גרנט: 5RO1GM086447-02.

1. לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן תקשורת LB עם מושבה בודדה של זן JB281 [BW25113 / pJB042 (P אק: FtsZ-mEos2)]. לגדול בלילה שייקר על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל את תרבות 1:1,000 לM9 + תקשורת מינימאליים [מלחי M9, גלוקוז 0.4%, 2 מ&quot;מ, 4 MgSO 0.1 המ&quot;מ CaCl 2, חומצות אמינו ויטמינים וממ] ותגדל לשלב יומן האמצע-(OD 600 = 0.2-0.3) בנוכחות chloramphenicol (150 מיקרוגרם / מ&quot;ל) בטמפרטורת חדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום לתרבות עם 20 מיקרומטר IPTG ל2 שעות (ראה הערת המס &#39;1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות גלולה בmicrocentrifuge (8,000 סל&quot;ד, דקות 1) וresuspend בנפח שווה של M9 +; חוזרת. לאחר resuspension השני, להמשיך את הצמיחה בRT עבור 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התרבות מושרה עם paraformaldehyde 4% ב PBS (pH = 7.4) בRT עבור 40 דקות. תרבות גלולה וresuspend בנפח שווה של PBS; חוזר. אם תאים חיים הדמיה, דלג קיבעון, תרבות גלולה, וResuspend עם נפח שווהשל M9 - [מלחי M9, גלוקוז 0.4%, 2 המ&quot;מ 4 MgSO, 0.1 המ&quot;מ CaCl 2, חומצות אמינו ממ]; חוזרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל חרוזי זהב 1:10 עם תרבות resuspended. החל מדגם לחדר הדמיה שהוכן (ראה שלב 2.4). </li></ol> הערה [1]: פרוטוקול האינדוקציה לעיל (1.1-1.3 צעדים) כבר מותאם למערכת הביטוי של זן JB281. תנאי אינדוקציה מפורטות עשויים להשתנות בהתאם למערכות אחרות ביטוי או חלבונים של עניין. 2. אסיפה של לשכת ההדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 3% (w / v) פתרון agarose בM9 -. ממס agarose על 70 מעלות צלזיוס בבלוק חום עליון ספסל עבור 40min. החנות נמסה agarose ב 50 מעלות צלזיוס למשך עד 5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופית microaqueduct נקיה במחצית העליונה של חדר הדמיה עם אלקטרודות פונות מטה. יישר את האטם התחתון בשקופית microaqueduct כך שתכסה את ערוצי זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחול ~ 50 μl של agarose נמס למרכז הזכוכיתשקופית. מייד עליונת טיפת ג&#39;ל agarose עם coverslip נקי ויבש. אפשר ג&#39;ל לגיבושו RT למשך 30 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנקות coverslips: לארגן coverslips במכל קרמיקה וsonicate במשך 20 דקות בסיבוב אמבטיות של אצטון, אתנול ו1M KOH בצנצנות זכוכית. חזור על התרגיל שלוש פעמים במחזור, עבור סכום כולל של 9 sonications, ואחרי sonication יחיד בDH 2 O. אחסן את coverslips ניקה בד&quot;ה הטריה 2 O. לפני שימוש, לפוצץ coverslips היבש עם אוויר מסונן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את coverslip, עוזב כרית ג&#39;ל בשקופית microaqueduct. מייד להוסיף μl 1 מתוך מדגם תרבית תאים (ראה שלב 1.6) לראש כרית ג&#39;ל. חכה ~ 2 דקות, המאפשר פתרון לייקלט על ידי כרית ג&#39;ל. כרית ג&#39;ל למעלה עם coverslip חדש נקי ויבש. להרכיב את חדר ההדמיה השלמה בהתאם להוראות יצרן. </li></ol> 3. יבוא תמונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מיקרוסקופ, המצלמה ולייזרים. פתח MetaMorph רךהכלי (התקנים מולקולריים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מסנני עירור / פליטה מתאימים בדרך ההדמיה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת סמכויות והגדרות ליזר רכישה בהתאם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 488-nm ליזר = 15 mW (ראה הערת המס &#39;2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 561-nm הליזר = 75 mW </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 405 ננומטר הליזר = 2 mW ± מסנן צפיפות ניטראלי (ראה הערת המס &#39;3) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נעילת תא הדמיה לבמה באמצעות מתאם השלב המשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעד אזור הדמיה מתאימה (100x100 פיקסלים), כי הוא האיר homogenously על ידי כל השלושה הלייזרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את אזור מדגם המכיל שני תאים וסמני fiducial (חרוזי זהב) בסמיכות אך לא חופפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס על פני השטח של תאים הקרובים ביותר לcoverslip. לרכוש תמונת brightfield עם זמנו 50 מילי אינטגרציה והעברת המוקד 0.5 מיקרומטר לתוך המדגם (איור 3Ai). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונה פלואורסצנטי ירוקה הרכב עם עירור מ488-n<html> מ &#39;ליזר באמצעות זמן אינטגרצית ms 50 (איור 3Aii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש הזרמת וידאו במסלול אדום עם תאורה רציפה מ 405 ננומטר ולייזרים 561-nm. לתאים קבועים, שיעור 50 מילי מסגרת משמש עבור סכום כולל של 20,000 מסגרות (~ 17 דקות סך הכל) עם כוח הליזר 405 ננומטר ramped ידי ~ 10% כל 1,000 מסגרות (ראה הערת המס &#39;4). לתאים חיים, שיעור של 10 אלפיות מסגרת משמש עבור סכום כולל של 3,000 מסגרות (סה&quot;כ ~ 30 ים) בכוח ליזר מתמיד 405 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את המיקוד בחזרה למשטח התחתון של התאים ולרכוש תמונה אחרת brightfield כמו בשלב 3.7. </li></ol> [2] הערה: העצמה המשולבת של הקרינה הירוקה של תא עומדת ביחס ישר למספר הכולל של mEos2 FtsZ מולקולות לידי ביטוי בתא. כוח העירור 488-ננומטר והגדרות רכישה פלואורסצנטי הרכב חייבים להישמר קבוע לכל התאים כך שיחסית FtsZ-mEos2 רמות ביטוי בתאים שונים ניתן להשוות. ontent &quot;&gt; [3] הערה:. תאים קבועים הם צלמו עם צפיפות הניטראלית (ND) המסנן (1 איור, רכיב אופטי # 5) במקום על מנת להשיג שיעור הפעלה איטי, כך שכל מולקולה בודדה ניתן לזהות במדויק מסנן ND מוסר כאשר הדמיה לחיות תאים להגביר את קצב ההפעלה, תוך שמירה על סבירות נמוכה של שתי מולקולות שהופעלה בו זמנית באזור עקיפה מוגבלת. הקצב המהיר להחיל הדמיה לחיות תאים נדרש כדי להקטין את זמן הרכישה הכולל, כך &quot;הקפאה&quot; Z-הטבעת בזמן ובכך מגביל את ההשפעה של ניזקי שמש לתא. [4] הערה: המספרים של מסגרות שנרכשו היו מותאמים למערכת שלנו ותלויים במבנה התאי המסוים, תיוג צפיפות, קצב הפעלה ואם למצות את כל המאגר של fluorophores חשובים לניתוח. בתאים חיים, חשוב לקבל מספר מספיק של מגויר בתקופה קצרה של TIככל האפשר כדי למנוע את הטשטוש של התמונה עקב תנועה של המבנה התאי. 4. בניית תמונת PALM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת מיקום של כל נקודה centroid זוהה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את ערימת התמונה לתוך Matlab (MathWorks, Inc). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את ערמת התמונה לאזור שסביב תא אחד שאינו כולל את כל חרוזי fiducial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר סף עצמה לאיתור מקום שנמצא מעל רמת הרקע, אך מתחת לממוצע עוצמת המקום. אנו מהווים וריאציה ברמת רקע לאורך כל ניסוי על ידי החישוב הממוצע פועל עוצמתו המרבית באמצעות חלון מסגרת 150. סף העצמה לכל מסגרת ואז אינטרפולציה מהערכים הממוצעים הריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיסור הסף המתאים מכל מסגרת. כתמים פוטנציאליים מזוהים כשלושה פיקסלים סמוכים עם עוצמות מעל הסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את עוצמת הקרינה של כל מקום פוטנציאלי לGaussia דו ממדיםפונקצית n [משוואת # 1] באמצעות אלגוריתם ריבועים לפחות קוי (איור 2). דיוק הלוקליזציה של כל נקודה מחושב לפי המספר הכולל של פוטונים שאותרו [המשוואה # 2]. כל נקודה גרועה כושר, עם דיוק לוקליזציה יותר מ 20 ננומטר (תאים קבועים) או 45 ננומטר (תאי חיים) נמחקה (ראה הערת המס &#39;5). כל נקודה בעצמה גדולה יותר מכפול מממוצע העצמה, אולי בשל emitters החופף, גם מושלכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאים קבועים, להסיר תצפיות חוזרות ונשנות של אותה המולקולה על ידי התעלמות מכל נקודה שהיא בעמדת centroid 45 ננומטר מכל נקודה אחרת שקדמה לו על ידי 6 מסגרות או פחות. לתאי חיים, את כל הנקודות נשמרות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל להיסחף מדגם באמצעות תנועת הסמן fiducial. