The authors thank P. Levin, S. Moriya, S. Foster, and M. Pinho for the gift of strains and antibodies. They also thank L. Ferrand, P. Goodwin, J. Cooper, and B. Dougherty for expert technical assistance. CBW is supported by an Australian National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (571905). LT was supported by a UTS Chancellors Postdoctoral Fellowship. MPS and ATFL were supported by Australian Postgraduate Awards. This work was supported by an Australian Research Council Discovery Project Grant (DP120102010) to EJH.

<ol>
	<li>Harry, E., Monahan, L., Thompson, L., Kwang, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Cell+Division+The+Mechanism+and+Its+Precison.">Bacterial Cell Division The Mechanism and Its Precison.</a> Int Rev Cytol. 253, 27-94 (2006).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Lett. 19, 780-782 (1994).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy.">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys j. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angew Chem Int Ed (English). 47, 6172-6176 (2008).</li><li>Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+Diffraction+Barrier+in+Fluorescence+Microscopy+by+Optical+Shelving.">Breaking the Diffraction Barrier in Fluorescence Microscopy by Optical Shelving.</a> Phys Rev Lett. 98, 218103 (2007).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination.">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophys J. 94, 4957-4970 (2008).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy.">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320, 1332-1336 (2008).</li><li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+modulated+excitation+microscopy:+Improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating.">Lateral modulated excitation microscopy: Improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> Proc SPIE 3568. , 185-195 (1999).</li><li>Gould, T. J., Burke, D., Bewersdorf, J., Booth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+enables+3D+STED+microscopy+in+aberrating+specimens.">Adaptive optics enables 3D STED microscopy in aberrating specimens.</a> Opt Express. 20, 20998-21009 (2012).</li><li>Urban, N. i. c. o. l. a. i. . T., Willig, K. a. t. r. i. n., Hell, S. t. e. f. a. n. . W., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+Nanoscopy+of+Actin+Dynamics+in+Synapses+Deep+Inside+Living+Brain+Slices.">STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices.</a> Biophys J. 101, 1277-1284 (2011).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 1607-1611 (2011).</li><li>Strauss, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-SIM+Super+Resolution+Microscopy+Reveals+a+Bead-Like+Arrangement+for+FtsZ+and+the+Division+Machinery+Implications+for+Triggering+Cytokinesis.">3D-SIM Super Resolution Microscopy Reveals a Bead-Like Arrangement for FtsZ and the Division Machinery Implications for Triggering Cytokinesis.</a> PLoS biol. 10, e1001389 (2012).</li><li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+assembly,+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring.">Bacterial cell division assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Rev Microbiol. 7, 642-653 (2009).</li><li>Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+E+coli+cell+fission.">Advances in understanding E coli cell fission.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 730-737 (2010).</li><li>Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+physics+of+FtsZ+assembly+and+force+generation.">Modeling the physics of FtsZ assembly and force generation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 9238-9243 (2009).</li><li>Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+in+Bacterial+Cytokinesis+Cytoskeleton+and+Force+Generator+All+in+One.">FtsZ in Bacterial Cytokinesis Cytoskeleton and Force Generator All in One.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 74, 504-528 (2010).</li><li>Lan, G., Wolgemuth, C. W., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Z-ring+force+and+cell+shape+during+division+in+rod-like+bacteria.">Z-ring force and cell shape during division in rod-like bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16110-16115 (2007).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+Contractile+FtsZ+Rings+in+Liposomes.">Reconstitution of Contractile FtsZ Rings in Liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery.">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 11000-11004 (2013).</li><li>Murphy, G. E., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography.">Electron cryotomography.</a> BioTechniques. 43, 413-415 (2007).</li><li>Liew, A. T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+plasmid-based+system+that+allows+rapid+generation+of+tightly+controlled+gene+expression+in+Staphylococcus+aureus.">A simple plasmid-based system that allows rapid generation of tightly controlled gene expression in Staphylococcus aureus.</a> Microbiology. 157, 666-676 (2011).</li><li>Riglar, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolution+Dissection+of+Coordinated+Events+during+Malaria+Parasite+Invasion+of+the+Human+Erythrocyte.">Super-Resolution Dissection of Coordinated Events during Malaria Parasite Invasion of the Human Erythrocyte.</a> Cell Hos., &amp; Microbe. 9, 9-20 (2011).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> EMBO J. 26, 4694-4708 (2007).</li></ol>

This publication is sponsored by GE Healthcare.

