עבודה זו נתמכה על ידי INSERM, אוניברסיטת ליל 2, MEDIALZ, LabEx (מעבדה מצוינות תכנית, להשקיע לעתיד) וDISTALZ (פיתוח של אסטרטגיות חדשניות לגישה תחומית למחלת אלצהיימר). FJ.FG הוא כיום מלגת נמען של ANR (צרפתית הסוכנות לאומית למחקר / NeuroSplice דה טאו Projet ANR-2010-BLAN-1114 01), אבל עבודה זו הייתה גם תחת התמיכה של מענק מJCCM (ספרד).

1. Homogenization והפקת חלבון סה&quot;כ מרקמת המוח אנושית ומאוסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המגון רקמת מוח. Homogenize רקמת המוח 10% (w / v) ב8 M אוריאה, 2 M thiourea ו1% w / v חיץ SDS (UTS) באמצעות זכוכית הקדר (עבור דגימות אנושיות) או homogenizer טפלון (עבור דגימות עכברים). Sonicate ב60 הרץ 30 פולסים עם גנרטור אולטרסאונד החלת 0.5 שניות להתפרקות מוחלטת רקמת 13, 14. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז חלבון עם assay ברדפורד, באמצעות ארגון ה-BSA כסטנדרט. זה UTS חילוץ חיץ הוא תואם לחלוטין עם הממד SDS-PAGE אחד כל עוד lysates אינו מעל מחומם כדי למנוע carbamylation 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1% (w / v) של Amberlite דגירה עם ערבוב עדין ב10 דקות בטמפרטורת חדר. לאחר מכן לסנן על 0.22 מיקרומטר מסנני מזרק ולבסוף מוסיף SDS לפתרון האוריאה / thiourea. צעד זה מפחית את כמות חומצת שתן וחומצת isocyanic, אשר נמצאות בequilibrium עם אוריאה בפתרון ולהקל על השפלתה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משקעים חלבון כלורופורם / מתנול. משקע בין 100-150 מיקרוגרם של חלבון ל11 סנטימטר רצועות IPG ​​ו1-1.5 מ&quot;ג ל18 אלה סנטימטר (באופן עצמאי בטווח pH נבחר לבצע IEF). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל הצעדים על קרח או על 4 ° C. כלורופורם מגניב ומתנול על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני שמתחיל את ההליך המשקעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שלושה כרכים של מתנול ונפח אחד של כלורופורם לכרך אחד של lysate UTS. לנער באופן ידני את התערובת ולהוסיף שלושה כרכים של מים קרים. וורטקס בדקות 1 ו גלולה את החלבונים על ידי צנטריפוגה ב12,000 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant באמצעות פיפטה פסטר ולהוסיף שלושה כרכים של MeOH הקר. מערבולת שוב וצנטריפוגות ב XG 12,000 במהלך 30 דקות ב 4 ° C. לבסוף להשליך supernatant ויבש גלולה תחת N 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של חלבונים לניתוח 2D.Resuspend את הכדור מיובש חלבון 2D-החיץ (8 M אוריאה, 2 M thiourea השלים עם בחורים 4%). שטוף את הפתרון עם Amberlite כפי שצוין לעיל ומנסה לשמור על חלקם של 500 מיקרוגרם חלבון לכל 200 μl של חיץ 2D עבור 2D-DIGE. הערה: חיץ 2D ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס או נשמר על 4 מעלות צלזיוס במהלך שבוע אחד (כדי למנוע השפלה אוריאה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate ולאחסן דגימות ב-80 ° C עד ביצוע הצעד הבא. ראוי לציון, פרוטוקול זה יכול לשמש לאחר solubilization חומצה פורמית של חלבון אגרגטים 10. בקצרה, יתאדה חומצה פורמית תחת N 2 ו resuspend את הכדור כפי שתואר. </li></ol></li></ol> 2. 2D-DIGE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות לבדוק את האיכות. דגימות מינון שוב בשיטה ברדפורד. לדלל 15 מיקרוגרם של חלבונים במאגר LDS מדגם, חום על 37 מעלות צלזיוס 15 ולטעון על גבי ג&#39;לים polyacrylamide 4-12%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים Coomassie. כתם ג&#39;ל polyacrylamide עם 0.1% (w / v) CoomassieBlue-G-250, 50% EtOH ו10% (v / v) פתרון חומצה אצטית במשך שעה לפחות 1. בואו רקע destain הלילה ב -7% חומצה אצטית ו10% (v / v) פתרון אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג טרום electrophoretic של דגימות. קודם לביצוע תיוג לצבוע cyanine, לאמת את ה-pH של המדגם, שאמורה להיות בסיסיים או אפילו ניטראלי מאז החלפת N-hydroxysuccinimide היא יעילה יותר ב-pH הבסיסי וניתנה להיות אופטימלי ב-pH 8.6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית מינימאלית שתי דוגמאות של מחקר עם צבעי ניאון Cy3 או Cy5 עם יחס של 50 מיקרוגרם protein/400 צבע pmol ולשמור עבור שעה 1 ב 4 ° C בחושך כדי להקל על קבוצת אסתר תגובתי NHS של cyanines עם אמין unprotonated קבוצות של lysines. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפחית וריאציות מדגם ביצוע תיוג צולב עם צבעי Cy3 וCy5, הימנעות צימוד מועדף של מדגם אחד לcyanine מסוים. שים לב שהתיוג המינימלי cyanine צבען יכול להיות מותאם לכמות קטנה של חלבונים עם שמירה על היחס של 1 מיקרוגרם יחסי ציבורotein ל8 cyanine לצבוע pmol. אם כן, מערכת המיני 2DE יכולה לשמש במקום מערכת ג&#39;ל 2D הגדולה. זה יאפשר ניתוח 2D-DIGE לכמות קטנה של רקמת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית בריכה של שני הדגימות עם אותה הכמות של חלבון (50 מיקרוגרם בסך הכל) עם פלורסנט לצבוע Cy2 ומשמש כסטנדרט פנימי. השתמש באותם תנאים כפי שצוין קודם לכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם μl סך נפח 350 עם חיץ 2D המכיל 1.1% מגיב Destreak, .1.2% של חיץ IPG ועקבות כחול bromophenol 150 מיקרוגרם הכולל של חלבונים שכותרתו (50 מיקרוגרם של Cy2, 50 מיקרוגרם של Cy3 ו50 מיקרוגרם של Cy2). לבצע שלב זה בארבעה באמצעות ארבע רצועות עצמאיות. יתר על כן, להכין שתי רצועות נוספות שאינו מסומנות (אחד עבור כל דגימה) עם 350-450 מיקרוגרם של חלבון לג&#39;לי preparative. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את שש הרצועות טעונות מכוסות בלילה שמן מינרלים להחזרת נוזלים פסיביים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Isoelectrofocusing. לבצע את IEF ב206; ג לpH 3-11NL, 18 סנטימטר להפשיט את הפרוטוקול הוא: הגדרה נוכחית המרבית היא 50 μA / רצועה במהלך 8 שלבים: 1) 150 V צעד במשך שעה 1, 2) 200 V צעד במשך שעה 5, 3) 500 V שיפוע עבור 2 שעות,, 5) 2,000 שיפוע לשעה 2, 6) 4,000 שיפוע לשעה 2, 7) 8,000 שלב 4) שיפוע 1,000 V עבור שעה 2 V V V שיפוע עבור שעה 2 ו -8) עבור סכום כולל של 24,000 V · hr . לאחר IEF, לשגר את עודף שמן מינרלים באמצעות נייר כרומטוגרפיה ולאחסן את הרצועות ב-20 ° C עד הממד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IPG רצועות איזון. לאזן רצועות ב6 M אוריאה, 2% SDS, 30% גליצרול, 50 מ&quot;מ טריס-HCl pH חיץ 8.6 עם 1% מDTT במהלך 15 דקות ואחרי 4.7% מiodoacetamide באותו החיץ אך ללא DTT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממד שני או אלקטרופורזה-SDS. להפוך את ששת ג&#39;לי-SDS 12% (1.5 M טריס-HCl pH 8.6, 12% acrylamide / bisacrylamide, 0.1% (w / v) SDS, 0.072% (w APS / V) ו0.1% (v / v) TEMED ) באותו הזמן באמצעות מערכת 2D גדולה, עם ארבעה לוחות זכוכית נמוכה הקרינה לstriנ.ב. עם דגימות הקרינה ושני לוחות זכוכית אחרים עם 1.5 מ&quot;מ של עובי לג&#39;לי preparative כדי שיחתכו את כתמי החלבון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את שש רצועות IPG ​​בחלק העליון של ג&#39;לים ושוב שכבתי עם 0.5% (w / v) של agarose. מאגר פועל מורכב מ25 מ&quot;מ טריס, גליצין 192 מ&quot;מ ו0.1% (w / v) SDS. לבצע את ההגירה ב2.5 W / ג&#39;ל לילה עם מערכת קירור להגדיר עד 4 ° C 16,17. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת תמונות הקרינה וניתוח. השתמש בסורק טיפון 9400 להשיג תמונות ג&#39;לי הקרינה (12 תמונות לניסוי אחד). סריקת Cy2, תמונות Cy3 וCy5 עבור כל ג&#39;ל ב488/520 ננומטר, 532/580 ננומטר ו630/670 עירור ננומטר / אורכי גל פליטה, בהתאמה. השתמש בתוכנת informatic כדי לנתח את התמונות. הנתונים מייצגים את השינויים של נקודת נפח הקשורים להפצה של האות על פני ארבעה ג&#39;לי בין שני המדגמים שנחקרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים Coomassie לג&#39;לים גדול. תקן את ג&#39;לי preparative ב50% (v / v) EtOH ו -3% (v / v) פתרון חומצה זרחתית לפחות 24 שעות. ואז אחרי, לשטוף פעמיים עם מים טהורים במיוחד עבור 20 דקות. בצע צבעוניות ב34% (v / v) MeOH, 17% (w / v) אמוניום סולפט ו -2% חומצה זרחתית ל1 שעות לפני הוספת 0.1% (w / v) Coomassie הכחול G-250. שמור את ג&#39;לי בצבע לפחות 48 שעות וdecolorized במים טהורים במיוחד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקודות לזיהוי טרשת נפוצה. ברגע שתמונות הקרינה מנותחות, התוכנה מספקת רשימה של נקודות הביטוי שלו הוא שונה מבחינה סטטיסטית. ידני בלו הכתמים האלה מג&#39;לי preparative. הליך זה דורש תרגול וקצת מיומנות ידנית כדי למנוע זיהום קרטין. ואז אפשר לשמור דגימות במים ב-20 ° C עד שליחה לטרשת נפוצה. זיהוי נקודה הוא תואם לחלוטין עם ספקטרומטריית טנדם מסה (MS / MS) ואת הרלוונטיות של זהויות חלבון נשפט על פי הסתברות ציון Mowse מבוסס מחושב עם p-value של 0.05 (p &lt;0.05) 18. </li> &lt;/ Ol&gt; </li></ol> 3. Assay מיני 2DE האיכותי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend של מדגם חלבון במאגר 2D המרבי 100 מיקרוגרם עד נפח סופי של μl 200 לרצועת IPG ​​11 סנטימטר. במקרה של מערכת ביטוי יתר או חלבון מטוהר, הסכום ההתחלתי יכול להיות הוריד ל20 מיקרוגרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 1.1% (v / v) Destreak מגיב, 0.55% (v / v) חיץ IPG ועקבות כחול bromophenol לנפח סופי של μl 200. ואז, מערבולת, לעשות מהר ספין ולטעון לתוך רצועת IPG ​​להחזרת נוזלים פסיביות (להביא את הרצועה לעובי המקורי שלו) לילה מכוסה בשמן מינרלים. הערה: חלקם של חיץ IPG הוא זהה עבור כל המרווח של pH הרצוי (pH 3-11, 4-7, 7-11, וכו &#39;), אבל ההרכב שלה משתנה בפונקציה של טווח ה-pH שנבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Isoelectrofocalisation. בצע IEF ב20 ° C. משך התכנית תלוי במרווח ה-pH שנבחר. ראויים לציון, פרמטרים כגון electroendosmosis עלול להפריע לפרופיל IEF, ובמקרים אלה,אופטימיזציה בזמן electrofocalisation נדרש 19. שים לב: זה לא בהכרח IEF יותר שמספק תוצאות טובות יותר, אבל לקצר את הזמן של IEF יכול גם לשפר את הרזולוציה. לאחר IEF, ניתן לאחסן את רצועות IPG ​​ב -20 מעלות צלזיוס במשך חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IPG רצועות איזון. לאזן את הרצועות במאגר המכיל 25 מ&quot;מ טריס-HCl pH 6.8, 20 מ&quot;מ DTT, גליצרול 10%, 5% SDS, 0.05% כחולים bromophenol. לעשות שלושה איזון מתרחץ במשך 15 דקות עם שינוי פתרון החיץ בין כל אמבטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SDS-PAGE. שכבת רצועת IPG ​​על ג&#39;ל טרומי (+1 כן, רצועת IPG ​​11 סנטימטר IPG) עם אחוז polyacrylamide נבחר בהתאם לMW של החלבון של עניין. לאחר מכן, למחוק את הג&#39;ל על גבי קרום ניטרוצלולוזה / PVDF ב100 mV במהלך 33 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הלילה עם הנוגדן הנדרש ולדמיין על ידי פעילות peroxidase. לבצע יישור של immunoblots באמצעות פוליפפטידים שאינם קשורים מתגלים על ידי הנוגדנים משני. להגיע חצי quantitative ניתוח על ידי צפיפות של הנפח ועצימות לעקבות / כתמים עם תוכנת ImageJ. </li></ol>

