We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung f&#252;r Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung f&#252;r Herzforschung and Deutsche Gesellschaft f&#252;r Thorax-, Herz- und Gef&#228;sschirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum f&#252;r Herz- und Kreislaufforschung S&#228;ule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).

1. הכנת מדיה, ריאגנטים ותא תנאי תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 293 תאי כליה עובריים האנושי HEK <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות HEK 293 תאים (CRL-1573, ATCC) במדיום של DMEM / חם F-12 בתוספת 5 FCS%, L- גלוטמין (2 מ&quot;מ), ופניצילין (100 U / ml) / סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעבר התאים, לשטוף תאי פעם עם PBS, להוסיף 0.05% טריפסין / EDTA ודגירה של 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. העברת תאים לתוך שפופרת 15 מיליליטר, צנטריפוגה 5 דקות ב1,200 סל&quot;ד (300 x ז) ​​ולהעביר כ 5x10 5 תאים לבקבוק תרבות T25 טרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> fibroblasts העוברי Murine (MEFs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של פתרון ג&#39;לטין 0.1% עד 6-בארות בודדות ודגירה בטמפרטורת חדר (RT) במשך שעה 1. נוזל לשאוב ולאחסן ב RT עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות MEFs DMEM בתוספת 10% FCS, L- גלוטמין (2 מ&quot;מ), L-גלוקוז (4.5 גר &#39;/ ליטר), פירובט נתרן (1 מ&quot;מ), ופניצילין (100 U /מיליליטר) / סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר) על 6 צלחות גם ג&#39;לטין מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ MEFs לתוך 6-גם צלחות ולתת להם לגדול עד מפגש. להוסיף mitomycin (5 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 2.5 שעות לעצור תאים. בינוני לשאוב, לשטוף תאי פעמיים עם מדיום MEF מלא ולהוסיף 3 מיליליטר בינוני MEF לכל 6 היטב. תאים אלו משמשים כמזין-שכבה של תאים בעכברים וiPS חזירי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות של ES עכברי ותאי iPS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין עכבר בינוני תרבות ES, להשלים DMEM בינוני עם FCS 15%, L- גלוטמין (2 מ&quot;מ), L-גלוקוז (4.5 גר &#39;/ ליטר), חומצות ממ שאינן חיוניים אמינו (1X), β-mercaptoethanol (0.1 מ&quot;מ) וגורם מעכב לוקמיה (1.000 U / ml). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 6-בארות עם MEFs-נעצר צמיחה פעם עם הסרום ללא DMEM, להוסיף עכבר בינוני ES 2 מיליליטר ותאי iPS עכברי (20% מהתאים של צלחת ומחוברות). כל תאים לשטוף יום פעם אחת עם הסרום ללא DMEM ולהוסיף 2 מיליליטר בינוני ES עכבר טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעבר התאים, לשטוף היטב כל פעם עם הסרום ללא DMEM, להוסיף 0.25% טריפסין / EDTA ודגירה של 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. העברת תאים לתוך שפופרת 15 מיליליטר, צנטריפוגה 5 דקות ב1,200 סל&quot;ד (300 x ז), תאים גלולים במדיום ES עכבר 500 μl ולהוסיף מההשעיה 100 μl למדיום ES עכבר 2 מ&quot;ל בטרי 6-גם עם מזין שכבת MEF. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות של חזיר שב&quot;ס תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום iPS חזיר, להשלים של DMEM / חם F-12 בינוני עם 20% בסרום בנוקאאוט, L- גלוטמין (2 מ&quot;מ), חומצות ממ שאינן חיוניים אמינו (1X), β-mercaptoethanol (0.1 מ&quot;מ), ופניצילין (100 U / ml) / סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר). סינון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 עד 3 שבועות. עם השימוש ראשון, להוסיף bFGF (10 ng / ריכוז סופי מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 6-בארות עם MEFs-נעצר צמיחה פעם אחת עם תאי iPS סרום ללא DMEM / F-12 ולהוסיף 1.5 מיליליטר החזיר הבינוני iPS של בשר חזיר והחזירי (10% מהתאים של צלחת ומחוברות). כל תאים לשטוף יום פעם אחת עם הסרום ללא DMEM / F-1 של בשר חזיר2 ולהוסיף 1.5 מיליליטר בינוני iPS חזיר טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין חיץ ניתוק להוסיף טריפסין 2.5%, IV collagenase (10 מ&quot;ג / מיליליטר), סרום בנוקאאוט (20%) וCaCl 2 (1 מ&quot;מ) לCa 2 + -חינם PBS. לשטוף את תאי פעמיים עם PBS ו דגירה עם חיץ ניתוק במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. העברת תאים לתוך שפופרת 15 מיליליטר, צנטריפוגה 5 דקות ב1,200 סל&quot;ד (300 x ז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי iPS חזירי ב500 μl הבינוני iPS חזיר טרי ולהוסיף 50 μl של ההשעיה ל -1.5 בינוני iPS מיליליטר חזיר בטרי 6-גם עם מזין שכבת MEF. כל תאים לשטוף יום פעם אחת עם סרום ללא DMEM / חזיר טרי בינוני iPS F-12 ולהוסיף 1.5 מיליליטר של בשר