עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי DP2OD008470 מענק NIH. בנוסף, זיכרון RAM נתמך בחלקו על ידי קרנות הניתנים על ידי אוניברסיטת בית הספר למוסמכים נוטרדאם. אנו מודים לצוות המחלקה למדעי הביולוגיה, המרכז הזברה מחקר, והמרכז בתאי גזע משובי רפואה באוניברסיטת נוטרדאם. תודה מיוחדת לחברי מעבדה לעיסוק דיונים על ביולוגית כליות ומשוב המועילות על עבודה זו.

הנהלים לעבודה עם עוברי דג הזברה המתוארת פרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת נוטרדאם. 1. הכנת פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות 50x של התקשורת העובר E3 על ידי ערבוב 73.0 גרם NaCl, 3.15 גרם KCl, 9.15 גרם CaCl 2, ו 9.95 גרם MgSO 4 ב 5 ליטר של מים מזוקקים, ולאחסן ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור culturing של עוברי דג זברה, לדלל את תמיסת 50x המלאה של תקשורת עובר E3 לפתרון עובד 1x עם מים מזוקקים, ולאחר מכן להוסיף 200 μl של מתילן כחול 0.05% לכל 1 ליטר של 1x E3 לפעול כמו פטריות, ולאחסן ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון חסימת פיגמנטציה של התקשורת העובר E3 עם 0.003% 1-פניל-2-thiourea (PTU) על ידי שילוב 40 מ&quot;ל של המניה 50x E3 עם 0.06 מ&quot;ג PTU. ואז להביא את הנפח לסך של 2 ליטר עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את O E3 / PTU / N ב RT כדי לקבל את אבקת PTU אל הפתרון. ואז לאחסן את E3 / PTU בRT. הערה: E3 / PTU יש חיי מדף של כשבוע, ופתרונות ישנים יהיו פחות יעילים חסימת פיתוח פיגמנטציה זחלי דג זברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן ההרדמה של 0.2% Tricaine (MS-222) על ידי הוספת 1 גרם של Tricaine 500 מ&quot;ל מים מזוקקים ולהתאים את ה- pH ל 7.2 עם 1 M טריס, pH 9.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לבצע פתרון methylcellulose 2% עבור הדמיה על ידי הצבת פתרון של E3 1x (לא מתילן כחול), עם 1/10 נפח ה של 0.2% Tricaine הוסיף ב 4 ° C.. הערה: פתרון methylcellulose הוא פתרון עבה, ברור כי משמש כדי לייצב עובר לחיות בעדינות במיקרוסקופ. לאחר המניפולציות מבוצעות העוברים ניתן לכבס ב 1x E3 לפזר את methylcellulose מבלי לפצוע את החיה ולאפשר מיקרוסקופיה בשלבים הבאים באותה הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מקורר 4 ° C, ומערבבים הפתרון 1x E3 / Tricaine במרץ בצלחת ומערבבים ומוסיפים בהדרגה את הכמות המתאימה של מתילאבקת תאית תוך המשך לבחוש במרץ. מוסיפים בהדרגה את אבקת הפתרון למנוע היווצרות של אגרגטים methylcellulose מסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הכל את האבקה מערבבת לתוך תמיסת 2% methylcellulose / E3 / tricaine, מערבבי הפתרון המשולב בחדר הקר ° C 4 O / N. ההערה: הטמפרטורה הקרה היא טובה ביותר עבור המסת האבקה מלאה. אם הפתרון אינו ברור לאחר לילה אחד, ומערבבים במשך יום עבודה נוסף ו / או O השני / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר בועות אוויר מן methylcellulose 2% / E3 / tricaine פתרון, aliquot את התערובת לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל ספין במהירות גבוהה (12,000 XG) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות או עד 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פתרון 2% methylcellulose / E3 / Tricaine ב 4 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. הערה: לפני השימוש, aliquots צריך להיות מחומם מראש ל RT לעבודה עם דגימות דג