<ol>
	<li>Collins, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grand+challenges+in+global+mental+health.">Grand challenges in global mental health.</a> Nature. 475, 27-30 (2011).</li><li>De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Bu&#233;e, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , 449-468 (2011).</li><li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins.">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J Biol Chem. 250, 4007-4021 (1975).</li><li>Riederer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-covalent+and+covalent+protein+labeling+in+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis.</a> J Proteomics. 71, 231-244 (2008).</li><li>Marouga, R., David, S., Hawkins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+DIGE+system:+2D+fluorescence+difference+gel+analysis+technology.">The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology.</a> Anal Bioanal Chem. 382, 669-678 (2005).</li><li>Westermeier, R., Scheibe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Difference+gel+electrophoresis+based+on+lys/cys+tagging.">Difference gel electrophoresis based on lys/cys tagging.</a> Methods Mol Biol. 424, 73-85 (2008).</li><li>Gong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ventral+furrow+morphogenesis:+a+proteomic+analysis.">Drosophila ventral furrow morphogenesis: a proteomic analysis.</a> Development. 131, 643-656 (2004).</li><li>Gharbi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two-dimensional+differential+gel+electrophoresis+for+proteomic+expression+analysis+of+a+model+breast+cancer+cell+system.">Evaluation of two-dimensional differential gel electrophoresis for proteomic expression analysis of a model breast cancer cell system.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 91-98 (2002).</li><li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+pathology+modulates+Pin1+post-translational+modifications+and+may+be+relevant+as+biomarker.">Tau pathology modulates Pin1 post-translational modifications and may be relevant as biomarker.</a> Neurobiol Aging. 34, 757-769 (2013).</li><li>Bretteville, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+electrophoresis+of+tau+mutants+reveals+specific+phosphorylation+pattern+likely+linked+to+early+tau+conformational+changes.">Two-dimensional electrophoresis of tau mutants reveals specific phosphorylation pattern likely linked to early tau conformational changes.</a> PLoS One. 4, 4843 (2009).</li><li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+characterization+of+paired+helical+filament-tau+from+Alzheimer's+disease:+demonstration+of+an+additional+74-kDa+component+and+age-related+biochemical+modifications.">Two-dimensional characterization of paired helical filament-tau from Alzheimer's disease: demonstration of an additional 74-kDa component and age-related biochemical modifications.</a> J Neurochem. 69, 834-844 (1997).</li><li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+distribution+of+phosphorylated+tau+protein+isoforms+in+Alzheimer's+and+Pick's+diseases.">Different distribution of phosphorylated tau protein isoforms in Alzheimer's and Pick's diseases.</a> FEBS Lett. 412, 578-582 (1997).</li><li>Rabilloud, T., Luche, S., Santoni, V., Chevallet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergents+and+chaotropes+for+protein+solubilization+before+two-dimensional+electrophoresis.">Detergents and chaotropes for protein solubilization before two-dimensional electrophoresis.</a> Methods Mol Biol. 355, 111-119 (2007).</li><li>Wrobel, K., Caruso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+procedures+for+characterization+of+arsenic+and+selenium+species+in+complex+samples+utilizing+coupled+techniques+with+mass+spectrometric+detection.">Pretreatment procedures for characterization of arsenic and selenium species in complex samples utilizing coupled techniques with mass spectrometric detection.</a> Anal Bioanal Chem. 381, 317-331 (2005).</li><li>McCarthy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbamylation+of+proteins+in+2-D+electrophoresis--myth+or+reality.">Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis--myth or reality.</a> J Proteome Res. 2, 239-242 (2003).</li><li>Chafey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+beta-catenin+activation+in+mouse+liver+by+DIGE+analysis+identifies+glucose+metabolism+as+a+new+target+of+the+Wnt+pathway.">Proteomic analysis of beta-catenin activation in mouse liver by DIGE analysis identifies glucose metabolism as a new target of the Wnt pathway.</a> Proteomics. 9, 3889-3900 (2009).</li><li>Kahn, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomic+analysis+of+blood+eosinophils+reveals+redox+signaling+modifications+in+patients+with+FIP1L1-PDGFRA-associated+chronic+eosinophilic+leukemia.">Comparative proteomic analysis of blood eosinophils reveals redox signaling modifications in patients with FIP1L1-PDGFRA-associated chronic eosinophilic leukemia.</a> J Proteome Res. 10, 1468-1480 (2011).</li><li>Pottiez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+electrophoresis-+and+chromatography-based+determination+of+gene+expression+profiles+in+bovine+brain+capillary+endothelial+cells+after+the+re-induction+of+blood-brain+barrier+properties.">A large-scale electrophoresis- and chromatography-based determination of gene expression profiles in bovine brain capillary endothelial cells after the re-induction of blood-brain barrier properties.</a> Proteome Sci. 8, 57 (2010).</li><li>Stochaj, W. R., Berkelman, T., Laird, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+2D+Gel+Electrophoresis+with+Immobilized+pH+Gradients:+IPG+Strip+Equilibration.">Preparative 2D Gel Electrophoresis with Immobilized pH Gradients: IPG Strip Equilibration.</a> CSH Protoc. , (2006).</li><li>Azimzadeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+proteome+analysis+using+gel-free+and+gel-based+proteomics.">Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics.</a> J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).</li><li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+p16-Arc+subunit+of+the+Arp+2/3+complex+as+a+substrate+of+MAPK-activated+protein+kinase+2+by+proteomic+analysis.">Identification of the p16-Arc subunit of the Arp 2/3 complex as a substrate of MAPK-activated protein kinase 2 by proteomic analysis.