חזיר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות חופשית מזין של תאי iPS אדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את הבקבוקון המקורי המכיל את הכנת קרום במרתף על 4 מעלות צלזיוס ולדלל עם סרום ללא DMEM קר כקרח / F-12 8 מ&quot;ג / מיליליטר, aliquot והחנות של בשר חזיר ב -20 ° C עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot של הבסיסהכנת ment קרום על 4 מעלות צלזיוס ולדלל עם DMEM F12 קר כקרח סרום ללא / של בשר חזיר (90 מיקרוגרם / מיליליטר). Pipet 1 מיליליטר של פתרון זה לתרבות מנות 3 סנטימטר ומערבולת בעדינות על מנת להבטיח שכל פני השטח מכוסים. לאטום מנות עם parafilm ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. לפני השימוש לתרבית תאי דגירה מנות למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס או 3 שעות על RT כדי לאפשר פילמור של הכנת הקרום במרתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני לשאוב ממאכלים מצופים בהכנת הקרום במרתף ולשטוף פעמיים עם הסרום ללא DMEM / של בשר חזיר F-12. להוסיף 1.5 מיליליטר בינוני E8 למנה התרבות ותאי iPS אדם (10% מהתאים של צלחת ומחוברות). כל תאים לשטוף יום פעם אחת עם סרום ללא DMEM / F-12 ולהוסיף 1.5 מיליליטר בינוני E8 הטרי של בשר חזיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעבר התאים, לשטוף כלים פעמיים עם PBS ולהוסיף 1 מיליליטר PBS / 0.5 mM EDTA. דגירה המנות במשך 5 דקות על RT. צג התאים תחת מיקרוסקופ. הערה: כאשר המושבות מתחילות לאסוף וappear יש חורים הם מוכנים להעברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הנוזל, להוסיף 1.5 מיליליטר בינוני E8 ולנתק תאים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. העברת תאי שפופרת 15 מיליליטר, צנטריפוגה 5 דקות ב1,200 סל&quot;ד (300 x ז), גלול במדיום E8 500 μl ולהוסיף 50 μl של ההשעיה 1.5 מיליליטר בינוני E8 בצלחת תרבות טרי מצופות בהכנת הקרום במרתף . </li></ol></li></ol> 2. עיצוב של יעד-רצפים בין מינים גבולות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אדם בחר התייחסות, עכברי ורצפי cDNA חזירי של גני המטרה (GAPDH, NANOG, GDF3) ולבצע ניתוח יישור מרובה רצף CLUSTAL. הערה: זה יציין הרצפים הומולוגיים בין מינים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהגדרות הבאות ליישור מרובה: עונש פער (קבוע) 10, עונש פער (משתנה) 5, שקלול מעבר 0, מגוון עונש הפרדת פער 8, זהות% לעיכוב 40, מספר מרבי של חזרות כדי לבצע 3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלח רצפי יעד רצויים ליצרן (ראה טבלה של חומרים) לעיצוב בדיקה וייצור. הערה: היצרן לאחר מכן לאשר תאימות של רצף רצוי עם הטכנולוגיה. אם רצף רצוי אינו תואם, היצרן יציע רצפים אלטרנטיביים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שאזורים הומולוגיים שיכול לשמש כיש רצפי גדיל ללכוד פוטנציאל אורך של 27 נ&quot;ב. הערה: מומלץ להזמין כמה חלקיקים עם גדילי לכידה שונים לגן מטרה נבחרת כמו שרק הניסוי הסלולרי האמיתי ייתן הוכחה מובהקת של הפונקציונליות של רצף בודד. לכן, שני רצפים שונים לGAPDH וGDF3 הוערכו תוך שלושה חלקיקים שונים נבדקו להעריך ביטוי NANOG. מיקומם והרצפים המדויקים כבר פורסמו במקומות אחרים 17. היצרן מסחרי מייצר nanopמאמרים עם רצפים רצויים ומספק אותם בפורמט lyophilized. </li></ol></li></ol> 3. הכינון מחדש של חלקיקים ותוספת לתא תרבויות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן חלקיקי lyophilized עם קבלה על 4 מעלות צלזיוס בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש חלקיקים על ידי תוספת של מים מזוקקים כפולים 50 μl אשר נותנת ריכוז סופי של 100 ננומטר. ברגע מחדש חלקיקי חנות ב RT בחושך. שים לב: במצב זה הם יציבים לשנה אחת לפחות. אחסון של דגימות מחדש על 4 מעלות צלזיוס עלול להשפיע לרעה על יציבותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לדלל את פתרון מניות ננו-חלקיקים עם PBS לריכוז של 2 (HEK 293 תאים) או 8 ננומטר (iPS ותאי גזע עובריים) ביום היישום. הערה: ריכוז זה הוא פי 20 גבוהים מהריכוז הסופי בצלחת התרבות. בתאי גזע עובריים ותאי iPS, 400 בערב של חלקיקים מושרה אות ניאון לזיהוי בקלות מתחת למיקרוסקופ. לתאי HEK 293, AConcentration של 100 PM מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> μl Pipet 12.5 של חלקיקי prediluted למדיום תרבות תא שלם 237.5 μl 24 גם מכיל. לבארות בגדלים שונים, להתאים את הכמויות בהתאם. מערבולת הצלחת בקפידה כדי להבטיח חלוקה שווה של חלקיקים. דגירה תאי הלילה (O / N) על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באווירת humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת לנתח תרביות תאים לקרינת Cy3 גן ספציפי עם גל עירור של 546 ננומטר (פליטה 575-640 ננומטר) תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הערה: התקופה הנדרשת כדי להשיג הקרינה חזקה מספיק עשוי להיות תלוי בסוג התא וגן