איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

השינוי שלאחר התרגום של חלבונים על ידי חלבון קטן ubiquitin מעורב באירועים רבים בתא. מחקר זה מציג תוספת מקורית לארגז הכלים לניתוח חלבון בכל מקום. אנו משתמשים בטכניקות העשרה ובספקטרומטריית מסה כדי לחשוף את ההכל העמוק.

ביצענו מספר שיפורים בניתוח של פפטידים diGly שמקורם חלבונים בכל מקום. אלה כוללים שבר פפטיד גולמי לפני העשרה, ואת היישום של הגדרות פיצול פפטיד מתקדמות יותר Orbitrap. בסך הכל התוצאה היא כיסוי גדול יותר של ubiquitinome.

קשה לתאר מספר היבטים של הפרוטוקול במילים. הדמיה של חלק מהצעדים העיקריים חיונית כדי להיות מסוגל לחזור על ניתוחים אלה על ידי מפעיל אחר במעבדה אחרת. ההליך יוכח על ידי קארל Bezstarosti, שהוא טכנאי בכיר במעבדה שלי.

התחל על ידי הכנת תאים מתורבתים או רקמת המוח של העכבר לניסוי. אם עובדים עם תאים, lyse גלולת התא מצלחת אחת 150 ס"מ בריבוע תרבות בשני מיליליטר של קרח קר, 50 מילימולר טריס HCL עם 0.5% נתרן deoxycholate. מרתיחים את הלט ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.

ואז sonicate אותו בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אם משתמשים ברקמת המוח של עכבר vivo, lyse אותו במאגר קר קרח המכיל 100 מילימולר טריס HCL, 12 מילימולאר נתרן deoxycholate ו 12 מילימולאר נתרן N-lauroylsarcosinate. סוניקאט למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

ואז להרתיח אותו במשך חמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מכמתים את כמות החלבון הכוללת באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA סופגת קלורימטרית, שאמורה להיות לפחות כמה מיליגרם לכשל חיסוני מוצלח של פפטיד diGly. לניסויי SILAC, ערבבו את החלבונים הקלים והכבדים ביחס של אחד לאחד בהתבסס על כמות החלבון הכוללת.

להפחית את כל החלבונים עם 5 מילימולר DTT במשך 30 דקות ב 50 מעלות צלזיוס. ולאחר מכן אלקילאט אותם עם 10 מילימולרים iodoacetamide במשך 15 דקות בחושך. לאחר מכן לבצע עיכול חלבון עם Lys-C במשך ארבע שעות.

ועיכול טריפסין לילה ב 30 מעלות צלזיוס, או בטמפרטורת החדר. למחרת, לחלק את המדגם לשני צינורות Eppendorf שני מיליליטר ולהוסיף TFA לדגימה מתעכל לריכוז הסופי של 0.5% צנטריפוגה זה ב 10, 000 פעמים G במשך 10 דקות כדי לזרז ולהסיר את כל חומר הניקוי. לאסוף את הפפטיד המכיל על טבעי עבור שברים הבאים.

השתמש pH גבוה הפוך שלב C18 כרומטוגרפיה כדי לשבר את פפטידים טריפטי. הכינו מחסנית עמודים ריקה של שישה מיליליטר מלאה בחומר פאזה נייח של 0.5 גרם לכ-10 מיליגרם של תקציר חלבונים. טוענים את הפפטידים על העמוד המוכן ושוטפים אותו בכ-10 כרכים של 0.1%TFA, ואחריו 10 כמויות מים.

אלתר את הפפטידים לשלושה שברים באמצעות 10 כרכים עמודה של 10 מילימור אמוניום formate עם שבעה, 13.5 ו 50% אצטוניטריל, בהתאמה. לאחר מכן, ליטוליזה כל השברים. קבוצה אחת של נוגדני מוטיב מוטיב בכל מקום מצומד חלבון תרחיף חרוז אגרוז מחולק לשישה שברים שווים.

ממיסים את שלושת שברי הפפטיד לפי הוראות כתב היד ומסתובבים במורד ההריסות. מוסיפים את העל-טבעיים של שלושת השברים לתרחץ חרוזים תוך שמירה על שלושת השברים האחרים על הקרח. ותמהר אותם במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס ביחידת מסובב.

לאחר מכן, סובב את חרוזים. מעבירים את העל-טבעי לקבוצה טרייה של חרוזים. ולחזור על הדגירה עם שלושת שברי תרחיף חרוזים הנותרים.

אחסן את העל-טבעיים לניתוח פרוטאום גלובלי עוקב. ולהעביר את חרוזים 200 טיפים פיפטה microliter מצויד תקע מסנן GFF. שים את הטיפים לתוך 1.5 צינורות מיליליטר מצויד מתאם קצה צנטריפוגה ולשטוף את חרוזים שלוש פעמים עם 200 microliters של חיץ קרח קר IAP, ואחריו שלוש שטיפות עם מים מטוהרים קרים כקרח.

סובבו את העמודים פי 200 G במשך שתי דקות בין הכביסה, ודאגו לא לתת לעמוד להתייבש. לאחר הכביסה הסופית, ללטף את הפפטידים עם שני מחזורים ב 50 microliters של 0.15% TFA. מפלים את הפפטידים עם קצה שלב C18 ומייבשים אותם בצנטריפוגה ואקום.