</a> J Biol Chem. 278, 36410-36417 (2003).</li><li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+thiourea+to+increase+the+solubility+of+membrane+proteins+in+two-dimensional+electrophoresis.">Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis.</a> Electrophoresis. 19, 758-760 (1998).</li><li>Molloy, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+membrane+proteins+by+differential+solubilization+for+separation+using+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 19, 837-844 (1998).</li><li>Ericsson, C., Peredo, I., Nister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protein+extraction+from+cryopreserved+brain+tissue+samples.">Optimized protein extraction from cryopreserved brain tissue samples.</a> Acta Oncol. 46, 10-20 (2007).</li><li>Shaw, M. M., Riederer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+for+two-dimensional+gel+electrophoresis.">Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis.</a> Proteomics. 3, 1408-1417 (2003).</li><li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+protein+solubilization+for+the+analysis+of+the+CD14+human+monocyte+membrane+proteome+using+LC-MS/MS.">Optimization of protein solubilization for the analysis of the CD14 human monocyte membrane proteome using LC-MS/MS.</a> J Proteomics. 73, 112-122 (2009).</li><li>Centlow, M., Hansson, S. R., Welinder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+proteome+analysis+of+the+preeclamptic+placenta+using+optimized+protein+extraction.">Differential proteome analysis of the preeclamptic placenta using optimized protein extraction.</a> J Biomed Biotechnol. 2010, 458-748 (2010).</li><li>Perdew, G. H., Schaup, H. W., Selivonchick, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+a+zwitterionic+detergent+in+two-dimensional+gel+electrophoresis+of+trout+liver+microsomes.">The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes.</a> Anal Biochem. 135, 453-455 (1983).</li><li>Schindowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease-like+tau+neuropathology+leads+to+memory+deficits+and+loss+of+functional+synapses+in+a+novel+mutated+tau+transgenic+mouse+without+any+motor+deficits.">Alzheimer's disease-like tau neuropathology leads to memory deficits and loss of functional synapses in a novel mutated tau transgenic mouse without any motor deficits.</a> Am J Pathol. 169, 599-616 (2006).</li><li>Veenstra, T. D., Marcus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+advancement+of+neuroproteomics.">Multidimensional advancement of neuroproteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 5, 149-151 (2008).</li><li>Hernandez-Hernandez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotonic+dystrophy+CTG+expansion+affects+synaptic+vesicle+proteins,+neurotransmission+and+mouse.">Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse.</a> 136, 957-970 (2013).</li><li>Deramecourt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+staging+of+synucleinopathy+and+amyloid+deposition+in+dementia+with+Lewy+bodies.">Biochemical staging of synucleinopathy and amyloid deposition in dementia with Lewy bodies.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 65, 278-288 (2006).</li><li>Tofaris, G. K., Razzaq, A., Ghetti, B., Lilley, K. S., Spillantini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+is+a+pathological+event+not+associated+with+impairment+of+proteasome+function.">Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function.</a> J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).</li><li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncated+beta-amyloid+peptide+species+in+pre-clinical+Alzheimer's+disease+as+new+targets+for+the+vaccination+approach.">Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach.</a> J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).</li><li>Le Freche, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+phosphorylation+and+sevoflurane+anesthesia:+an+association+to+postoperative+cognitive+impairment.">Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment.</a> Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).</li><li>Leboucher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detrimental+effects+of+diet-induced+obesity+on+tau+pathology+are+independent+of+insulin+resistance+in+tau+transgenic+mice.">Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice.</a> Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).</li><li>Deramecourt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+neuropathological,+and+biochemical+characterization+of+the+novel+tau+mutation+P332S.">Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S.</a> J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).</li><li>Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmortem+interval+effect+on+RNA+and+gene+expression+in+human+brain+tissue.">Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue.</a> Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).</li><li>Bell, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+a+twenty-first+century+brain+bank:+experience+in+the+BrainNet+Europe+consortium.">Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium.</a> Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).</li><li>Crecelius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+quantitative+post-mortem+changes+in+the+gray+matter+of+the+human+frontal+cortex+proteome+by+2-D+DIGE.">Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE.</a> Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).</li><li>Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+human+postmortem+brain+using+2-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+(2-D+DIGE).">Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE).</a> Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).</li><li>Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+difference+gel+electrophoresis.">Two-dimensional difference gel electrophoresis.</a> Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).</li><li>Tannu, N. S., Hemby, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+for+comparative+proteomics+profiling.">Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling.</a> Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).</li></ol>

