تلقى هذا البحث بدعم من مشروع QNano http://www.qnano-ri.eu التي يتم تمويلها من قبل البنية التحتية للبحوث الجماعة الأوروبية في إطار برنامج FP7 القدرات (منحة رقم INFRA-2010-262163). كما نشكر مجلس البحوث FORMAS للحصول على الدعم المالي.

<ol>
	<li>Echlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Low Temperature Microscopy and Analysis. , (1992).</li><li>Rubino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+site-specific+focused-ion-beam+lift-out+method+for+cryo+Transmission+Electron+Microscopy.">A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy.</a> J. Struct. Biol. 180, 572 (2012).</li><li>Studer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing.">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J. Microsc. 203, 285 (2001).</li><li>Umrath, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooling+bath+for+rapid+freezing+in+electron+microscopy.">Cooling bath for rapid freezing in electron microscopy.</a> J. Microsc. 101, 103 (1974).</li><li>Walther, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+freeze-fracturing+of+high-pressure+frozen+samples.">Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples.</a> J. Microsc. 212, 34 (2003).</li><li>Elder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography.">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> Cryo fixation. Techniques in Immunocytochemistry. , (1989).</li><li>Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Focused Ion Beams. , (2005).</li><li>Marko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryoelectron+microscopy.">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryoelectron microscopy.</a> Nat. Methods. 4, 215 (2007).</li><li>Hayles, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+frozen-hydrated,+vitreous+lamellas+from+cells+for+cryo-electron+microscopy.">The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 172, 180 (2010).</li><li>Rigort, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+micromachining+of+eukaryotic+cells+for+cryoelectron+tomography.">Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography.</a> J. Struct. Biol. 109, 4449-44 (2012).</li><li>Hsieh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+high-resolution+three-dimensional+imaging+of+native+mammalian+tissue:+electron+tomography+of+frozen-hydrated+rat+liver+sections.">Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections.</a> J. Struct. Biol. 153, 1 (2006).</li><li>McDowall, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+frozen+hydrated+sections+of+vitreous+ice+and+vitrified+biological+samples.">Electron microscopy of frozen hydrated sections of vitreous ice and vitrified biological samples.</a> J. Microsc. 131, 1 (1983).</li><li>Hayles, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+for+improved+focused+ion+beam+milling+of+cryo-prepared+life+science+specimens.">A technique for improved focused ion beam milling of cryo-prepared life science specimens.</a> J. Microsc. 226, 263 (2007).</li><li>Pettersson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+producing+site-specific+TEM+specimens+from+low+contrast+materials+with+nanometer+precision.">A method for producing site-specific TEM specimens from low contrast materials with nanometer precision.</a> Microsc. Microanal. 19 (1), 73 (2013).</li><li>W&#228;tjen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cu+out-diffusion+in+kesterites—A+transmission+electron+microscopy+specimen+preparation+artifact.">Cu out-diffusion in kesterites—A transmission electron microscopy specimen preparation artifact.</a> Appl. Phys. Lett. Appl. Phys. Lett, 051902 (2013).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