הדמיה לחיות תאי ניאון היא כלי רב עוצמה המאפשר תצפית של שינויים דינמיים בתוך תאים לאורך זמן. ההדמיה חיה של ביולוגיה של תא חיידקים הייתה מאתגרת בגלל גודל התא הקטן ומקטינה את היכולת של תאי חיידקיים לעמוד חשיפה חוזרת ונשנית לאור העירור. f3D-SIM הרחיב את הכלים העומדים לרשות לחקור את כל הביולוגיה של התא, אך יש צורך לבצע בזהירות בטכניקה זו כפי שניתן הציגו ממצאים אם ייושמו בצורה גרועה. ישנם מספר שיקולים החשובים לשימוש המוצלח של טכניקה זו. כפי שהוא שיטת דימות פלואורסצנטי רחב בתחום שמסתמכת על השימוש בפונקצית נקודת ההתפשטות של אור הנפלט, חוסר התאמת מקדם שבירה וסטייה כדורית של האור הנפלט יש להימנע כדי לאפשר שחזור תמונה מדויק. השימוש בcoverslips של 0.17 מ&quot;מ עובי של באיכות גבוהה, כדי למנוע וריאציה של עוצמת אות בשל השתנות עובי זכוכית בכיסוייםשפה מומלצת מאוד. זה חשוב באופן קריטי על מנת להעריך בזהירות את האברציה הכדורית של האור הנפלט בשלבים הראשונים של כל הניסויים ולהתאים את מקדם שבירת שמן טבילה לפי צורך. זה עשוי להשתנות מיום ליום כפי שהוא תלוי בשני הטמפרטורה ומדיה / מצע ההרכבה של המדגם. השימוש בשמן לא נכון יגרום לשחזור נחותים של התמונות עם חפצים כגון הילות ואותות הד. בסופו של תהליך שחזור התמונה, לכל שלב ניתן לקבל מדד לאיכות של השיקום על ידי &quot;ההתאמה הטובה ביותר עבור זווית Ko&quot; לכל שלב / זווית של התאורה. אם ערך זה הוא מתחת ל -1 לכל זווית, ולאחר מכן את האיכות של משוחזר תהיה ככל הנראה להיות גבוהה. אם ערך זה הוא מעל 6, שזה סביר להניח כי התמונה המשוחזרת תכיל חפצים. חפצים נפוצים כוללים אני) את המראה של פסים בתמונה שמתאימהלאחד מהזוויות של הרשת. זה יכול לנבוע מאות נמוכה יותר מזווית הרשת ש; ii) אפף סביב מבנים. זה יכול לנבוע מרמות מאוד לא אחידות של אות ממבנים בהירים בהשוואה למבנים שמסביב, חוסר התאמה של מקדם שבירה של הנפט והמדגם או יכול להיות בגלל המבנים בתמונה להיות אמורפי מדי ולא מכיל &quot;מבנה&quot; מספיק כדי להיות מוכר על ידי האלגוריתם; iii) &quot;כוורות&quot; שנובעת מאות נמוכה יחס רעש בתמונה, בדרך כלל עקב אות רקע גבוהה; iv) מבנים שנמתחים / מוארכים בXY שיכולים להיות בגלל חוסר ההתאמה מקדם שבירה של שמן ומדגם. חפץ זה קשה להבחין למשתמש לא מנוסה. מומלץ כי משתמשים חדשים להתייעץ חוקר SIM מנוסה לקבלת ייעוץ על פרשנות תמונה וניתוח כאשר מתחילים להשתמש בטכניקה זו. כמו בכל ניסויי ההדמיה לחיות תאי הניאון, זה יבואנמלה לאזן בזהירות את קלט אנרגיית עירור על מנת למזער את מידת photobleaching וphototoxicity של התאים עם אות פליטה מספיק צריכה לשחזר תמונות עם חפץ מינימאלי. photobleaching מוגזם (יותר מ 30% על פני רכישת z-ערימה אחת) יוביל לדפוס פיזור בתמונה המשוחזרת. עם השימוש במצלמות sCMOS, תמונות ברזולוציה סופר ניתן לשחזר בהצלחה מתמונות גולמית עם אות פליטה נמוכה כמו 1,000 ספירות מעל רקע. זה יכול לאפשר לזמני חשיפה קצרים מאוד ובכך להפחית photobleaching ומאפשרים לכידה מהירה לכל מסגרת. זה גם מגדיל את כמות הזמן בין מסגרות לתאים להתאושש מהשקעת אנרגית עירור. בנוסף, ככל שזמן הלכידה לכל מסגרת בודדת יכול להיות קצר מאוד, התואר של חפץ שהוצג על ידי &#39;תנועה לטשטש&#39; במהלך לכידת פרט מצטמצם עם השימוש בשיטה זו. זה Variני של 3D-SIM מציע מספר יתרונות אחרים על פני טכנולוגיות סופר זמין והדמיה ברזולוציה גבוהה אחרות הדמיה חיה על ידי ביולוגים תא חיידק. העלייה של 2 הקיפול ברזולוציה