יש סופרים שאין ניגוד העניינים להכריז.

גילוי פתולוגיות שינויי ביטוי של חלבונים, חיפוש אחר סמנים ביולוגיים והאפנון של מסלולים אפשריים למטרות תרופתיים הם בין המטרות של neuroproteomics גישות 30. בין הכלים מתעוררים, שדה 2DE מוסיף expectative מבטיח. ובכל זאת, יש להגיע להסכמה על מנת למזער ולהגדיל את שונות שחזור בניסויים....

הפרעות נפשיות ונוירולוגיות מייצגות 13% מהנטל העולמי של מחלה, אתגרים חדשים כמו מנגנונים pathophysiological, גורמי סיכון וסמנים ביולוגיים prodromal חייבים להיחקר 1. בקנה אחד עם מטרה זו, מחקרי פרוטאומיקה של המוח האנושי הפכו הכרחיים כדי לחשוף את המסלולים מולקולריים מעורבים בתהליכים כמו זיכרון, התנהגות, רגשות ופלסטיות עצבית למשל, לא רק לפיסיולוגי, אלא גם למצבים פתולוגיים. לכן, השימוש במודלים של בעלי חיים ובאופן ספציפי יותר עכברים הטרנסגניים, מביא מגוון רחב של אפשרויות על מנת לחקות את אטיולוגיה של מחלות המוח ניווניות 2. פרוטאומיקה גישות זמינות כיום על מנת להשיג את נקודות המבט חדשים בתחום מדעי המוח. אלקטרופורזה דו ממדי ג&#39;ל (2DE) היא שיטה פשוטה ורבה עוצמה סבירה, המאפשרת להשוות את proteome של מגוון רחב של דוגמאות. יתר על כן, הוא גםשיטה רבת עוצמה לבודד את חלבון מתערובת מורכבת על מנת לזהות ולנתח נוסף על ידי ספקטרומטריית מסה. טכניקה זו בעצם מורכבת בשני שלבים רצופים: 1) הפרדת חלבונים לפי הנקודה איזואלקטרית (PI) על ידי isoelectrofocusing (IEF). לייתר דיוק, פוטנציאל חשמלי מוחל על פני רצועות acrylamide immobiline בין שיפוע pH ולאחר מכן החלבונים יעברו ולהתמקד בפיי נחוש בפונקציה של מטען נטו הגלובלי שלהם. 2) חלבוני Isoelectrically ממוקדים הם מפוגלים ומטען שלילי על ידי התוספת של נתרן גופרתי dodecyl (SDS), ובכך חלבונים במבנה הראשון שלהם מופרדים בהתאם למשקל המולקולרי לכאורה שלהם (MW) על ידי-SDS 3. שני מאפיינים ייחודיים אלה מאפשרים לנו להתמודד עם ערך כפול ללכת רחוק יותר במחקר של proteome. מצד אחד גישה זו מציעה את האפשרות לבצע ניתוח כמוני באמצעות צבעים מינימאליים שיטת 2D-DIGE, ומצד שני qualitativניתוח דואר על ידי מיני 2DE מצמידים מערבי סופג. ניתוח כמותי של 2D-DIGE מעניק ביטוי חלבון משתנה בכל רחבי proteome המדגם. בקצרה, דגימות מסומנות עם שלוש cyanines (Cy2, Cy3 וCy5) פולטת בשלושה אורכי גל שונים (כחול, ירוק ואדום). צבעים מינימאליים פלואוריד אלה המכילים קבוצת succinimidyl אסתר N-הידרוקסי מגיבים עם קבוצת ε-אמינו של שאריות lysines של חלבונים וכתוצאה מכך אגרות חוב אמיד קוולנטיים 4. שאריות ליזין מסומנות רק בין 1-3% ובכך מונע בנוסף תוויות מרובות לכל חלבון ושינויים גדולים תשלום נטו 5, 6. Cy3 וCy5 משמשים לעתים קרובות כדי לתייג את שני מדגמים בלתי תלויים ואילו Cy2 תגי תמהיל שלהן משקל שווה בדגימות כדי להשוות. שני היתרונות העיקריים הם כי כל הדגימות שכותרתו הן מעורבות וIEF ו- SDS מתבצעים בג&#39;ל אחד בפעם אחת לכל שלב, תוך הימנעות מהשתנות היתר בקרב ניסויים בשל ג&#39;לי השוואה. יתר על כן, הוא מציג סף זיהוי גבוה של כ 1 femtomole של חלבון 7. ג&#39;לים נסרקים ותוכנת 2D משווה את תמונות 2D ג&#39;ל הקרינה, שבו Cy2 משמשת כתקן המאפשר זיהוי של הבדלים סטטיסטיים בין הכתמים לזיהוי האחורי שלהם על ידי ספקטרומטריית מסה פנימי. תוכנת ניתוח 2D באמצעות התקן הפנימי משיגה זיהוי מהיר של פחות מ -10% מהבדלים בין דגימות עם יותר מ 95% של ביטחון סטטיסטי 8. ניתוח איכותני על ידי מיני 2DE הוא צעד חיוני לאפיון חלבונים. העיקרון הוא אותו כפי שתואר לעיל עבור PI והפרדת MW, אבל במקרה הזה חלבונים מועברים מג&#39;ל polyacrylamide קטן קרום וimmunoblotting מתבצע לאחר מכן. בעוד ג&#39;ל אלקטרופורזה ממד אחד מספקת שינויים בביטוי חלבונים לאחד או כמה אפיטופים חלבון בתפקוד של הנוגדן, information של מיני 2DE מעניק עם שני פרמטרים