המטרה. בניסויים אלה, זה היה נראה בין 16 ו -20 שעות לאחר היישום של החללית. </li></ol> 4. אוכלוסיות תאי זיהוי של Cy3 חיובי על ידי הזרימה cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול HEK 293 או תאי גזע עובריים בעכברים באמצעות התנאים המפורטים בסעיף 1.1 או 1.3, respectively. יום אחד לפני ניתוח FACS להוסיף חלקיקי -specific GAPDH בריכוזים שונים לHEK 293 תאים (ראה איור 6 א) וב -400 PM לMurine תאי גזע עובריים. דגירה התאים O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באווירת humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח תרביות תאים לקרינה מושרה Cy3 גן ספציפי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק HEK 293 תאים כמפורט בנקודה 1.1.2. צנטריפוגה, להעביר לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל וגלול ב200 BSA μl קר כקרח PBS / 0.5% / 2 (חיץ FACS) mM EDTA. שמור את התאים חשוכים על קרח עד ניתוח התזרים cytometric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את תאי גזע עובריים בעכברים כמפורט בנקודה 1.3.3. צנטריפוגה, להעביר לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל וגלול ב200 BSA μl קר כקרח PBS / 0.5% / 2 מ&quot;מ EDTA. שמור את התאים חשוכים על קרח עד ניתוח התזרים cytometric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על התאים דרך מסנן 30 מיקרומטר כדי למנוע צבירת תא ולהוסיף יודיד propidium דקות 2 (ריכוז סופי 2 מיקרוגרם / מיליליטר)לפני ניתוח FACS להוציא תאים מתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח תאים Cy3 חיוביים להגדיר שערים היררכיים על FSC-A / SSC-משנה ראשון, FSC-H / FSC-W-משנה ותת SSC-H / SSC-W. השתמש בקדימה וצד הפיזור להוציא פסולת תא ותאים שאינם מפוזרים. תכלול תאים מתים על ידי צביעת יודיד propidium בו מוצגות PE נגד אדום PE-טקסס. בצע את שער הסוג הסופי על תאים חיוביים Cy3-PE (איור 4). </li></ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+adult+rhesus+monkey+fibroblasts.">Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 587-590 (2008).</li><li>Liao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells.">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 11-15 (2009).</li><li>Luo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+leukemia+inhibitory+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor-dependent+induced+pluripotent+stem+cells+from+canine+adult+somatic+cells.">Generation of leukemia inhibitory factor and basic fibroblast growth factor-dependent induced pluripotent stem cells from canine adult somatic cells.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1669-1678 (2011).</li><li>Bao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+ovine+adult+fibroblasts+to+pluripotency+via+drug-inducible+expression+of+defined+factors.">Reprogramming of ovine adult fibroblasts to pluripotency via drug-inducible expression of defined factors.</a> Cell Res. 21 (4), 600-608 (2011).</li><li>Esteban, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+Tibetan+miniature+pig.">Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig.</a> J. Biol. Chem. 284 (26), 17634-17640 (2009).</li><li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+without+Myc+from+mouse+and+human+fibroblasts.">Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.</a> Nat. Biotechnol. 6 (1), 101-106 (2008).</li><li>Maekawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+somatic+cells+is+promoted+by+maternal+transcription+factor+Glis1.">Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1.</a> Nature. 474 (7350), 225-229 (2011).</li><li>Marti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pluripotent+stem+cells.">Characterization of pluripotent stem cells.</a> Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).</li><li>Wada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+gingival+fibroblasts+and+periodontal+ligament+fibroblasts.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human gingival fibroblasts and periodontal ligament fibroblasts.</a> J. Periodontal Res. 46 (4), 438-447 (2011).</li><li>Chan, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+distinguishes+bona+fide+human+iPS+cells+from+partially+reprogrammed+cells.">Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells.</a> Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).</li><li>Singh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+alkaline+phosphatase+substrate+for+identification+of+pluripotent+stem+cells.">Novel alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. Rep. 8 (3), 1021-1029 (2012).