הזברה. </li></ol> 2. הכנת כלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן כלי מניפולטור העובר, המשמש positioning עובר microinjection, על ידי הצמדת טיפ טעינת ג&#39;ל על קצה מחט לנתח 5 &quot;ישר, ובטוח עם קלטת או דבק מגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן מחטי microinjection באמצעות חולץ מחט, על ידי הנחת ראשון אש מלוטשת 10 זכוכית בורוסיליקט סנטימטר עם נימה לתוך המכשיר ולאבטח את הזכוכית בורוסיליקט ידי הידוק הידיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את זכוכית בורוסיליקט לעצב מחטים דקות-מחודדות. השתמש בהגדרות הבאות: מחממים 540, למשוך 245, מהירות 200, וזמן 125. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחטי מקום בתוך צלחת פטרי, השעיית אותם על רצועת פלסטלינה כדי להגן על טיפי מחט, ולשמור את הכלי הסגור למניעת הצטברות אבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לסיים להכין את המחט עבור microinjections, להשתמש בסכין גילוח או מלקחיים בסדר קצה לחתוך את קצה משך של המחט כדי ליצור טיפ הזרקת זוויתי חד בקוטר של כ 0.05-0.1 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את מגש microinjection, להכין פתרון 1.5% agarose / E3 בתוך 100 מ&quot;ל בבקבוק Erlenmeyer ו לפזר את agarose על ידי חימום E3 לרתיחה במיקרוגל ואז להתקרר ב RT במשך כ -10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הפתרון agarose / E3 מקורר לתוך צלחת פטרי כדי להפוך בסיס עם עומק של כ -0.5 ס&quot;מ. כאשר זה יש הקרושה לשפוך שכבה שנייה עם עומק של כ 0.3 סנטימטרים ולהכניס את התבנית היטב עובר הטרומית ולאפשר agarose כדי לחזק ב RT. הערה: כאשר מכניסים את התבנית לתוך השכבה אגר העליון / E3, הצבת את התבנית לתוך אגר בזווית כדי להקטין את מספר בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מגש microinjection כולו קבע, להרים את העובר הטרומי גם לעצב לאט ובזהירות באמצעות scoopula, ולאחר מכן למלא את המנה עם פתרון ולאחסן E3 על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. עובר כנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת טנקי הזדווגות דג זברה על ידי הצבת מחיצות לתאי הזדווגות וממלאת במי מערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים דג אחד בכל צד של המחיצה שלuch כי כל תא מכיל הזדווגות נקבה אחד ודגי זכר אחד, ומכסה כל תא הזדווגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, להסיר את המחיצות כדי לאפשר השרצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הדגים לאחר כ -30 דקות, ולאחר חזרת המבוגרים לאקווריום, לאסוף העוברים שלהם על ידי העברת מי טנק הזדווגות באמצעות כלי מסננת מתכת-רשת בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המסננת מעל צלחת פטרי ולשטוף עם E3 לאסוף את העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עוברים על 28.5 ° CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עוברים הגיעו 24-26 somite שלב 26, למזוג רוב כלי התקשורת E3 ואז dechorionate על ידי הוספת 100 μl של 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל pronase על כל מנה של עוברים דוגרים צלחת ב RT (23 מעלות צלזיוס) במשך כ 15 דקות. הערה: זה ייקח כ 24-25 שעות מרגע הפריה כלפי העובר להגיע לשלב 24-26 somite אם הם נאספים באופן מתואר וטופח O / N ב 28.5 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הצלחת עםE3 ולאחר מכן מערבולת בעדינות כדי לסלק את chorions מן העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג E3 / pronase ולשטוף את המנה עם 25 מיליליטר של E3 הטרי. צעד לשטוף חזור להסיר את כל pronase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעצור התפתחות פיגמנטציה, למזוג E3 ולהחליף עם 25 מ&quot;ל של טרי E3 / PTU כאשר עוברים הגיעו 24 שעות שלאחר ההפריה. הערה: בניסויים פורשים כמה ימים, להחליף את פתרון E3 / PTU עם תקשורת טריה פעם ביום כדי לשמור על הצלחת נקיה. </li></ol> 4. Microinjection של פתרון Nephrotoxin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הזרקה, להכין את פתרון nephrotoxin הרצויה יחד עם השליטה ברכב המתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס או ומערבבים בעדינות כדי להבטיח את התרופה (ים) הוא / הם בתמיסה, בדיקת צידי הצינור העליון של עמודת המים. הערה: פתרונות Nephrotoxin ניתן להכין להכיל כמויות זעירות של dextran מצומדות fluorescently לפקח יעילות microinjection וגם להעריך פינוי כלייתי ב subseqזמן uent מצביע 20,28. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מחט microinjection גזוז עם ~ 2-3 μl של nephrotoxin ידי השחלה טיפ טעינת ג&#39;ל בסדר לחלק האחורי של המחט להשעות את המחט בצורה אנכית עם חתיכת סרט לאפשר הפתרון למלא את קצה המחט גזוז על ידי כוח הכבידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שקצה המחט מלא, לאבטח את המחט הטעונה micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את נפח microinjection ידי הצבת טיפה של שמן מינרלי לשקופית מיקרומטר ולהזריק לתוך השמן כדי להעריך את גודל טיפה. נפח הזרקה של 500 pl בעל קוטר של 0.1 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים את המאפה של עוברים מן החממה, להרדים ידי הוספת כ 5 מ&quot;ל של Tricaine 0.2% כדי בצלחת העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח הרדמה מלאה, לגעת העובר בעדינות עם קצה של כלי מניפולטור העובר. חוסר התנועה מצביע הרדמה מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרדמה מוצלחת, להעביר עובר אל עובש ההזרקה עם transfפיפטה אה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתמרן כל עובר לתוך באר שונה של עובש נחת הראש באזור העמוק ביותר של כאלה היטב כי המטען נח לאורך השקע ואת הזנב מזדקר אל מחוץ למיתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט המלאה לתוך micromanipulator ומקם את קצה המחט ליד עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס בעדינות את המחט לתוך כלי הזנב על ידי הזזת הג&#39;ויסטיק קדימה על דוושת הרגל כדי לספק את microinjection. הערה: זריקה מוצלחת תעיד על ידי צפייה הנוזל להיכנס במחזור. יתר על כן, שיתוף הזרקה של nephrotoxicant עם dextran מצומדות fluorescently מאפשרת לחוקר לאמת זריקה מוצלחת לאחר ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך בעדינות בחזרה על הג&#39;ויסטיק כדי להוציא את המחט מן העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקה, להעביר את העוברים כדי בצלחת נקיה ולשטוף להסיר את Tricaine ולהחליף עם E3 טרי / PTU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה העובר לנקודת הזמן הרצוי כדי ישבניםמורפולוגיה של, אשר יכול להיות מתועד על ידי צילום תקשורת הרכבת methylcellulose, או תהליך לניתוח הניסיון כרצונכם. הערה: שחזור של עוברים יש לבחון כדי לקבוע את אחוז האנשים עם בצקת, אשר מציינת פגיעת כלייתית נפוצה. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