נוספים. ראשית, isovariants חלבון השינוי בתפקוד של פיי, המצביע על כך שלאחר translational שינויים עשויים להתרחש. שנית, זיהוי ספקטרומטריית מסה עשויה להצביע על zymogens הסביר ומוצרים קטבולי של חלבונים. לכן, שינויים שנצפו על ידי 2D-DIGE צפויים מעיד על המנגנונים העומדים בבסיס שינויים בפרופיל proteome הגלובלי. מערכים של immunoblots בין כמה דוגמאות מאותה epitope החלבון / s על ידי מיני 2DE עשויים לשקף שינויי חומציות לשפוך אור לתוך וריאציות לאחר translational מעט נצפו או אפילו לא על ידי immunoblotting monodimensional 9, 10. יתר על כן, ניתוח זה מודיע על אתרי מחשוף הפוטנציאליים בשל הידע של הצרכן וMW של השאריות מטבולי 11,12. השילוב של שתי טכניקות אלה מספק ניתוח פרוטאומיקה משלים. מצד אחד 2D-DIGE מקנה typדואר של הבדלים המאפשרים בידוד מדויק של פוליפפטידים הביטוי שלו הוא שונה. הבדלים אלה כוללים למעשה להופעה או ההיעלמות של נקודה או עלייה / ירידה של עוצמת נתון אחד על ידי ניתוח תוכנה של ג&#39;לי הניאון. עם זאת, התצפיות הללו על ידי עצמם הן סבירה כדי להסביר את טיבו של השינוי שנצפה. מסיבות אלה, ברגע שפוליפפטיד בודד וזוהה על ידי ספקטרומטריית מסה, השימוש במיני 2DE מאפשר לאשר 1 בדיוק) את זהותו של החלבון מבודד ו2) טבעו של ההבדל: השינוי ברמת isovariant / איזופורם של ביטוי, שלאחר translational שינויים ותהליכי מחשוף למשל. עם זאת, יש צורך לפתח את מאגר תמוגה מתחיל שניהם בקנה אחד עם 2D-DIGE ועם מיני 2DE על מנת להגביל תפוצות הפוטנציאליות הנובעות מהשימוש בפרוטוקולי חילוץ כי הם מאוד שונים. במאמר הנוכחי, אנחנו דהשתואר בפרוטוקול מותאם להכנה, החילוץ וביצועים של 2D-DIGE וטכניקות מיני 2DE לחלבונים במוח מגיעים מהרקמה אנושית ועכבר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="709">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5nmol 1 * 5 Nmo</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">25-8010-65</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Immobiline DryStrip</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the pH interval/size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">IPG Buffer, pH X-X</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the pH interval desired</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1&#160;</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">551797N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td>17-1335-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KIT BOX IPG 1 * 1 KIT</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9334-92</td>
			<td>Plastic box to make the passive rehydration&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">MILLEX GS Filter</td>
			<td style="width:113px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGS033SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)</td>
			<td style="width:113px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the MW to separate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">IPGphor III Isoelectric Focusing Unit</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">11-0033-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Ettan DALTsix Large Electrophoresis System</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">80-6485-08&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Gel Company</td>
			<td style="width:119px;">P2D1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

consensus brain-derived protein, extraction protocol for the study of human and murine brain proteome using both 2d-dige and mini 2de immunoblotting