בכל 3 הממדים ויכולת תמונה עד 30 מיקרומטר למדגם מאפשרים הדמיה של תאי חיידקים (ויונקים) שלמים במהלך ניסוי. טכניקות כגון לוקליזציה מולקולה בודדת המבוצעות בדרך כלל בגל החולף לא יכולות להשיג את עומק החדירה לתוך מדגם ולא מציעות מידע על כל תאים. התקדמות שחל באחרונה, המאפשרות עומקי דגימה גבוהים יותר לטכניקה זו עלולה לגרום לרזולוציה צירית טובה יותר של תאים שלמים. בנוסף, טכניקות לוקליזציה מולקולה בודדת שדורשות אלפי תמונות גולמיים שתירכשנה גם הם מוגבלים במסגרת השיעור שניתן ללכוד ועשויה לדרוש פשרה בין מסגרת שיעור לכידה והרזולוציה מרחבית השיגה האולטימטיבית, כרזולוציה מרחבית תלויה ב מספר ערבNTS נרשם בתוך מרחב מוגדר. הפחתת מספר המסגרות שנתפסו תגרום לרזולוציה מרחבית נמוכה יותר אבל עשוי להיות מספיק כדי להשיג את הרזולוציה של הזמן דרוש לתהליך הביולוגי של עניין. זמן התאוששות בין המסגרות עשוי גם צריך להיות מוגבר על מנת למזער phototoxicity בתאים חיים וכך להגביל את המשך ותדירות שבה ניתן להשיג בזמן סדרה. טכניקות ברזולוציה גבוהה כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM) או אלקטרונים cryotomography (ECT) הצעה עלו ברזולוציה מעל 3D-SIM (ושיטות מיקרוסקופיה אחרות ברזולוציה הסופר אופטיות) אך חייבת להתבצע על דגימות קבועות. התיקון והעיבוד עשוי להציג את הממצאים וחוסר התיוג עלול להפוך פרשנות קשה. יש ECT ללא תווית ניגוד עני ויכול להשיג מעמקי חדירת מדגם של כ 500-200 ננומטר 24, כך שגם אם החלבון של עניין ניתן לזהות, את המבנה של החלבון בתא חיידק שלם לא יכול להיות שנצפה.גם כאשר תיוג יכול לשמש בEM, כגון עם immunogold, ההדמיה מתבצעת רק ב2D. 3D הוא בר השגה רק עם חתך דק ושחזור ממוחשב של החתכים. חתך הדק דורש טכנאי מנוסה אבל יכול להיות בעייתי ולגרום לחפץ. עם תאי חיים או קבועים, 3D-SIM אינו צריך להיות מוטבע באופן ספציפי ותאים יכולים להיות מוכנים במהירות להדמיה במצב טבעי קרוב. שיטה זו היא קלה יחסית ליישום על ידי חוקרים בעלי ניסיון מינימאלי במיקרוסקופ פלואורסצנטי. ניתן לבצע ניסויים בתקשורת שתומכות בתפקוד תא בריא, כל עוד זה לא לזרוח או ליצור אות רקע שלא לצורך. לתאי חיידקים, זה יכול לאפשר את השימוש בסוגים רבים של מורכבות ותקשורת מינימאלית או השימוש בתקשורת מוצקה או חצי מוצק לשלוט תנועתיות תא חיידק. ביולוגים רבים שכבר מהונדס חלבון פלואורסצנטי (FP) איחודים ובדק את הפונקציונליות שלשילובים אלה יכולים לקחת עד טכנולוגיה זו במהירות ללא הנדסה ואימות עם שילובי FP photoactivatable חדשים נוספות. מצאנו, כהתבוננות כללית, שס aureus היה רגיש יותר לphotobleaching במהלך הדמיה עם שילובי FP מאשר ב &#39; subtilis. תוך שימוש בשיטות שלנו המקוריות 3D-SIM, שבו דפוס הרשת נוצר על ידי צורם פיזי, לא הצליחו לבצע הדמיה תא חי עם מספר של ס &#39; שילובי aureus FP. עם זאת, עם שיטת f3D-SIM מתקדם זה, היינו יכול תמונת איחודי FP אלה ולבצע סדרת זמן קצרה כדי ללכוד את הדינמיקה של חלבונים המתויגים אלה. זוהי ככל הנראה בשל זמני חשיפה המופחתת דרושים להדמיה והגדילו זמן בין מסגרות להתאוששות תא. OMX Blaze 3D-SIM הוא טכנולוגיה זמינה מסחרי שיכול להיות יחסית קלה ליישום במעבדה בודדת או מתקן הדמיה ליבה. יש להקפיד לבצע את הטכניקה כדי למנוע Artiעובדות בשל הכנת מדגם עניה או לכידת תמונה ירודה. ברגע שהטכניקה היא שולטת, מחקרים של מבנה חלבון ודינמיקה באורגניזמים קטנים כגון חיידקים יכולים להתבצע בקרינה בודדת או מרובי צבעים.