هذا البروتوكول هو التكيف واضحة إلى حد ما من درجات الحرارة المبردة معيار إعداد العينات الاكذوبه / تيم المستخدمة في العلوم المادية في RT. تنتج طريقة TEM عينات مجانية من تشوه الميكانيكية وعلامات سكين (العيب الرئيسي من استشراح)، رغم أنه قد تحدث إذا بالستائر سطح العينة غير متجانسة. هذا يمكن الحد من البرد ترسب طبقة السد (في هذا العمل كان يستخدم حزب العمال)، حتى شفي على نحو سلس وملامح 13. العينات مع مكونات صلابة مختلفة جدا يمكن أن تكون على استعداد كذلك دون التعرض لخطر بأنهم كسر تحت الضغط أثناء التحضير. الضغوط الداخلية قد لا تزال تسبب الصفيحة رقيقة لثني أو حليقة، وفي هذه الحالة حجم القسم لابد من تخفيضها. والعيب مقارنة مع الأسلوب الآخر هو إمكانية تغيير هيكل البيولوجية بسبب التعرض لشعاع ايون وزرع ممكن من الأيونات في العينة. تحدث هذه العيوب أيضا على RT لعينة preparأوجه في علوم المواد 15. ويمكن تخفيضها من خلال استكمال رقيق مع خطوة تلميع النهائي بأقل الجهد لتسريع الأيونات (500-1،000 V). وهذه الخطوة تلميع لطيف جدا إزالة الطبقة التالفة من الصفيحة. ويرجع ذلك إلى طبيعة البرد ترسب (الخطوات 3.5، 3.10 و 3.13)، وسيتم تغطية أجزاء كبيرة من العينة، وبالتالي حجبت الرؤية من السطح الأصلي. هذا قد يجعل من الصعب تعقب عائدات الاستثمار، ما لم تستخدم علامات متعددة كما اقترح في الخطوة 3.3. خلال الخطوات 4.5 و 4.7 المخاطر الصفيحة رقيقة القادمة في اتصال مع الهواء. هذه لابد من تجنبها لأنها من شأنها أن تسبب الرطوبة في الهواء لتشكيل بلورات الثلج على سطح العينة، وربما إلى حد حجب الميزات الهامة. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوات في أسرع وقت ممكن، ولكن في نفس الوقت لسوء أثناء نقل من المرجح أن يؤدي إلى فقدان العينة أنهالنفس. فمن المستحسن أن المستخدم يمارس تلك الخطوات باستخدام شبكات تيم فارغة قبل إجراء محاولة على عينة حقيقية. في العلوم المادية، وأصبحت أداة الاكذوبه الأسلوب رئيس TEM عينة إعداد في غضون عشر سنوات من تسويقها. نظرا لأنه يمكن استخدامها على أي تقريبا العينة، فإنه يزيل الحاجة إلى تكييف هذه التقنية لإعداد نوع العينة. ونحن نعتقد بقوة نفسه يمكن أن يحدث في درجات الحرارة المبردة، وذلك بفضل الإجراءات المفصلة هنا. تطبيقه على عينات أكبر لا تزال خاضعة للالقدرة على البرد الحفاظ عليها في حالة المزجج، ولكن يمكن تقنيات مثل يغرق تجميد أو الضغط العالي تجميد 3،5 يثبت أن الحلول الأمثل لهذه المشكلة.