בצע ניסויי LC-MS/MS על ספקטרומטר מסה רגיש יחד עם מערכת LC ננו-זרימה. הטור הוקם על פי הוראות כתב היד ושמור על 50 מעלות צלזיוס. הפעילו את ספקטרומטר המסה במצב רכישה תלוי נתונים.

אסוף את ספקטרום המסה MS1 ברזולוציה גבוהה עם הגדרת יעד מבוקרת רווח אוטומטית של 4E5 וזמן הזרקה מרבי של 50 אלפיות שניה. בצע את ניתוח ספקטרומטריית המסה במצב הראשון האינטנסיבי ביותר, באמצעות שיטת המהירות העליונה עם זמן מחזור כולל של שלוש שניות. לאחר מכן לבצע סיבוב שני של ניתוח MS DDA במצב ראשון אינטנסיבי לפחות, אשר יבטיח זיהוי אופטימלי של פפטידים שפע נמוך.

סנן את היונים המבשרים בהתאם למדינות המטען שלהם ולהצהלה מונואיזוטופית. ואל תכלול מבשרים שנחקרו בעבר באופן דינמי למשך 60 שניות. בודד מבשרי פפטיד עם מסנן מסה מרובעת מוגדר לרוחב של 1.6 תומסון.

לאחר מכן לאסוף ספקטרום MS2 במלכודת היונים בשליטה אוטומטית להשיג של 7E3 עם זמן הזרקה מרבי של 50 אלפיות שנייה ואנרגיית התנגשות HCD של 30%לנתח את הספקטרומטריה מסה קבצי גלם באמצעות מנוע חיפוש מתאים, כגון חבילת תוכנה MaxQuant זמין בחופשיות המבוסס על מנוע החיפוש אנדרומדה. פתח את MaxQuant ובחר את קבצי הנתונים הגולמיים המתאימים. הגדר את מספר המעבדים ולחץ על הכרטיסיה פרמטרים ספציפיים לקבוצה.

בחר עיכול, ולאפשר שלושה מחשוף שלא נענו. לאחר מכן בחרו שינויים והוסיפו דיגלי לשינויים המשתנים. בחר את לשונית הפרמטרים הגלובלית והוסף את מסד הנתונים הנכון של רצף החלבון.

השאר את ההגדרות האחרות כברירת מחדל ולחץ על התחל לבצע את החיפוש במסד הנתונים. לניתוח כמותי של קבצי ניסוי SILAC, הגדר את הרבי לשניים ובחר את תוויות חומצות האמינו הכבדות. לאחר סיום החיפוש, יבא את קבצי הטקסט לתוך פרסאוס.

פרוטוקול זה שימש לזיהוי אתרי בכל מקום בחלבונים מתאים מתורבתים וחומר vivo על ידי גילוי פפטידים diGly עם ננו-זרימה LC-MS/MS. מספר שיפורים נעשו בפרוטוקול הקיים אשר הביא למספרים גבוהים יותר של פפטידים diGly שזוהו. שבר גולמי לשלושה שברים בוצע לפני immunoprecipitation.

אחד השברים מכיל פפטיד טריגלי שונה K48 של Ubiquitin, המאופיין בפסגה רחבה בכרומטוגרמת LC. יתר על כן, משטר פיצול פפטיד הותאם לשלב את ריצות LC-MS עם משטר הפיצול הראשון והנמוך ביותר בהליך ניתוח נתונים, אשר הפיק יותר מ 4, 000 פפטידים ייחודיים נוספים diGly. יותר מ 23, 000 פפטידים diGly ניתן לזהות באופן שגרתי מדגם אחד של תאי HeLa שטופלו מעכבי פרוטאזום.

מכל הפפטידים הדיגליים שזוהו על פני שלושה מסכי שכפול ביולוגיים, יותר מ-9,000 היו נוכחים בכל השלושה, בעוד שיותר מ-17,000 היו נוכחים בלפחות שניים מתוך שלושה שכפולים. מספר זיהויי הפפטיד מותנה מאוד בכמות חומר הקלט. מספר משוער של פפטידים diGly מזוהה ניתן לצפות בהתאם לחומר ההתחלתי, אבל מספרים אלה הם רק הערכות יהיה גם תלוי בסוג של ספקטרומטר מסה בשימוש.

בעת ביצוע פרוטוקול זה, ניסיון קודם עם שיטות פרוטאומיקה מבוססות ספקטרומטריית מסה וטיפול וניתוח כמויות מדגם דקות בהחלט יהיה יתרון. התוכנה MaxQuant יכול להיות מוחלף על ידי כל אלגוריתם חיפוש מסד נתונים אחר. כמו כן ניתן להשתמש בסוג אחר של ספקטרומטר מסה.

התוצאות במונחים של זיהוי פפטיד עשויות להיות שונות במקצת, אבל זה אופייני לכל ספקטרומטריית מסה המבוססת על פרוטומיקה. Ubiquitin חשוב בהתקדמות של השפלת חלבון מתווך, אבל גם ממלא תפקיד בתהליכים רבים אחרים בתא. ידע מעמיק יותר של ubiquitin כשינוי שלאחר תרגום הוא חיוני כדי להבין טוב יותר את תפקידו.