</li><li>Kang, N. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cell+staining+and+sorting+with+the+live-cell+fluorescence+imaging+probe+CDy1.">Embryonic and induced pluripotent stem cell staining and sorting with the live-cell fluorescence imaging probe CDy1.</a> Nat. Protoc. 6 (7), 1044-1052 (2011).</li><li>Ban, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+cardiomyocytes+from+differentiating+pluripotent+stem+cells+using+molecular+beacons+targeting+cardiomyocyte-specific+mRNA.">Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons targeting cardiomyocyte-specific mRNA.</a> Circulation. 128 (17), 1897-1909 (2013).</li><li>Seferos, D. S., Giljohann, D. A., Hill, H. D., Prigodich, A. E., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-flares:+probes+for+transfection+and+mRNA+detection+in+living+cells.">Nano-flares: probes for transfection and mRNA detection in living cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (50), 15477-15479 (2007).</li><li>Lahm, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+fluorescent+RNA-based+detection+of+pluripotency+gene+expression+in+embryonic+and+induced+pluripotent+cells+of+different+species.">Live fluorescent RNA-based detection of pluripotency gene expression in embryonic and induced pluripotent cells of different species.</a> Stem Cells. 33 (2), 392-402 (2015).</li><li>Clark, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NANOG+and+GDF3+genes+are+expressed+in+pluripotent+cells+and+map+to+chromosome+12p13,+a+hotspot+for+teratocarcinoma.">NANOG and GDF3 genes are expressed in pluripotent cells and map to chromosome 12p13, a hotspot for teratocarcinoma.</a> Stem Cells. 22 (2), 169-179 (2004).</li><li>Wu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin+of+a+bipotential+myocardial+and+smooth+muscle+cell+precursor+in+the+mammalian+heart.">Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart.</a> Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).</li><li>Reubinoff, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat. Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).</li><li>Yue, T., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+effect+in+receptor-mediated+endocytosis+of+multiple+nanoparticles.">Cooperative effect in receptor-mediated endocytosis of multiple nanoparticles.</a> ACS Nano. 6 (4), 3196-3205 (2012).</li><li>Andersson, L. I., Hellman, P., Eriksson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+endocytosis+of+particles+by+peripheral+dendritic+cells.">Receptor-mediated endocytosis of particles by peripheral dendritic cells.</a> Hum. Immunol. 60 (10), 625-633 (2008).</li><li>Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophages+with+nanoparticles.">Imaging macrophages with nanoparticles.</a> Nat. Mater. 13 (2), 125-138 (2014).</li><li>Prigodich, A. E., Seferos, D. S., Massich, M. D., Giljohann, D. A., Lane, B. C., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-flares+for+mRNA+regulation+and+detection.">Nano-flares for mRNA regulation and detection.</a> ACS Nano. 3 (8), (2009).</li><li>Mehta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-trafficking+of+hERG+reverses+long+QT+syndrome+2+phenotype+in+human+iPS-derived+cardiomyocytes.">Re-trafficking of hERG reverses long QT syndrome 2 phenotype in human iPS-derived cardiomyocytes.</a> Cardiovasc. Res. 102 (3), 497-506 (2014).</li><li>Seftor, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+tumor+cell+heterogeneity:+a+molecular+approach+to+study+subpopulations+expressing+the+embryonic+morphogen+Nodal.">Melanoma tumor cell heterogeneity: a molecular approach to study subpopulations expressing the embryonic morphogen Nodal.</a> Sem. Oncol. 41 (2), 259-266 (2014).</li><li>Khare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PYRIN+domain-only+protein+POP3+inhibits+ALR+inflammasomes+and+regulates+responses+to+infection+with+DNA+virus.">The PYRIN domain-only protein POP3 inhibits ALR inflammasomes and regulates responses to infection with DNA virus.</a> Nat. Immunol. 15 (4), 343-353 (2014).</li><li>Kratz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+expression+profiling+of+the+compartmentalized+translatome+of+Purkinje+neurons.">Digital expression profiling of the compartmentalized translatome of Purkinje neurons.</a> Genome Res. 24 (8), 1396-1410 (2014).</li></ol>