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזירת אזור פיקסל 10x10 סביב סמן fiducial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיסור הסף המתאים שנקבע ב4.1.3 מכל מסגרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתאים לפרופיל בכל העוצמתמסגרת באמצעות אלגוריתם מתאים לפחות בהנחה מרובע צורת גאוסי דו ממדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב תזוזה בין העמדות ביחס למסגרת 1 centroid. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את עמדת centroid של כל מולקולה ייחודית מזוהית עם 4.1 בסחף המדגם המתאים מחושב ב4.2. השווה את תמונות brightfield נרכשו ב3.7 ו 3.10. אם תאים הם נצפו לנוע זה ביחס לסמני fiducial, הנתונים נזרקים החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את כל עמדות centroid המתוקנות על תמונה אחת מורכבת מפיקסלים ננומטר 15X15. עלילה כל מולקולה ייחודית כיחידה באזור פרופיל, דו ממדי Gaussian המרוכז בעמדת centroid עם סטייה שווה לדיוק הלוקליזציה [המשוואה # 2] סטנדרטית. התוצאה היא מפת צפיפות הסתברות, שבו עוצמתו של פיקסל היא פרופורציונלית לסיכוי למצוא מולקולה שבפיקסל (איור 3Aiv). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השוואה בין תמונות PALM לתמונות הרכב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Replot centroתפקידים כאיד ב4.4, אבל במישור באמצעות 150X150 פיקסלים ננומטר וסטייה שווה ל 250 ננומטר סטנדרטית. זה יוצר תמונת PALM שמחקה תמונת התאבכות מוגבלת, אשר ניתן להשתמש כדי להשוות, תמונת ההרכב עקיף המוגבלת שנרכשה ב3.8 (האיור 3Aiii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאשר כי המולקולות שהתגלו הן נציג של כל האוכלוסייה, להשוות את תמונת ההרכב המשוחזרת (האיור 3Aiii, צעד 4.5.1) עם תמונת ההרכב הניסיונית פלואורסצנטי (איור 3Aii, צעד 3.8) כדי לאשר ששתי התמונות מראות מבנים של צורה דומה , התמצאות ועצמה יחסית. </li></ol></li></ol> [5] הערה: דיוק הלוקליזציה המינימאלית הנדרש נקבע באופן אמפירי לכל שיטת הדמיה ידי התוויית את precisions של כל המולקולות למדגם נתון ובחירת חיתוך מתאים. 5. ניתוח תמונת PALM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת Z-טבעת Widtח וקוטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את תמונת PALM כדי להתמצא אנכי על ציר זמן של התא (איור 4 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזירת האזור תאי המכיל את Z-הטבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את העצמה המצטברת באמצעות הקרנת פרופיל אינטנסיביות לאורך הציר הארוך של התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתאים לפרופיל העצמה להפצת גאוס. רוחב הטבעת מוגדר כמרבי מלאת רוחב המחצית (FWHM) של התפלגות גאוס המצוידת (איור 4 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרויקט פרופיל העצמה המצטברת של 5.1.2 לאורך הציר הקצר של התא. קוטר הטבעת מוגדר כאורך המלא של פרופיל העצמה (האיור 4C). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זומם צפיפות FtsZ (ראה הערה # 6). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Replot עמדות centroid כב( 4.4), אך ללא פרופיל כזה, כי כל מולקולה ייחודית ניתן ערך של 1 והוקצתה לפיקסל המתאים לעמדת centroid אחת גאוס. בדרך זו, את עוצמתו של כלפיקסל מייצג את המספר הכולל של מולקולות שהתגלו בפיקסל. תמונת PALM הצפיפות יכולה גם להיות דמיין כמו עלילת מתאר (האיור 5E). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת רזולוציה מרחבית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רזולוציה מרחבית תיאורטית-ברת השגה: ליצור נציג כוחות הביטחון פלסטיני לכל המדגם באמצעות דיוק הלוקליזציה הממוצעת הנחוש של כל המולקולות אותרו ולחשב FWHM (משוואת המס &#39;3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רזולוציה מרחבית הושגה-בניסוי: לחשב את התזוזה הממוצעת בין תצפיות חוזרות של אותה המולקולה. </li></ol></li></ol> [6] הערה: השתמשתי PALM השתקפות הפנימית המוחלט (TIR-PALM, איור 1 ו 5) כדי להגביל את ההפעלה והעירור לשכבה דקה (~ 200 ננומטר) מעל לממשק התא / זכוכית. כך שמולקולות FtsZ רק קשורים בקרום הקרוב ביותר לcoverslip תזוהינה.

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center.">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li><li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase.">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li><li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+(ftsZ).">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li><li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli.">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li><li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings,+structural+homologs+of+tubulin+polymers.">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes.">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+(PALM).">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li><li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers:+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments.">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li><li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein.">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li><li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli.">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תמונות PALM מכילות מידע אודות ספירת מולקולה ועמדות בתוך תא, המאפשרים ניתוח מפורט של החלוקה והסידור של מולקולות חלבון המטרה שקשה להשיג באמצעים אחרים. להלן מתארים אמצעי זהירות שיש לנקוט כדי לחלץ מידע כמוני מדויק תוך שמירה על רלוונטיות הביולוגיות של תמונות PALM. אנחנו גם לחקור את המידע שניתן להשיג באמצעות תאי חיים טובים לעומת קבועים. לבסוף, אנו מציעים דרכים להשגת מידע רזולוצית סופר נוסף על מכונות חלוקת התא. השיטה שתוארה לעיל הייתה מותאמת להפקת תמונות PALM מדויקות בדרכים הבאות. ראשית, עלינו מאופיין ומותאם לפעולה התקינה של חלבון ההיתוך כדי להבטיח שהיא משמשת כסמן אמין למבנה Z-טבעת 10. שנית, אנו מכוילים ביטוי של חלבון ההיתוך שכן הן מעל ומתחת לביטוי תוצאותבהיווצרות מבנה חריגה 10,12,13. שלישית, בחר סף לקביעת מולקולה ייחודית (צעד 4.1.5) המבוססת על מאפייני fluorophore photoblinking 14. Photoblinking מסבך את הנחישות של מולקולות ייחודיות ואם התעלם, מוביל לovercounting של מולקולות בודדות. למרות overcounting אינו משפיע על מדידות ממד, זה להגביר מדידות צפיפות אבסולוטיות ועלול ליצור מראית העין של אשכולות שווא. כל הגורמים הללו צריכים להישקל בזהירות בעת יישום שיטה זו לחלבונים אחרים של עניין. הבחירה של תאי חיים או קבועים עבור הדמיה תלוי במידע ואת התפוקה הרצוי. הדמית Live-תא היא מהירים (30 שניות), אך רק דיווחים על מולקולות localizable (כלומר איטיות). בדרך כלל זה אומר שרק מולקולות קרום הקשורים הם נצפו בתאים חיים, ואילו תאים קבועים לספק מידע על כל