في هذا البروتوكول يستخدم cryo-FIB/SEM لإنتاج عينات TEM من منطقة محددة من العينة، التي سبق تحديدها بدقة عالية من خلال تحليل ووزارة شؤون المرأة. الإلكترون المجهري (مسح أو نقل) تحليل العينات البيولوجية هي تقنية روتينية تستخدم لأغراض البحث والتشخيص. SEM سريع نوعا ما، وسهلة لاستخدام وتفسير، ولكن يتم الحصول على المعلومات فقط من سطح العينة ومع قرار في نطاق 1.5 نانومتر. تيم لديه دقة أعلى ولكن هو أكثر صعوبة لتنفيذ وتحليل الصور هو أقل وضوحا وحين يتم الحصول على المعلومات بكميات كبيرة، والعينات يجب أن تكون ضعيفة إلى الإلكترون الشفافية (أقل من 500 نانومتر حوالي سميكة). مشكلة إضافية هي أن متطلبات الفراغ من تلك الصكوك نادرا ما يتم التغاضي عن طريق العينات التي تحتوي على الماء. في معظم الحالات، والعينات البيولوجية يجب أن تكون إما ثابتة كيميائيا (استبدال المياه، على سبيل المثال، والبوليمرات) أو المجففة. في كلتا الحالتين، تغييرات كبيرة فيمورفولوجيا وهيكل العينة من المحتمل أن تحدث. إعداد البرد تيم العينات المائية يؤدي الى تغييرات كيميائية الحد الأدنى، وأنها تنتج عينات أقرب وقت ممكن إلى حالتها الأصلية، وخاصة إذا تم الحصول التزجيج من الجليد 1-6. ويستخدم على نطاق واسع الاكذوبه لإعداد عينات تيم للمزايا العديدة 7. على سبيل المثال لا الحصر: استخدام الأيونات ذات الطاقة العالية في حدوث شبه طبيعية يقلل من تأثير أسعار الطحن التفاضلية المتعلقة المادية؛ المنطقة المستخرجة من العينة الأكبر يمكن اختيار بدقة ميكرون الفرعية؛ يتم استخراج كمية صغيرة جدا من المواد. جعلت بعض التطورات التقنية الأخيرة الممكن استخدام الاكذوبه أيضا لإعداد عينة تيم في درجات الحرارة المبردة 2،8-10. وهناك العديد من المزايا على طريقة إعداد التقليدية من البرد استشراح 11،12 تستخدم أساسا لعينات المسألة لينة، مثل عدم وجود تشوه الميكانيكية من الصفيحة شرائح،غياب علامات سكين وإمكانية إعداد عينات مركب مع واجهات الثابت / لينة أو المكونات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Strata DB 235&#160;</td>
			<td style="width:71px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">FIB/SEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omniprobe 100&#160;</td>
			<td colspan="2">Oxford Instruments&#160;</td>
			<td>nanomanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alto 2500</td>
			<td style="width:71px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cryo preparation chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cryo-holder model 626</td>
			<td style="width:71px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cryo transfer TEM holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tecnai F30</td>
			<td style="width:71px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>TEM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron microscopy specimen preparation by means of a focused ion beam

هنا نقدم بروتوكول يستخدم لتحضير عينات البرد تيم الجراثيم الرشاشيات النيجر، ولكن التي يمكن بسهولة أن تتكيف لأي عدد من الكائنات الدقيقة أو الحلول. نحن الاستفادة من محطة البرد نقل مخصصة بنيت وتعديل البرد SEM إعداد غرفة 2. تؤخذ الجراثيم من ثقافة، يغرق مجمدة في النيتروجين السائل وطين لوحظ في البرد ووزارة شؤون المرأة لتحديد المنطقة ذات الاهتمام. ثم يتم استخراج الصفيحة رقيقة باستخدام الاكذوبه، تعلق على الشبكة TEM وبالتالي ضعفت إلى الإلكترون الشفافية. يتم نقل الشبكة لحامل البرد تيم والى تيم لدراسات عالية الدقة. بفضل إدخال تلميح nanomanipulator تبريد ومحطة نقل البرد، وهذا البروتوكول هو التكيف واضحة لدرجة الحرارة المبردة من إعداد الاكذوبه تستخدم بشكل روتيني لعينات TEM. على هذا النحو لديها مزايا التي تتطلب كمية صغيرة من التعديلات على الصكوك، والاجهزة والإجراءات القائمة؛ طمن السهل لتنفيذ؛ انها لديها مجموعة واسعة من التطبيقات، من حيث المبدأ نفس لإعداد عينة البرد TEM. القيد واحد هو أنه يتطلب معالجة ماهرا من العينات في الخطوات الحاسمة لتجنب أو تقليل التلوث.