HL קיבל חלקיקים מחברת Millipore EMD ללא תשלום. כל המחברים האחרים מה למסור.

העבודה הנוכחית מתארת ​​את השימוש בחלקיקי הקרינה שכותרת המאפשרים הערכה אמינה של ביטוי גנים תאיים ישירות בתאים חיים ממיני יונקים שונים עם מקור histogenetic מגוון תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גישה זו יש כמה יתרונות בהשוואה לשיטות אחרות שפורסמו. קודם כל החוקר אינו מוגבל ביחס לאו גן המטרה או סוג התא. כל שיטות זיהוי הנוגדן המבוסס מוגבלות לאפיטופ יחיד. למרות שגם יכולות להיות מתוכננות משואות מולקולריות ניאון עבור קשת רחבה של גנים, שיטה זו דורשת הניתוק של תאים ולאחר מכן nucleofection 15. לעומת זאת, היישום של חלקיקי גן ספציפי אינו דורש כל מניפולציה של תא המטרה שבולע חלקיקים באופן פעיל על ידי אנדוציטוזה. במהלך passaging הבא חלקיקי הזהב לעזוב בהדרגה את התאים והתרבות יכולה לשמש בdownstreaניסויים מ &#39;. עם זאת, הטכנולוגיה גם עדיין יש כמה מגבלות. סמנים חלקם ברור שלא לזיהוי בשל אופיים הפחמימות כגון SSEA-1 או TRA-1-81 20. נכון לעכשיו, מערך גדול של חלקיקים הוא זמין באופן מסחרי. חלקיקים אלה שנבדקו מראש על הפונקציונליות שלהם בניסויים סלולריים. מטרת העבודה הנוכחית הייתה לתכנן בדיקות מותאמות אישית שניתן להשתמש בם מעבר לגבולות מינים. כאשר בעקבות גישה כזו או בעת תכנון בדיקה לאחד גן מטרת רומן צריך להיות מודע לכך שהפונקציונליות של סיליקון בחזה בדיקה צריכה להיות מוערכת באופן יסודי במבחנה. הבדיקה NANOG-SF3 אשר הראתה הומולוגיה 100% להומולוגיה ברצף לא עבדה בכל הזמן שNANOG-SF1 עם בסיס אחד תואם בעכברי ורצף חזירי מיוצר אות הקרינה נחמדה. שאלה נוספת מתייחסת לספיגה היעילה של חלקיקים. החלקיקים להיכנסהתאים על ידי אנדוציטוזה, תהליך שמושפע מהגודל של חלקיקים 21, סוג התא ומצב הבידול 22 והיכולת הסלולרית לבצע phago- וmacropinocytosis 23. הריכוז האופטימלי כדי להשיג אות הקרינה מספקת יש להיבדק עבור כל יישום בודד או שורת תאים. לשם כך, הניסוי הראשון תמיד צריך להיות היישום של שליטת הספיגה להעריך את התאימות של הבדיקות בסוגי התאים ותנאי תרבות לפני שעבר ליעד ספציפי זיהוי של ביטוי גנים. נקודה קריטית להשגת תוצאות אמינות בעת החלת פרוטוקול זה לשורת תאי רומן או אוכלוסיית תא היא ההכללה של בקרות נאותות. שליטת הספיגה אי פעם שזורחת בתספק רמז שריכוזים של חלקיקים יגרמו אות ניאון מספיק באוכלוסיית תא המטרה. הקרינה יש להעריךד למחרת כאות לדעוך עם זמן 17. במקביל השליטה לטרוף בלי עמית בגנום אוקריוטים מיושמים בריכוז זהה חייבת לגרום לאות רקע זניחה. כביקורת שלישית מומלץ להשתמש ננו-חלקיקים ספציפיים לגן משק (למשל GAPDH, β-אקטין). חלקיקים אלה משמשים כביקורת חיובית שהגישה יכולה לשמש כדי לזהות ביטוי גנים ספציפי באוכלוסיית תא היעד שנבחרה. אם בקרות אלה להתברר משביע רצון אחד יכול לצפות לקבל אותות ניאון ספציפיים אמין באמצעות חלקיקים ספציפיים לגנים מטרה אחרים. הריכוז של חלקיקים להחיל יכול להיות גם קריטי כפי שהם הוכחו למטה להסדיר את רצף היעד 24. עם זאת, השפעה זו דורשת ריכוזים גבוהים בהרבה (5 ננומטר) מהריכוזים המשמשים בניסויים שהוצגו כאן (400 בערב). בריכוז זה nanoflaמיל אינו משפיע על mRNA גן המטרה או רמות חלבון וריכוזים גבוהים ככל 2 ננומטר אינו פוגע בהתרבות המהירה של תאי גזע עובריים HEK293 ועכבריים 17. בנוסף, ניתוח ביטוי הגנום כולו לא גילה כל שינוי משמעותי בביטוי גני 25. לכן, בריכוזים של עד 1 ננומטר nanoflares לא צריך להציג שום תופעות לוואי חשובות. יישום מבטיח מאוד של טכנולוגיה זו הוא האפשרות לתייג כל אוכלוסיית תא נתון שמסומנת על ידי גן ספציפי. לאחרונה, חלקיקי גן ספציפי בהצלחה נעשו שימוש כדי להכתים סלקטיבי myocytes החי חדרית 26, תת-אוכלוסיות של תאים מלנומה 27, מונוציטים 28 ותא המוח הקטן תרבויות 29. ניתן למיין אוכלוסיות תאים מסומנים הקרינה כזו ומטוהרות על ידי cytometry זרימת תאי חיים כ. בתחום האונקולוגיה זה ניתן להעלות על הדעת לבודד תאי גידול גרורתי בשידור חי במודלים של בעלי חייםהמבוסס על ביטוים של CEA, היקר ביותר לחיפוש של גרורות פוטנציאל קידום גנים או מבני יעד. לאחרונה הראו כי ניתן לזהות מושבות iPS עכברית באמת לתכנות מחדש באתר עם ​​חלקיקי -specific Nanog מבוססים על עוצמת הקרינה זוהתה 17. לכן, זיהוי של מושבות iPS באמת לתכנות מחדש יכול להתבצע על פלטפורמות תפוקה גבוהות, המשתמשות בזיהוי הקרינה רובוטית והתקנים לקטוף לזהות מושבות המבטיחות ביותר. טכנולוגיה זו נראית מתאימה בתחומי מחקר רבים כדי לבחור תת-אוכלוסיות ספציפיות סלולריות ונראה כי ניתן להחיל את חלקיקים בפלטפורמות תפוקה גבוהות. לסיכום, פרוטוקול זה מייצג גישה חדשנית באמצעות חלקיקי הקרינה שכותרת המאפשר זיהוי של ביטוי גנים תאיים ישירות בתאים חיים. טכנולוגיה זו עשויה להיות כלי רב ערך כדי לטהר, להרחיב ואופי נוסףize תת-אוכלוסיות סלולריות נדירות בתחומי מחקר רבים.