מספר טכנולוגיות הדמיה שונות שימש במשך השנים ללמוד חיידקים כוללים אלקטרונים שונים וטכניקות מיקרוסקופיה אופטיות. בעוד במיקרוסקופ אלקטרונים מציע רזולוציה גבוהה ביותר, עד לננומטר, את הצורך בואקום ושימוש בחומרי ניגוד מוגבל בטכניקה זו כדי דגימות קבועות ומוטבעות. יכולים גם להיות הציגו חפצים בשל הכנת מדגם ארוכה ויש צורך ברופא מיומן כדי להכין את הדגימות, וכדי לנתח ולפרש את התמונות וכתוצאה מכך. מיקרוסקופיה אופטית מציעה את היתרונות של הכנת מדגם פשוט והיישום של תוויות מרובות בקלות יחסית בהשוואה למיקרוסקופ אלקטרונים. שימוש בחלבוני ניאון וconjugates צבע, היכולת ללמוד תאי חיים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא גם אפשרי. עם שיפורים ביציבות בfluorophore וגודל / מבנה חלבון פלואורסצנטי המוביל לירידה ברעילות תאים, כמו גם התקדמות בtechn זיהוי מצלמהology, מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות שדה רחב ומערכות הדמיה confocal הרחיב באופן משמעותי את ההבנה של הדינמיקה המרחבית של תאים שלנו. שימוש בשיטות אלה, הידע שלנו על תא חיידק -20 השנים האחרונות התקדם מאוד להשקפה הרבה יותר מפורטת שמגלה רמה גבוהה של ארגון מבני וחלבונים בתוך תא חיידק 1. עם זאת, בשיטות מקובלות של מיקרוסקופיה אופטית הן עקיפה מוגבל, מה שאומר שהרזולוציה הטבועה היא כמחצית מאורך הגל של אור העירור משמש. כתוצאה מכך, אפילו עם מערכת מיקרוסקופיה אופטית הקונבנציונלית האופטימלית ביותר, ברזולוציה הרוחב הטובה ביותר הוא על 220-250 ננומטר והרזולוציה הצירית היא כ -500 ננומטר (לסקירה ראה Schermelleh et al. 2). לביולוגים של תא חיידקים בפרט, זה עדיין מגביל את ההבנה של הארגון המרחבי של תאים הזעירים אלה שלנו; להיות 1-2 מיקרומטר רק בקוטרeter ו1-10 מיקרומטר באורך. יש גם צורך בטכניקות ברזולוציה גבוהה יותר שניתן לבצע על תאי חיים שבו התנהגות מרחבית דינמית של חלבון יכולה להיות מנותחת על מנת להשלים בנתונים חוץ גופית. במהלך העשור האחרון, מספר טכניקות דימות פלואורסצנטי ברזולוציה הסופר פותחו. מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר מתארת ​​טכניקות הדמיה שכפולות לפחות הרזולוציה לרוחב השגה עם מיקרוסקופ אור הקונבנציונלית, ובכך להתגבר על המחסום העקיפה. טכניקות אלו לתפעל את התאורה ו / או ניתוח של האור הנפלט כדי ליצור עליות ריאליות ברזולוציה הנראית לעין. כרגע יש שלושה סוגים עיקריים של טכניקות ברזולוציה סופר - i) מגורה מיקרוסקופיה דלדול פליטה 3 (STED); ii) מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה בודדת, כולל טכניקות כגון מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivation 4,5 (PALM), מיקרוסקופיה שיקום האופטית סטוכסטיים <sדלדול מדינה עד&gt; 6 (STORM), STORM הישיר 7 (dSTORM), והקרקע עם תשואת מולקולה בודדת 8 (GDSIM); וiii) מיקרוסקופיה תאורה מובנה 9-12 (SIM). טכניקות לוקליזציה מולקולה בודדת להציע העליות הגדולות ביותר ברזולוציה לרוחב, עד שבין 10-40 ננומטר בדגימות ביולוגיות. ביישומים רבים של מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה בודדת, עומק הדגימה מוגבל לגל החולף וההטמעות הראשוניות של STED גם היו מוגבלים בעומק הדגימה. שיפורים עם זאת, ההתקדמות האחרונה כגון שימוש באופטיקה מסתגלת, ניצול של אסטיגמציה בפונקצית נקודת התפשטות במוקדים שונים, זיהוי רב מטוס ושימוש בשתי מטרות להסיק העמדה הצירית של האור הנפלט ראו בשני הצירי מעמקי רזולוציה ודגימה בשני לוקליזציה מולקולת STED ואחת 13,14. שיעורי רכישת נתונים לSTED וטכניקות לוקליזציה מולקולה בודדתגם איטיים יחסית בשל המספר הגדול של תמונות שצריכות להיות שנרכשו עבור רזולוציה מקסימלי (עד 50,000 לטכניקות לוקליזציה). רכישת נתונים איטית זה לא להשאיל את עצמה להדמיה של דגימות חיות בלי שינויים מותאמים אישית, כי הם לעתים קרובות יקרים למדי. שתי טכניקות אלה כיום בצורה אופטימלית מתאימות לדגימות קבועות (לסקירה ראה 2,15), לעומת זאת, הרבה עבודה נעשית כדי לטפל במגבלה זו. שלוש מיקרוסקופיה תאורה המובנה ממדית (3D-SIM) היא טכניקת שדה רחב המשפרת את שניהם ברזולוציה לרוחב וצירית וכתוצאה מכך החלטות של כ 110 ו280 ננומטר, בהתאמה. עומק של דגימה הוא עד 30 מיקרומטר מcoverslip, המאפשר הדמיה של כל תאים. הווריאציה של 3D-SIM שפותחה על ידי Sedat, Agard, וGustaffsson על הפלטפורמה אופטית מיקרוסקופ הניסיוני (OMX) כרוכה מאירה את המדגם עם דפוס רשת ידוע אשר עבר ל15 שוניםעמדות בכל מטוס z 9-11. השוליים בדפוסי moire וכתוצאה מכך שנוצרים בחלל תדר מחוץ לאזור הנצפה נמדדים. המידע משטח התדירות הוא המחשוב משוחזר כדי ליצור תמונה ברזולוציה סופר גלויה 10,11. המהירות היחסית שבה ניתן לרכוש התמונות גולמי באמצעות טכניקה זו מאפשרת הדמיה של תאי חיים. עם זאת, חשוב לשים לב כי לתהליכים ביולוגיים המתרחשים בזמן בקנה מידה של שניות, שיעור הרכישה של התמונות הגולמיים הוא עדיין איטי מדי כדי ללכוד שינויים דינמיים. זמן סדרה עם קצב לכידה של שניות ל, רכישה החוזרת ונשנית ללא זמן התאוששות מספיק יכולה להוביל לphototoxicity וphotobleaching, במיוחד במהלך ההדמיה חיה של תאי חיידקים קטנים. כדי להתגבר על בעיות אלה, ההתקדמות האחרונה ל3D-SIM המהיר (f3D-SIM) פותחו. כאן אנו מתארים אחד הידוע בשם OMX Blaze 16 שהיה אניntroduced בסוף 2011. טכנולוגיה זו יוצרת תאורה בדוגמת ללא שימוש ברשת פיזית כפי שמשמש במערכות קודמות. השימוש בהתערבות קרן אור וטכנולוגיה תריס חדש מאפשר יצירה של האור בדוגמת על המדגם באופן מהיר מאוד. המהירות של רכישת תמונה הייתה עוד יותר משופרת עם ההקדמה של מוליכים למחצה תחמוצת מתכת משלימים מדעי מצלמות (sCMOS), במיוחד בהשוואה למצלמות הקיימות EMCCD. שינויים אלה הביאו לשיעור רכישת תמונה אפשרי של מסגרת אחת לשנייה לעומק דגימה של 1 מיקרומטר (512 x 512 פיקסלים, 9 z-פרוסות), המאפשר ניטור של שינויים דינמיים בתוך תאים המתרחשים בתוך שניות 16. הירידה בפעמים לכאורה חשיפה (עירור) לחיות תאי שימוש בשיטה זו מאפשרת גם סדרה מורחבת זמן להיות בשבי או עלייה בשיעור הלכידה. כאן אנו מתארים את היישום של מיקרוסקופיה f3D-SIM לexaminדואר המבנה ותנועה דינמית של טבעת cytokinetic Z בתאים של שני מיני חיידקים: subtilis Bacillus אורגניזם מודל בצורת המוט והפתוגן האנושי coccoid Staphylococcus aureus. FtsZ הוא חלבון cytoskeletal כמו טובולין-שממלא תפקיד מרכזי בחלוקת תא בחיידקים 17,18. זה localizes לאתר החטיבה לגייס לפחות 20 חלבוני חטיבה אחרים, ויצר מנגנון חלוקת 17,18, והוא האמין כדי לספק הכוח לתא התכווצות 19-23. שיטה זו מגלה כי FtsZ מופץ הטרוגני סביב טבעת Z בשני אורגניזמים בהסדר כמו חרוז; פתרון השאלה האם טבעת Z היא החגורה אחידה רציפה סביב התא, כמו דמיין ידי מיקרוסקופ הקונבנציונלי רחב בתחום הקרינה, או מבנה רציף כפי שהוצע על ידי cryo-טומוגרפיה של אלקטרון (ECT) 24 הארוכה שנערך. אנו מראים כיצד היכולת של 3D-SIM בהרבה יכולה לשפר את הבחינה המרחבית של זעיר (1קוטר מיקרומטר) תאים עגולים כמו ס &#39; aureus שמחלק בשלושה מישורים ברציפות בניצב (x, y, z). מחקרי זמן לשגות תוך שימוש בטכניקות אלה מראים כי המבנה של טבעת Z הוא דינמי, עם ברוטו ארגון שינויים בתוך הטבעת, ולא מולקולות FtsZ נעו פנימה וחוצה של פיגום קבוע 24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="663">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Agarose I (Biotecnology grade)</td>
			<td style="width:161px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:119px;">0710-500G</td>
			<td style="width:167px;">Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridinium Dibromide (FM 4-64)</td>
			<td style="width:161px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">T-13320</td>
			<td style="width:167px;">Lipophylic dye used for staining cell membranes.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:216px;">1.5 ml microtube, graduated Natural</td>
			<td>Scientific specialties Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1210-00</td>
			<td style="width:167px;">Made from Homopolymer polypropylene, Used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Luria broth base, Miller&#160;</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">241420</td>
			<td style="width:167px;">Prepared according to manufacturer&#39;s instructions. Add 2%?? after autoclaving&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">210932</td>
			<td style="width:167px;">Prepared according to manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Adhesive frame</td>
			<td style="width:161px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ABGAB-0577</td>
			<td style="width:167px;">&#160;Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15x16mm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microscope cover glass</td>
			<td style="width:161px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">111512-9</td>
			<td style="width:167px;">22x22 No 1 Thickness</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">35 mm diameter petri dish with a glass coverslip bottom</td>
			<td style="width:161px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:119px;">FD35-100</td>
			<td style="width:167px;">Known as FluoroDish with this company. Dish: &#216;35mm, Glass: &#216; 23mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0378-25G</td>
			<td style="width:167px;">Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lincomycin hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L6004-5MU</td>
			<td style="width:167px;">Make a 25 mg/ml stock in 50% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Erythromycin&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Boehringer Mannheim GmbH</td>
			<td style="width:119px;">12390120-14</td>
			<td style="width:167px;">Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Combined Orbital/Linear Shaking waterbath&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Grant scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">OLS-200</td>
			<td style="width:167px;">Shaking speed used for cultures: 215 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">UV visible Spectrophotometer</td>
			<td style="width:161px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:119px;">UV-1601</td>
			<td style="width:167px;">600 nm wavelength was used for measuring Optical density of bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:161px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5415R</td>
			<td style="width:167px;">Pellets of bacterial culture were obtained by spidding down mid exponentially growing cultures at 8000 for 30 seconds&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">15502-10G</td>
			<td style="width:167px;">Prepare 1M stock and filter sterilze prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">softWoRx software</td>
			<td style="width:161px;">Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td>
			<td style="width:119px;">version 5.0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Imaris data analysis software</td>
			<td style="width:161px;">Bitplane Scientific Software, Bitplane AG</td>
			<td style="width:119px;">version 7.0.0</td>
			<td style="width:167px;">Matlab XTensions included</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module.</td>
			<td style="width:161px;">Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Blaze module fitted on OMX V3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Upright fluorescence microscope</td>
			<td style="width:161px;">Zeiss Axioplan 2&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of the cytokinetic z ring in live bacteria using fast 3d-structured illumination microscopy (f3d-sim)