מספר רחב של סוכנים טיפוליים קושר עם AKI 29. היו מקדמות מחקר משמעותי בהבנת הנזק הנגרמת על ידי תרכובות בודדים רבים, כגון גנטמיצין aminoglycoside 30 ו ציספלטין כימותרפיות בשימוש נרחב 31,32. שינויים פתולוגיים מסוימים מעורבים בתנאים אלה, עם זאת, להישאר בנושא של מחקר מ...

AKI הוא אובדן פתאומי של בתפקוד הכליות, אשר יכול להוביל לתוצאות הרסניות לבריאות 1. AKI הוא נושא בריאות משמעותי ברחבי העולם בשל שכיחותה הגבוהה של כ -20% בקרב חולים מאושפזים, עם אף גבוהים יותר שיעורים 30-50% במקרים בטיפול נמרצים והקשישים, ושיעורי תמותה של 50-70% 1-3. למרבה הצער, השכיחות של AKI גדלה והוא צפוי להסלים עוד יותר בעשור הקרוב, בין שאר כתוצאת המגוון של גורמים שיכולים לגרום AKI, הכולל שלאחר ניתוח מתח, איסכמיה, וחשיפת nephrotoxins כגון אנטיביוטיקה תרופות כימותרפיות 4. AKI כרוך ניזק לתאים פתאומי בתוך הכליה, שכיח ב nephrons, שהן היחידות הפונקציונליות החיוניות, והם מורכבים של מסנן דם וכן אבובית מפולחת המנקזת שתנו לתוך צינוריות איסוף מרכזיות 1. כאשר מספר לא מבוטל של nephrons הואניזוק במהלך AKI, ההשפעות המיידיות כוללות הפרעה בסילוק פסולת מהמחזור, ואת זרימת נוזל מופחת או בוטלו באמצעות nephrons עקב חסימה מתאי מתים וגוססים 1. במשך הזמן, חסימה צינורי יכול להוביל לניוון של nephrons כולו, אשר מפחית 1 תפקוד כלייתי לצמיתות. שינויים פיסיולוגיים הכליה הבאה AKI גם הקשורות בתופעות דלקתיות מורכבות שיכולים להוביל צלקות כרוניות 1. למרות התוצאות הללו, nephrons יש כמה היכולת לעבור התחדשות לאחר AKI כי reconstitutes 5,6 אפיתל צינורי. אמנם יש כבר הבנה מולקולרית גדל והולך של התחדשות נפרון, המנגנונים להישאר חמקמקה לגבי רבים מחייבים המשך חקירה 7. המידה שבה AKI גורם לנזק כלייתי קבע גם נותר עלום. המחקר הנוכחי מצביע על פוטנציאל ההתחדשות עבור הכליה הואגבוה ביותר בעקבות מקרים חמורים פחות של AKI, בעוד יותר פרקים בולטים או חוזרים להוביל מחלת כליות כרונית (CKD) ותסתיים ב סופנית מחלת כליות (ESRD) הדורש השתלת מצילות חיים או דיאליזה 8,9. בנוסף, אנשים שכבר סובלים CKD נמצאים בסיכון גבוה עוד יותר להידבקות פרק חמור של AKI 8,9. יחדיו, ברור שהמשך מחקר בסיסי וקליני חיוני להבין, לטפל ולמנוע AKI. מחקר במודלים של בעלי חיים כבר סייע להעריך את ההתקדמות של שינויים מקומיים וסביבתיים המתרחשים במהלך AKI 10. כדי להרחיב את ההבנה הזאת, כמו גם לפתח טיפולים חדשים, במודל חיה דג הזברה כבר המועסקים במגוון דרכים 11,12. Nephrons של הכליה דג הזברה, בשני העובר מבוגר, להציג רמה גבוהה של שימור עם יונקים 13-16. יתר על כן, פגיעה אפיתל נפרון ב zebrafish דומה לתהליך חוליות גבוהות, לפיה ההרס המקומי של תאים צינורי ואחריו התפשטות intratubular ואת הקמתה מחדש של נפרון אדריכלות 17-19. בעובר, אולם ניזק אבובית נרחב מן nephrotoxins כמו ציספלטין קשור קטלני 20,21. לשם השוואה, מבוגרי דג זברה לשרוד AKI ולהציג יכולות משובים מהותיות הכליות. כך למשל, בעקבות החשיפה גנטמיצין אנטיביוטי aminoglycoside, דג הזברה להתחדש נזק אפיתל אבובית ולגדול יחידות נפרון חדשים וכן 22-24. בעוד גנטמיצין הנגרמת אלה מחקרים AKI סיפקו מידע שלא יסולא בפז, להבנת נזק כלייתי מ nephrotoxins מגוונים נותר קריטי להעריך את ההשפעות בתגובה סוגים שונים של נזק 25. עובר דג הזברה, בשל גודלו, שקיפות עקיבות גנטיות, יש יתרונות רבים ללימודי nephrotoxin &lt;sup&gt; 25, שבהם השיטה של microinjection 20,21 משמשת לניהול המולקולה (ים) לחקירה. Nephrons נוצרות על ידי הפריה 24 שעות שלאחר (hpf) ומתחילים לסנן דם בכ 48 hpf 26,27. לפיכך, ההיווצרות המהירה והתפקוד של הכליה העוברית מאפשרים ניתוח הניסיון. עם זאת, תהליך של microinjection יש אתגרים טכניים ויש יכול להיות עקומת למידה תלולה מאסטרינג טכניקה. במאמר זה וידאו, אנו מתארים כיצד לבצע microinjections ולספק עצות לפתרון בעיות כדי להגביר את שיעור זריקות מוצלחות.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01652</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00366</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)</td><td>Fluka Analytical</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;(microinjection tray) 150 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Low Temperature Incubator</td><td>Fischer Scientific</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Tweezer</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>Micrometer</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>2280-24</td><td></td></tr></tbody></table>