בשנת 2006, גישה חדשנית תוארה לתכנת מחדש תאים סומטיים למצב pluripotent. לאחר prescreening של מערך של תכנות מחדש פוטנציאל גורמי fibroblasts עכברי יכולים להיות מומר בהצלחה למה שנקרא בתאי גזע pluripotent מושרה (iPS) על ידי התמרה וביטוי יתר של ארבעה גורמי שעתוק retroviral (Oct4, Sox2, Klf4, ג-Myc) 1. בהמשך טכניקה זו יעילה שוחזרה באמצעות תאים סומטיים של מיני יונקים שונים כולל בני אדם 2, 3 קופים, חולדות 4, 5 כלבים, כבשים וחזירים 6 7. בנוסף, שונו השמטת פרוטוקולים או החלפת גורם שעתוק הפוטנציאלי שעור C- MYC פורסמו 8, 9. ללא קשר לתכנות מחדש הראשוני להתקרב pluripotency האמיתי של מושבות גדלו יש לקבל אישור, משימה מפרכת וזמן רב. חסרון עיקרישל רוב הניתוחים אלו הוא שהם לא יכולים להתבצע על תאי חיים. גורמי pluripotency הוקמו כגון Oct4, Sox2, NANOG או REX1 מייצגים גורמי שעתוק ממוקמים בגרעין וזיהוי שלהם דורש קיבוע של התאים לפני אימונוהיסטוכימיה או תמוגה תא לניתוח RT-PCR 10 -. 12 מכאן ואילך, תאים אלה הולכים לאיבוד לעתיד ניסויים הדורשים תרבויות לשכפל של כל מושבה. לפיכך, טכנולוגיה לנתח pluripotency בתאים חיים רצויה מאוד. אכן יכולים להתבצע במספר גישות ישירות על תאי חיים באמצעות נוגדנים המכוונים נגד אנטיגנים המבוסס על קרום (למשל. TRA-1-60, SSEA4) 12, ניאון דיווחו צבעים כדי לזהות מולקולות phosphatase 13 או קטן אלקליין שדווקא תווית גזע עוברי (ES) ותאי iPS 14. עם זאת, הנוגדנים עשויים בכל זאת להשפיע לרעה על התאים וכל ספידOD מוגבל לסמן pluripotency יחיד. לבסוף, משואות מולקולריות ניאון, oligonucleotides הכפול antisense עם מבני סיכת ראש, המאפשרים צביעת חיות של תאים, תוארו 15. למרות שגישה זו עשויה להיות מיושמת על גנים רבים, הטכניקה דורשת nucleofection של השעיה תא בודדת, אשר אינה חל על מושבות iPS גוברת. לפני כמה שנות חלקיקי גן ספציפי תוארו לנתח ביטוי Survivin בתאי סרטן השד האנושיים SKBR3 16. כתב יד זה מתאר גישה חדשנית לגילוי רומן סמני pluripotency בES החי ותאי iPS באמצעות ננו-חלקיקי זהב conjugates. חלקיקים אלה כוללים חלקיקי זהב מרכזיים עם גדיל ללכוד יחד נושא את רצף RNA המשלים וגדיל כתב שכותרתו Cy3. אות הניאון של גדיל הכתב הוא הרווה ידי חלקיקי הזהב המרכזיים. בנוסף, מתאיםחלקיקים לשמש בקרות שליליות וחיוביות כ, בהתאמה (איור 1). ליישום חלקיקים פשוט הוסיפו למדיום התרבות (איור 2) ולהזין את התאים באמצעות אנדוציטוזה (איור 3). אם RNA היעד מתבטא זה מחליף את גדיל הכתב אשר לאחר מכן פולט אות ניאון. שיטה זו אינה דורשת מניפולציה של תא המטרה והביטוי של גן המטרה יכולה להיות במעקב אופטי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ישירות בתאים חיים. יתר על כן, הטכנולוגיה יכולה להיות מיושמת על כל גן מטרה רצוי בין מינים במקרה של תאי iPS וכך יכולה להיות מועסק בתחומי מחקר רבים ושונים. לבסוף, זרימת cytometric מנתח לאפשר זיהוי והעשרה של תאים חיוביים Cy3.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#39;s F12 medium with stable glutamine</td>
			<td>Biochrome GmbH</td>
			<td>FG4815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose with stable glutamine</td>
			<td>Biochrome GmbH</td>
			<td>FG0435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 107 409 001</td>
			<td>prevents cell division of MEFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia inhibitory factor (107 U/ml)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin/EDTA (1x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>detaches adherent cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>supplement for human and porcine iPS cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>growth factor for human and porcine iPS cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td>dissociation of pig iPS cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05940</td>
			<td>defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartFlare Probes</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>customized item</td>
			<td>detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraCell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine (from porcine skin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6144</td>
			<td>enhances attachment of MEFs to surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (1 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td>labels dead cells in flow cytometric analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Aria Illu</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>A4544</td>
			<td>referred to as device 1 in Figure 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>775213</td>
			<td>referred to as device 2 in Figure 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FloJo vX 10.0.7r2</td>
			<td>Treestar</td>
			<td></td>
			<td>software for analysis of flow cytometry data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of intracellular gene expression in live cells of murine, human and porcine origin using fluorescence-labeled nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

בניסיון ראשון לאמת ולבסס את זיהוי תאיים של ביטוי גנים ספציפי בתאים חיים באמצעות חלקיקים החלטנו לבצע ניסויי טייס באמצעות גן בית השמירה הביע constitutively (GAPDH) בHEK 293 תאים האנושיים. הריכוז של חלקיקים המשמשים בניסויים אלה נבחר על פי ההמלצה של היצרן. התוספת של בדיקה -specific GAPDH למדיום התרבות בריכוז סופי 100 PM המושרה ברורה Cy3 הקרינה בתאים אלה שהיו גלויים לעין תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר O / הדגירה N (איור 5 א). שני פקדים נכללו בניסויים אלו על מנת לבסס את התוצאה. שליטה אחת כוללת של ננו-חלקיקים שנקרא &quot;לטרוף&quot; שבו גדיל הכתב אין רצף התאמה בתאי יונקים או האיקריוטים. ננו-חלקיקי &quot;לטרוף&quot; קובע fluorescen הרקע נוקביםce בשל השפלה בדיקה אפשרית או מרווה שלמה של הקרינה. התוספת של הבדיקה לטרוף מיוצרת אות שולית בלבד ניאון, שהינה זניח (איור 5). שליטה &quot;ספיגה&quot; באופן קבוע שזורחת במסייעת לקבוע את היכולת של תאים לשלב חלקיקים על ידי אנדוציטוזה אשר עשוי להשתנות בין סוגי תאים שונים. חלקיקי שליטה החיוביים אלה מיוצרים אות ניאון בוהקת בHEK 293 תאים (איור 5 ג). לפיכך, את ההיתכנות של הטכנולוגיה להקליט אות ניאון ספציפית של גן תאיים עם אות רקע זניחה אושרה. יש לציין כי ההבדל בין אות הרקע והקרינה הספציפית פוחת עם זמן. עליות הרקע בשל לחקור השפלה או מרווה שלמה בעוד הקרינה הספציפית נמוגה בהדרגה (5D איור). יש לי אותו חלקיקי -specific GAPDHנבדק בתרבויות פיברובלסטים עיקריות של עכברי, חזירי וכבש מקור 17. תאים אלו מייצרים אות רקע גבוהה בהרבה מHEK ​​293 תאים בעוד הקרינה היעד ספציפי היא די חלשה, אולי בשל יכולת השגשוג הנמוכה יחסית של תרבויות אלה. ניסויי פיילוט אלה הניעו אותנו להשתמש בטכנולוגיה זו לצורך זיהוי של ביטוי גני pluripotency בiPS נגזר ממינים שונים. לצורך כך NANOG וGDF3 נותחו, אשר שניהם ידועים להתבטא בתאי pluripotent 18. בתאי iPS הראשונים נובעים מfibroblasts זנב-קצה של קו עכבר מהונדס משפר לב Nkx2.5 19 נחקרו. לשני גני אות ניאון חזק הושגה (איור 6 א) וCy3 הקרינה זניחה של השליטה לטרוף (מידע לא מוצג). תוצאות דומות התקבלו בתאי iPS אנושיים וחזיריים (איור 6B ו- C). חשוב לציין, אות הקרינה הוגבלה למושבות iPS ולא לתייג את fibroblasts משמש כשכבת מזין לעכבר וiPS חזירי (ראה חיצים באיור 6 א ו- C). הניתוח של ביטוי גני NANOG גם גילה שלא כל רצף חזה בסיליקון ולהיות &quot;טוב&quot; סוף סוף הוא פונקציונלי. אחד משלושה עיצובים של חלקיקי -specific NANOG המושרה כמעט ולא אות ניאון דומה לזה של השליטה לטרוף למרות 100% התאמת רצף בתאי iPS עכברי (איור 6 ד). תוצאה דומה התקבלה בתאי iPS של אדם ומקור חזירי עם בדיקה זו (מידע לא מוצג). כך, ניתן להשתמש בננו-חלקיקים כדי לזהות ביטוי גני pluripotency מעבר לגבולות מינים ואילו את הפונקציונליות של כל בדיקה שנועדה צריכה להיות מוערכת מראש. התוצאות המבטיחות של באתרתיוג של תאי חיים בתרבות מנות תא תתבקש לנו לנתח ביטוי גני כמותית ידי cytometry זרימה. לשם כך חלקיקי -specific GAPDH נוספו בריכוזים מדורגים לHEK 293 monolayers כדי להשוות את יעילות התיוג בתוך אוכלוסיית תא המטרה. כפי שהוערך על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקרינה מושרה Cy3 משופר נתפסה עם הריכוז הנמוך ביותר בהשוואה לתאים שלא קיבלו את חלקיקים. ריכוזים הולכים וגדל של חלקיקים מושרה הקרינה ברורה ריכוז תלוי של 293 תאי HEK באתרו (איור 7 א). הכפפת תאים אלה לניתוח התזרים cytometric אישרה את יעילות התיוג תלויה הריכוז. התדירות של תאים חיוביים Cy3 גדלה באופן משמעותי (יותר מ שבעתיים) כאשר הריכוז הגבוה ביותר של חלקיקים יושם (איור 7). בניסויים נוספים ES תאים מלב Nkx2.5קו העכבר מהונדס משפר 19 שימש כדי לנתח את הביטוי של גני pluripotency