הדמיה של דגימות ביולוגיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי התקדמה באופן משמעותי בטכנולוגיות חדשות כדי להתגבר על מחסום הרזולוציה של דיפרקציה של אור המאפשר רזולוציה סופר של דגימות חיות. כרגע יש שלושה סוגים עיקריים של טכניקות ברזולוציה סופר - דלדול פליטה מאולץ (STED), מיקרוסקופיה מולקולה בודדת לוקליזציה (כולל טכניקות כגון PALM, STORM, וGDSIM), ומיקרוסקופיה המובנה תאורה (SIM). בעוד טכניקות לוקליזציה-מולקולה בודדת STED ולהראות העליות הגדולות ביותר ברזולוציה, הם היו איטיים יותר מה להציע מהירויות מוגברות של רכישת תמונה. SIM תלת ממדי (3D-SIM) הוא טכניקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב שמציעה מספר היתרונות על פני שתי לוקליזציה מולקולה בודדת וSTED. רזולוציה משופרת, עם רזולוציות טיפוסיות לרוחב והצירי של 110 ו280 ננומטר, בהתאמה ובעומק של דגימה של עד 30 מיקרומטר מcoverslip, המאפשרתהדמיה של תאים שלמים. הפיתוחים אחרונים (מהיר 3D-SIM) בטכנולוגיה להגדיל את שיעור הלכידה של תמונות גולמיים מאפשרים לכידה מהירה של תהליכים ביולוגיים המתרחשים בשניות, תוך צמצום צילום רעילות וphotobleaching משמעותי. כאן אנו מתארים את השימוש בשיטה אחת כזו לתמונת תאי חיידקיים מחסה חלבון fluorescently שכותרת cytokinetic FtsZ להראות כיצד תאים מנותחים והסוג של מידע ייחודי שטכניקה זו יכולה לספק.

Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM at JoVE.com

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

super-resolution-imaging-cytokinetic-z-ring-live-bacteria-using-fast

Research

JoVE Journal

Biology

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

19.8K Views.  University of Technology, Sydney. Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring. 

Video: Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualizing חיידקים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

דוגמאות מבחן לייעול STORM סופר רזולוציה מיקרוסקופית

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

תלת מימדי סופר רזולוציה מיקרוסקופית של סיבים F- אקטין ידי interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופית (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

יישום של מיקרוסקופיית מהירות רזולוציה סופר מהיר ב ריסי העיקרי בשידור חי

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים לזמן-מיקרוסקופ תאורה מובנה לפקיעה

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...