في هذا العمل الذي نقوم استفادت من: شعاع المزدوج الاكذوبه / SEM مجهزة nanomanipulator وغرفة البرد إعداد؛ وTEM مع حامل البرد نقل؛ محطة البرد نقل النموذج. تم تعديل anticontaminator (AC) شفرات للغرفة البرد إعداد وغيض من nanomanipulator (NM) بواسطة قطان. فيما يتعلق غرفة البرد إعداد القياسية، ريش AC أكبر لتوفير أكبر بالوعة الحرارة لأجل الطرف NM. علاوة على ذلك، تم تزويد AC مع المشابك لربط الضفائر النحاس لتبادل الحرارة مع طرف NM. تم تعديل الخصائص الميكانيكية للالاكذوبه / SEM للسماح للNM أن تكون وتبقى حتى عندما تم إدراج تنفيس حجرة العينة. تجدر الإشارة إلى أن المعايير المستخدمة في هذا العمل هي الأنسب للمعدات المذكورة أعلاه؛ قد يحتاج هؤلاء المعلمات إلى تعديلها عند العمل مع أنواع أخرى من المعدات. للعمل مع هذا البروتوكول، والاحتياطات العادية لمعالجة فيزياء درجات الحرارة المتدنية، ينبغي أنظمة النيتروجين السائل والفراغينبغي اتباعها. وقد تم اختبار هذه الطريقة على أنواع مختلفة من العينات مع نتائج جيدة، بدءا من حلول أو المصفوفات تحتوي على جزيئات البوليمر، لكائن حي وحيد الخلية إلى الديدان الخيطية. ويوضح أمثلة على الخطوات المختلفة للإجراء في أرقام 1-12 على A. جراثيم النيجر ملطخة رباعي أكسيد الأوزميوم وبرمنجنات البوتاسيوم. يتم تصوير الجراثيم أول مرة من قبل وزارة شؤون المرأة (الشكل 1) لتحديد موقع لاستخراج. في هذه الحالة، كان قطاع عريض من أي بوغ كافية، ولكن من الممكن لوضع العائد على الاستثمار لاستخراج بدقة ميكرومتر الفرعية، على سبيل المثال، شريحة خلية معينة على مسافة محددة من غشاء الخلية. مرة واحدة وقد تم التعرف على سمة من الفائدة، يتم تنفيذ الخطوة الأولى من ترسب البرد حزب العمال (الشكل 2)، لحماية عينة من الضرر شعاع من الطحن أيون. إمالة العينة إلى 52 درجة على المضي قدما في الخطوات الأولى سو طحن (الشكل 3): والاخرق من اثنين من الخنادق على جانبي الصفيحة. ثم إمالة العينة ذهابا والمضروب لمغادرة اثنين فقط من الجسور الصغيرة توصيله إلى الجزء الأكبر (الشكل 4) أخرى. يتم جلب nanomanipulator تبريد في اتصال مع الصفيحة (الشكل 5)، وأخرى البرد ترسب حزب العمال الجنود بعضهم البعض (الشكل 6). ثم يتم طحنها الجسور التي تربط صغيرة بعيدا وNM يتحرك الصفيحة بالقرب من منطقة الحجز على الشبكة TEM (الشكل 7)، حيث يتم ملحوم ذلك مع النهائي البرد ترسب حزب العمال (الشكل 8). ثم يتم فصل NM من الصفيحة (الشكل 9)، والتي ضعفت وصولا الى الإلكترون الشفافية مع شعاع ايون (الشكل 10 و 11). يتم نقل الصفيحة في النهاية إلى تيم (الشكل 12) حيث عالية الدقة والتصوير، والتحليل الطيفي، والتصوير المقطعي وغيرها من التقنيات كاليفورنيان استخدامها. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1.jpg" /> الشكل 1. البرد SEM صورة أبواغ A. النيجر، قبل أن ترسب حزب العمال. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2.jpg" /> الشكل 2. نفس المنطقة في الشكل 1 بعد ترسب حزب العمال ولكن قبل علاج. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3.jpg" /> الشكل 3. صورة البرد ووزارة شؤون المرأة من نفس المنطقة في الشكل 2، يميل 52 درجة، وبعد ترسب حزب العمال وعلاج، مع خندق الطحن جارية(انظر الخطوة 3.7). <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4.jpg" /> الشكل 4. والصفيحة، وعلى استعداد لرفع إجراءات المغادرة. <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5.jpg" /> الرقم 5. غيض nanomanipulator البارد يجعل الاتصال مع الصفيحة. <img alt="الرقم 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6.jpg" /> الرقم 6. ويستخدم حزب العمال الثاني البرد ترسب لحام معا nanomanipulator والصفيحة. <i<html> بديل ملغ = &quot;الرقم 7&quot; FO: محتوى العرض = &quot;5IN&quot; FO: SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7highres.jpg&quot; سرك = &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7.jpg&quot; /&gt; الرقم 7. يستخدم nanomanipulator الباردة لنقل الصفيحة إلى منطقة المرفق من الشبكة TEM. <img alt="الرقم 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8.jpg" /> يستخدم الرقم 8. البرد ترسب مرة أخرى لإرفاق الصفيحة إلى الشبكة TEM. <img alt="الرقم 9" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9.jpg" /> الرقم 9. هو قطع الصفيحة خالية من nanomanipulator وهي الآن جاهزة للتخزين إما أو رقيق لإلكترون الشفافية. ضمن صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الرقم 10" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10.jpg" /> الرقم 10. خطوة وسيطة للرقيق، مع عدد قليل من الجراثيم واضحة في المقطع العرضي. <img alt="الرقم 11" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11.jpg" /> الرقم 11 صورة البرد SEM من العينة بعد ترقق النهائي؛ معظم جراثيم أخرى كان لا بد من المضروب بعيدا لأن الصفيحة قد بدأت لتجعيد. <img alt="الرقم 12" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12.jpg" /> الرقم 12 ألف مركب الصورة البرد تيم الصفيحة. وقد أدرج جزء من كعب آلفي الصفيحة (السهم الأسود).