ג&#39;ל אלקטרופורזה דו ממדים (2DE) היא כלי רב עוצמה כדי לגלות שינויי proteome פוטנציאליות הקשורים לתנאים פיסיולוגיים או פתולוגי שונים. בעיקרון, טכניקה זו מבוססת על הפרדת החלבונים לפי הנקודה איזואלקטרית בשלב ראשון, ושנית על פי המשקלים המולקולריים שלהם על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide SDS (SDS-PAGE). בדוח זה מדגם פרוטוקול הכנה מותאם לכמות קטנה של רקמה שלאחר המוות ומוח עכבר אנושי מתואר. שיטה זו מאפשרת לבצע שתי אלקטרופורזה דו ממדי הבדל הקרינה ג&#39;ל (2D-DIGE) וimmunoblotting 2DE המיני. השילוב של גישות אלו מאפשר לאדם למצוא לא רק חלבונים חדשים ו / או שינויים בחלבון בזכות הביטוי שלהם לתאימות שלה עם זיהוי ספקטרומטריית מסה, אלא גם תובנה חדשה אימות סמנים. לפיכך, מיני 2DE מצמידים את ההיתרים מערביים סופג לזהות ולאמת את הודעה-Translational שינויים, פירוק חלבונים ומספק השוואה איכותית בין תנאים ו / או טיפולים שונים. בזאת, אנו מספקים שיטה ללמוד רכיבים של אגרגטים חלבון שנמצאו בספירה ודימנציה גופיפי לוי כגון פפטיד עמילואיד בטא ואלפא סינוקלאין. השיטה שלנו ובכך ניתן להתאים לניתוח proteome וחלבונים מסיסים לחלץ מדגמי רקמת המוח ועכברים אנושיים מדי. במקביל, היא עשויה לספק מידע שימושי לחקר מסלולים מולקולריים ותאיים המעורבים במחלות ניווניות כמו גם סמנים ביולוגיים רומן פוטנציאליים ומטרות טיפוליות.

פרוטאומיקה על רקמת המוח נותרת מאתגרת שכן אין חיץ אידיאלי קיים כדי להתאושש מחלבונים 100%, במיוחד קרום הקשורים או חלבוני שלד תא. הסט הראשון של ניסויים שהתמקדו בחיפוש אחר מאגר תמוגה מתאים תואם את שתי גישות ואשר מאפשרת לשחזר את פנל גדול של חלבון. לפיכך, שלושה מאגרי תמוגה הי?...

Watch this Scientific Journal Video about Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting at JoVE.c

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

פרוטוקול מיצוי חלבון נפוץ באמצעות מאגר האוריאה / thiourea / SDS לרקמת מוח אדם ועכברים מאפשר indentification של חלבונים על ידי 2D-DIGE והאפיון הבא שלהם על ידי immunoblotting 2DE המיני. שיטה זו מאפשרת לאדם להשיג תוצאות יותר לשחזור ואמינים מביופסיות אדם ומודלים ניסיוניים.

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

consensus-brain-derived-protein-extraction-protocol-for-study-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.9K Views.  Inserm UMR 837.  פרוטוקול מיצוי חלבון נפוץ באמצעות מאגר האוריאה / thiourea / SDS לרקמת מוח אדם ועכברים מאפשר indentification של חלבונים על ידי 2D-DIGE והאפיון הבא שלהם על ידי immunoblotting 2DE המיני. שיטה זו מאפשרת לאדם להשיג תוצאות יותר לשחזור ואמינים מביופסיות אדם ומודלים ניסיונ...

Video: Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: שימוש בפרוטוקול תטא-Burst לחקור Mechasnism של פלסטיות של אנשים עם תסמונת X שביר אוטיזם ו

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

שיטות לימוד המורפוגנזה העצבית:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporation בקליפת עובריים מוחין Murine

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

תמונה רציפה-הלבנה להתוות תאי שווא יחידים בצומת Neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

New Methods to Study Gustatory Coding

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons (GRNs) detect tastant molecules, they encode information about the identity and concentration of the tastant as patterns of electrical activity that then propagate to follower neurons in the brain. These patterns constitute internal representations of the tastant, which then allow the animal to select actions and form memories. The use of relatively simple animal models has been a powerful tool to study basic principles in sensory coding. Here, we propose three new methods to study gustatory coding using the moth Manduca sexta. First, we present a dissection procedure for exposing the maxillary nerves and the subesophageal zone (SEZ), allowing recording of the activity of GRNs from their axons. Second, we describe the use of extracellular electrodes to record the activity of multiple GRNs by placing tetrode wires directly into the maxillary nerve. Third, we present a new system for delivering and monitoring, with high temporal precision, pulses of different tastants. These methods allow the characterization of neuronal responses in vivo directly from GRNs before, during and after tastants are delivered. We provide examples of voltage traces recorded from multiple GRNs, and present an example of how a spike sorting technique can be applied to the data to identify the responses of individual neurons. Finally, to validate our recording approach, we compare extracellular recordings obtained from GRNs with tetrodes to intracellular recordings obtained with sharp glass electrodes.

We present three new methods to study gustatory coding. Using a simple animal, the moth Manduca sexta (Manduca), we describe a dissection protocol, the use of extracellular tetrodes to record the activity of multiple gustatory receptor neurons, and a system for delivering and monitoring precisely timed pulses of tastants.