ידי cytometry זרימה. ניסויי פיילוט עם 400 PM של שליטת הספיגה החיובית הניבו מושבות ES החי חיוביות ברור Cy3 מתחת למיקרוסקופ וcytometry זרימה זוהו כמעט 40% מתאי Cy3 החיוביים (איור 7 ג). לעומת זאת, דומה לתאים שלא טופלו כ 0.1% מתאים שטופלו החיובי לטרוף מוכתם (מידע לא מוצג). כמו כן התוספת של חלקיקים ספציפיים לGAPDH, Nanog וGdf3 מושרה אות הקרינה שונה במושבות בודדות בצלחת תרבית תאים. התדירות של תאים חיוביים Cy3 לGAPDH כפי שנקבעו על ידי cytometry זרימה הייתה דומה לזו שנצפתה בשני גני pluripotency (איור 7 ג). תוצאה זו היא צפויה וכNanog וGdf3 הם חשבו גם לבוא לידי ביטוי constitutively בתאי הגזע העובריים pluripotent. לפיכך, נתונים אלה הזמנה אישית באופן ברורקייט שבתאים לבטא גנים מסוימים יכולים להיות מזוהים על ידי הזרימה cytometric ניתוחים, איכותי ועל ידי הכמות היחסית שלהם. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig1.jpg" /> איור 1: ייצוג סכמטי של המבנה של החלקיקים. מבנה () של ננו-חלקיקי גן ספציפי. ננו-חלקיקים (ב) מירוץ (שליטה שלילית). (ג) ספיגה ננו-חלקיקים (ביקורת חיובית). מעובד מתוך לחם et al. 17, הודפס מחדש באישור מיילי. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig2.jpg" /> איור 2: יישום של חלקיקים לסלולריים תרבויות פתרון מדולל כראוי של חלקיקים הוא pipetted פשוט לתוך מדיום התרבות.. לאחר O / תאי גן ספציפי הדגירה N ניאון גלויים תחת AF<html> מיקרוסקופ luorescent. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig3.jpg" /> איור 3:. תאי ספיגה פעילה של חלקיקים על ידי תאים באמצעות אנדוציטוזה () באופן פעיל לבלוע חלקיקים על ידי אנדוציטוזה (ב) היעד mRNA נקשר לגדיל ללכוד ומחליף את כתב fluorescing.. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig4.jpg" /> איור 4: gating אסטרטגיה לcytometry הזרימה. (א) לאסטרטגיה 293 HEK תאים. (ב) אסטרטגיה לתאי גזע עובריים בעכברים. נתונים נרכשו באמצעות מכשיר 1 לHEK 293 תאים או מכשיר 2 לתאי גזע עובריים בעכברים ונותחו לאחר מכן על ידי כלי תוכנה (ראה טבלה של חומרים). /53268fig5.jpg &quot;/&gt; איור 5:. ניתוח של -expression GAPDH בHEK 293 תאי ננו-חלקיקי -specific GAPDH התווספו לתאים ב 100 PM (ריכוז סופי) וקרינה נרשמה לאחר O / דגירה N () ננו-חלקיקי -specific GAPDH (ב.. ) לטרוף (שליטה שלילית). () ספיגה (שליטת C חיובית). (ד) קינטיקה של לטרוף ושליטה ספיגה. הקרינה נקבעה בנקודתי הזמן שצוינו לאחר תוספת של חלקיקי -specific GAPDH. ברים סולם מייצגים 50 מיקרומטר. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig6.jpg" /> איור 6:. ניתוח של ביטוי גנים בתאי pluripotency iPS של מינים שונים חלקיקים ספציפיים לNANOG או GDF3 נוספו לתאים ב 400 PM (conce הסופיntration) וקרינה נרשמה לאחר O / דגירה N. (א) בתאי iPS Murine. () תאי iPS האדם B. () תאי iPS בשר חזירים C. חצים ב (א) ו- (ג) לייעד תאים מזינים-שכבת פיברובלסטים ללא תווית. פלואורסצנטי (D) בתאי iPS עכברי לאחר תוספת של ננו-חלקיקי SF3 NANOG-העיצוב. ברים סולם מייצגים 50 מיקרומטר. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig7.jpg" /> ניתן לזהות תאים חיים Nanoparticle תווית על ידי cytometry זרימה: איור 7. תדר מבט מיקרוסקופי של HEK החיובי Cy3 293 תאים לאחר תוספת של ריכוזים שונים של ננו-חלקיקים (). (ב) לתאים חיוביים Cy3 נקבעו על ידי cytometry זרימה. צביעה חי של מושבות תאי גזע עובריים בעכברים (C) וקביעת התדירות של Cy3 חיובי תאים. חלקיקים נוספובריכוז סופי של 400 PM. ברים סולם מייצגים 50 מיקרומטר.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles at JoVE.com

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

זיהוי של ביטוי גנים בתאים תאיים חיים של Murine, אדם וחזירי מקור באמצעות חלקיקים שכותרתו פלואורסצנטי

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

detection-intracellular-gene-expression-live-cells-murine-human

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K Views.  Technische Universität München. This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species. 

Video: Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Gene Expression חיידקית ניתוח שימוש microarrays

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי Assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

אלל ספציפי Gene Expression Assay כדי לבדוק את בסיס פונקציונלי של אגודות גנטי

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...