Watch this Scientific Journal Video about Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam at JoVE.com

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

البرد المجاهر الإلكترونية، إما الضوئي (SEM) أو ناقل الحركة (TEM)، وتستخدم على نطاق واسع لتوصيف العينات البيولوجية أو غيرها من المواد ذات المحتوى ارتفاع المياه 1. ويستخدم SEM / المركزة ايون الشعاع (فيبوناتشي) لتحديد ملامح الاهتمام العينات واستخراج، الإلكترون شفافة رقيقة لنقل الصفيحة إلى البرد TEM.

البرد الإلكترون المجهري عينة التحضير عن طريق المركزة ايون شعاع

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

cryo-electron-microscopy-specimen-preparation-means-focused-ion

Research

JoVE Journal

Biology

26.4K Views.  Uppsala University.  البرد المجاهر الإلكترونية، إما الضوئي (SEM) أو ناقل الحركة (TEM)، وتستخدم على نطاق واسع لتوصيف العينات البيولوجية أو غيرها من المواد ذات المحتوى ارتفاع المياه 1. ويستخدم SEM / المركزة ايون الشعاع (فيبوناتشي) لتحديد ملامح الاهتمام العينات و?...

Video: Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually scattered cells and small cell groups. This technique uses HistoGel (Thermo Scientific) with conventional laboratory equipment.
The use of cell block sections is a valuable ancillary tool for evaluation of non-gynecologic cytology. They enable the cytopathologist to study additional morphologic specimen detail including the architecture of the lesion. Most importantly, they allow for the evaluation of ancillary studies such as immunocytochemistry, in-situ hybridization tests (FISH/CISH) and in-situ polymerase chain reaction (PCR). Traditional cell block preparation techniques have mostly been applied to non-gynecologic cytology specimens, typically for body fluid effusions and fine needle aspiration biopsies.
Liquid based cervicovaginal specimens are relatively less cellular than their non-gynecologic counterparts with many individual scattered cells. Because of this, adequate cellularity within the cell block sections is difficult to achieve. In addition, the histotechnologist sectioning the block cannot visualize the level at which the cells are at the highest concentration. Therefore, it is difficult to monitor the appropriate level at which sections can be selected to be transferred to the glass slides for testing. As a result, the area of the cell block with the cells of interest may be missed, either by cutting past or not cutting deep enough. Current protocol for Shidham's method addresses these issues. Although this protocol is standardized and reported for gynecologic liquid based cytology specimens, it can also be applied to non-gynecologic specimens such as effusion fluids, FNA, brushings, cyst contents etc for improved quality of diagnostic material in cell block sections.