שיטות חדשות לחקר קידוד גוסטוריאלי

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

ניתוח תפוקה גבוהה של התנהגות גינקולוגיות וזמינותו האי דרוזופילה

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Extraction and Dissection of the Domesticated Pig Brain

Use of the pig as a preclinical and translatable animal model has been well-documented and accepted by research fields investigating cardiovascular systems, gastrointestinal systems, and nutrition, and the pig is increasingly being used as a large animal model in neuroscience. Furthermore, the pig is an accepted model to study neurodevelopment as it displays brain growth and development patterns similar to what occurs in humans. As a less common animal model in neuroscience, surgical and dissection procedures on pigs may not be as familiar or well-practiced among researchers. Therefore, a standardized visual protocol detailing consistent extraction and dissection methods may prove valuable for researchers working with the pig. The following video showcases a technique to remove the pig brain while keeping the cortex and brainstem intact and reviews methods to dissect several commonly investigated brain regions including the brainstem, cerebellum, midbrain, hippocampus, striatum, thalamus, and medial prefrontal cortex. The purpose of this video is to provide researchers with the tools and knowledge necessary to consistently perform a brain extraction and dissection on the four-week-old pig.

This protocol details the technique for removal of the pig brain in its entirety and dissection of several brain regions commonly studied in neuroscience.

מיצוי וניתוק של מוח החזיר המבוית

Use of the pig as a preclinical and translatable animal model has been well-documented and accepted by research fields investigating cardiovascular ...

Laser Microdissection-Based Protocol for the LC-MS/MS Analysis of the Proteomic Profile of Neuromelanin Granules

Neuromelanin is a black-brownish pigment, present in so-called neuromelanin granules (NMGs) in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta. Besides neuromelanin, NMGs contain a variety of proteins, lipids, and metals. Although NMGs-containing dopaminergic neurons are preferentially lost in neurodegenerative diseases like Parkinson&#39;s disease and dementia with Lewy bodies, only little is known about the mechanism of NMG formation and the role of NMGs in health and disease. Thus, further research on the molecular characterization of NMGs is essential. Unfortunately, standard protocols for the isolation of proteins are based on density gradient ultracentrifugation and therefore require high amounts of human tissue. Thus, an automated laser microdissection (LMD)-based protocol is established here which allows the collection of NMGs and surrounding substantia nigra (SN) tissue using minimal amounts of tissue in an unbiased, automatized way. Excised samples are subsequently analyzed by mass spectrometry to decipher their proteomic composition. With this workflow, 2,079 proteins were identified of which 514 proteins were exclusively identified in NMGs and 181 in SN. The present results have been compared with a previous study using a similar LMD-based approach reaching an overlap of 87.6% for both proteomes, verifying the applicability of the revised and optimized protocol presented here. To validate current findings, proteins of interest were analyzed by targeted mass spectrometry, e.g., parallel reaction monitoring (PRM)-experiments.

A robust protocol is presented here for isolating neuromelanin granules from human post-mortem substantia nigra pars compacta tissue via laser microdissection. This revised and optimized protocol massively minimizes the required time for sample collection, reduces the required sample amount, and enhances the identification and quantification of proteins by LC-MS/MS analysis.

פרוטוקול מבוסס מיקרודיסקציה בלייזר לניתוח LC-MS/MS של הפרופיל הפרוטאומי של גרגירי נוירומלנין

Neuromelanin is a black-brownish pigment, present in so-called neuromelanin granules (NMGs) in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta. ...

מהפכה במחקרי fNIRS: גישה חדשנית לצימוד עצבי

New Framework for Understanding Cross-Brain Coherence in Functional Near-Infrared Spectroscopy (fNIRS) Hyperscanning Studies

Despite the growing body of functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) hyperscanning studies, the assessment of coupling between two neural signals using wavelet transform coherence (WTC) seems to ignore the directionality of the interaction. The field is currently lacking a framework that allows researchers to determine whether a high coherence value obtained using a WTC function reflects in-phase synchronization (i.e., neural activation is seen in both members of the dyad at the same time), lagged synchronization (i.e., neural activation is seen in one member of the dyad prior to the other member), or anti-phase synchronization (i.e., neural activation is increased in one member of the dyad and decreased in the other). To address this need, a complementary and more sensitive approach for analyzing the phase coherence of two neural signals is proposed in this work. The toolbox allows investigators to estimate the coupling directionality by classifying the phase angle values obtained using traditional WTC into in-phase synchronization, lagged synchronization, and anti-phase synchronization. The toolbox also allows researchers to assess how the dynamics of interactions develop and change throughout the task. Using this novel WTC approach and the toolbox will advance our understanding of complex social interactions through their uses in fNIRS hyperscanning studies.

Author Spotlight: Unlocking New Insights in fNIRS Studies - A Novel Framework for Inter-Brain Synchrony Analysis 

Wavelet transform coherence (WTC) is a common methodology for assessing the coupling between signals that is used in functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) hyperscanning studies. A toolbox for assessing the directionality of the signal interaction is presented in this work.

מסגרת חדשה להבנת קוהרנטיות בין-מוחית במחקרי היפר-סריקה תפקודית של ספקטרוסקופיה תת-אדומה קרובה (fNIRS)

Despite the growing body of functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) hyperscanning studies, the assessment of coupling between two neural signals ...

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting