביטוי חולף ואת סלולר לוקליזציה של חלבונים רקומביננטי תאים בתרבית חרקים

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. HIF-1 consists of a heterodimeric oxygen-regulated &#945; subunit (HIF-1&#945;) and constitutively expressed &#946; subunit (HIF-1&#946;) also known as aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT), regulating genes involved in diverse processes including angiogenesis, erythropoiesis and glycolysis. The identification of HIF-1 interacting proteins is key to the understanding of the hypoxia signaling pathway. Besides the regulation of HIF-1&#945; stability, hypoxia also triggers the nuclear translocation of many transcription factors including HIF-1&#945; and ARNT. Notably, most of the current methods used to study such protein-protein interactions (PPIs) are based on systems where protein levels are artificially increased through protein overexpression. Protein overexpression often leads to non-physiological results arising from temporal and spatial artifacts. Here we describe a modified co-immunoprecipitation protocol following hypoxia treatment using endogenous nuclear proteins, and as a proof of concept, to show the interaction between HIF-1&#945; and ARNT. In this protocol, the hypoxic cells were harvested under hypoxic conditions and the Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) wash buffer was also pre-equilibrated to hypoxic conditions before usage to mitigate protein degradation or protein complex dissociation during reoxygenation. In addition, the nuclear fractions were subsequently extracted to concentrate and stabilize endogenous nuclear proteins and avoid possible spurious results often seen during protein overexpression. This protocol can be used to demonstrate endogenous and native interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators under hypoxic conditions.

Here we describe a co-immunoprecipitation protocol to study protein-protein interactions between endogenous nuclear proteins under hypoxic conditions. This method is suitable for demonstration of the interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators at hypoxia.

Co-immunoprecipitation Assay באמצעות חלבונים גרעיניים אנדוגני מתאי תרבותי בתנאים ובשפתיים

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...