Shidham's method for preparation of cell blocks with AV-marker from cytology specimens containing individually scattered cells and small cell groups.

خلية إعداد كتلة من العينة مع غلبة علم الخلايا من خلايا منفردة غيوم

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific shapes. Drosophila tracheal terminal cells have become a powerful genetic model to identify and elucidate the roles of genes required for generating cellular morphologies. Terminal cells are a component of a branched tubular network, the tracheal system that functions to supply oxygen to internal tissues. Terminal cells are an excellent model for investigating questions of cell shape as they possess two distinct cellular architectures. First, terminal cells have an elaborate branched morphology, similar to complex neurons; second, terminal cell branches are formed as thin tubes and contain a membrane-bound intracellular lumen. Quantitative analysis of terminal cell branch number, branch organization and individual branch shape, can be used to provide information about the role of specific genetic mechanisms in the making of a branched cell. Analysis of tube formation in these cells can reveal conserved mechanisms of tubulogenesis common to other tubular networks, such as the vertebrate vasculature. Here we describe techniques that can be used to rapidly fix, image, and analyze both branching patterns and tube formation in terminal cells within Drosophila larvae. These techniques can be used to analyze terminal cells in wild-type and mutant animals, or genetic mosaics. Because of the high efficiency of this protocol, it is also well suited for genetic, RNAi-based, or drug screens in the Drosophila tracheal system.

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Here, we present a method for light microscopy analysis of tracheal terminal cells in Drosophila larvae. This method allows for quick examination of branch and lumen morphology in whole animals and would be useful for analysis of individual mutants or screens for mutations affecting terminal cell development.

فحص<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات الخلايا الطرفية الرغامي بواسطة المجهر الضوئي

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

ما يفعل وما يترك من المجهري البرد الإلكترون: وهو أول كتاب عن تحضير العينة وجمع البيانات عالية الجودة للتعمير الجزيئات 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

نموذج إعداد وتصوير اكسوسوميس مجهر إلكتروني

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

التصور للضغط الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء بالتصوير المقطعي الفولت العالي Cryo-إلكترون

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. For many years electron microscopy (EM) has remained an inherently two-dimensional technique. With the advent of serial scanning electron microscope imaging techniques (volume EM), using either an integrated microtome or focused ion beam to slice then view embedded tissues, the third dimension becomes easily accessible. Serial block face scanning electron microscopy (SBF-SEM) uses an ultramicrotome enclosed in the SEM chamber. It has the capability to handle large specimens (1,000 &#181;m x 1,000 &#181;m) and image large fields of view at small X,Y pixel size, but is limited in the Z dimension by the diamond knife. Focused ion beam SEM (FIB-SEM) is not limited in 3D resolution, (isotropic voxels of &#8804;5 nm are achievable), but the field of view is much more limited. This protocol demonstrates a workflow for combining the two techniques to allow for finding individual regions of interest (ROIs) in a large field and then imaging the subsequent targeted volume at high isotropic voxel resolution. Preparing fixed cells or tissues is more demanding for volume EM techniques due to the extra contrasting needed for efficient signal generation in SEM imaging. Such protocols are time consuming and labor intensive. This protocol also incorporates microwave assisted tissue processing facilitating the penetration of reagents, which reduces the time needed for the processing protocol from days to hours.

Here, we present a protocol for efficiently combining serial block face and focused ion beam scanning electron microscopy to target an area of interest. This allows for efficient searching, in three dimensions, and locating rare events in a large field of view.

الدراسات المستهدفة باستخدام الوجه كتلة المسلسل ومركزة أيون شعاع المسح المجهري الإلكترون

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.