nephrotoxin microinjection in zebrafish to model acute kidney injury

הכליות הן רגישות לפגוע מחשיפה לכימיקלים שהם לסנן ממחזור הדם. זה יכול להוביל לפציעת איבר הקשורים ירידה מהירה בתפקוד הכלייתי ופיתוח של התסמונת הקלינית המכונית אי-ספיקת כליות חריפה (AKI). סוכנים תרופתיים המשמשים לטיפול נסיבות רפואיות החל זיהום חיידקים לסרטן, כאשר מנוהלים בנפרד או בשילוב עם תרופות אחרות, יכולים ליזום AKI. דג זברה היא מודל חיה כדאי ללמוד את ההשפעות הכימיות על תפקוד כלייתי in vivo, כפי שהם יוצרים כליה עוברית המורכבת מיחידות פונקציונליות נפרון כי הם משומרים עם חוליות גבוהות, כולל בני אדם. יתר על כן, דג זברה יכול להיות מנוצל כדי לבצע מסך גנטי וכימי, המספק הזדמנויות להבהיר את ההיבטים התאיים ומולקולריים של AKI ולפתח אסטרטגיות טיפוליות כגון זיהוי של מולקולות כליה. הנה, אנחנו מדגימים microinjection איך לתוךעובר דג זברה יכול להיות מנוצל כפרדיגמה מחקרי nephrotoxin.

תחנת microinjection להגדיר כולל סטראו, micromanipulator ו ווסת לחץ (איור 1 א). שקוף של צלחת ההזרקה עדיפה להציג דגימות במהלך הליך זה (איור 1 ב). הכנת מחט הזריקה כרוכה משייכת הזכוכית בורוסיליקט המתאימה, ולאחריו הכנת הקצה עם חיתוך ולבסוף חזרה טעינה את ה...

Watch this Scientific Journal Video about Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury at JoVE.com

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

פציעות כליות הנגרמות nephrotoxins, הכולל תרופות החל אנטיביוטיקה כימותרפיות, שיכולות לגרום להפרעות מורכבות בפתוגנזה ששרידיו מובנים. פרוטוקול זה מדגים כיצד דג הזברה יכול לשמש בסיס לפיתוח מודלים למחלות של תנאים אלה, אשר יכול להיות מיושם על זיהוי של צעדים renoprotective.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

nephrotoxin-microinjection-in-zebrafish-to-model-acute-kidney-injury

Research

JoVE Journal

Biology

8.8K Views.  University of Notre Dame.  פציעות כליות הנגרמות nephrotoxins, הכולל תרופות החל אנטיביוטיקה כימותרפיות, שיכולות לגרום להפרעות מורכבות בפתוגנזה ששרידיו מובנים. פרוטוקול זה מדגים כיצד דג הזברה יכול לשמש בסיס לפיתוח מודלים למחלות של תנאים אלה, אשר יכול להיות מיושם על זיהוי ש...

Video: Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Developmental Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

השתלה של מח כליות שלמים דג הזברה למבוגרים

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

בדיקת חסמים פיזיולוגיים להעברת נגיפי ב כנימות שימוש Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

גישה אבולרית מדויק עבור דוגמנות פגיעה בכליות חריפה בפיתוח דג הזברה

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinjections תוך ורידי של הזחלים דג הזברה לחקר פגיעה כליות חריפה

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

מודל פגיעה בכליות חריפה המושרה על ידי ציספלטין בדג זברה למבוגרים

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Medicine

Intravenous Microinjection of Nephrotoxins into Zebrafish Embryo: A Technique to Deliver Nephrotoxic Agents into the Bloodstream of Zebrafish Embryo

Source: McKee, Robert A. et al. <a href="https://www.jove.com/video/54241" target="_blank">Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the intravenous microinjection of nephrotoxins into the tail vein of a zebrafish embryo to study their chemical effects on renal function.

מיקרו-הזרקה תוך ורידית של נפרוטוקסינים לעובר דג זברה: טכניקה להעברת חומרים נפרוטוקסיים לזרם הדם של עובר דג זברה

Source: McKee, Robert A. et al. Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the ...