המולקולות שכותרתו. Live-תא הדמית יחסי ציבורovides ממדים ברזולוציה גבוהה מבניים ומורפולוגיה, אבל לא יכול לספק מדידות צפיפות מולקולה מדויקות עקב התנועה של מולקולות בודדות. תמונות סלולריות קבועות יכולות לספק את כל המידע הזה, אבל דורשות רמת הפעלת UV נמוכה, כך שניתן לזהות מולקולות ייחודיות. זה מוביל לזמני הדמיה מורחבים (&gt; 15 דקות). בנוסף, קיבוע עלול לגרום לסטיות מבניות. כל הגורמים הללו צריכים להיות מאוזנים בעת הבחירה בו מדגם הקלד לשימוש. שיטת PALM שתארנו מספקת פרטים סופר רזולוציה של מבנה Z-הטבעת שניתן להשוות על פני זנים שונים, מצבי תא במחזור, ותנאי גידול. יישום החידושים טכנולוגיים האחרונים עשוי לספק תובנה נוספת במנגנון cytokinetic של Z-הטבעת. לדוגמה, מציג אסטיגמציה למסלול האיתור הוא הדרך הפשוטה להוסיף יכולת תלת ממדי (~ 100 ננומטר z רזולוציה) לillust ההתקנה האופטיתדורג באיור 1 15. כמו כן, במקביל ההדמיה של שניים או יותר חלבונים באותו הזמן הפכה לאופציה ריאלית בהופעתם המהירה של חלבוני ניאון photoactivatable ספקטרלי-מובחנים. לבסוף, התפתחות חלבון פלואורסצנטי שphotoactivates באופן עצמאי-UV תאפשר ניטור ארוך טווח של תא בודד מבלי ליצור הניזק לדנ&quot;א הנגרם על ידי תאורת ננומטר 405.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 50 x MEM חומצות אמינו </td><td> סיגמא </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> 100 x MEM ויטמינים </td><td> סיגמא </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46-102-RF </td><td></td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyde </td><td> אלקטרוני מדעי Micrsocopy </td><td> 15710-S </td><td></td></tr><tr><td> SeaPlaque GTG agarose </td><td> Lonzo </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 חרוזי זהב ננומטר </td><td> Microspheres-nanospheres </td><td> 790113-010 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 הדמיה קאמרית </td><td> BIOPTECHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מתאם שלב </td><td> אסי </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ ההפוך </td><td> אולימפוס </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> 1.45 NA, מטרת 60x </td><td> אולימפוס </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מצלמת iXon EMCCD </td><td> תידור טכנולוגיה </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488-nm ספיר ליזר </td><td> קוהירנט </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561-nm ספיר ליזר </td><td> קוהירנט </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ליזר CUBE 405 ננומטר </td><td> קוהירנט </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-resolution imaging of the bacterial division machinery

חלוקת תא חיידק דורשת הרכבה המתואמת של יותר מעשרה חלבונים חיוניים בmidcell 1,2. מרכזי לתהליך זה הוא ההיווצרות של suprastructure דמוי טבעת (Z-טבעת) על ידי חלבון FtsZ בתכנית חלוקת 3,4. Z-הטבעת מורכבת מprotofilaments FtsZ היחיד תקוע המרובים, וההבנה שההסדר של protofilaments בתוך Z-הטבעת תספק תובנה לתוך המנגנון של הרכבת Z-טבעת ותפקודו כמחולל כוח 5,6. מידע זה נותר חמקמק בשל מגבלות נוכחיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי במיקרוסקופ אלקטרונים. מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי אינו יכול לספק תמונה ברזולוציה גבוהה של Z-הטבעת בשל גבול השתברות אור (~ 200 ננומטר). אלקטרוני cryotomographic הדמיה זיהתה מפוזרת protofilaments FtsZ בג הקטן תאי crescentus 7, אבל קשה ליישם לתאים גדולים יותר כגוןחיידק או B. subtilis. כאן אנו מתארים את היישום של שיטת מיקרוסקופ פלואורסצנטי רזולוצית סופר, מיקרוסקופי לוקליזציה Photoactivated (PALM), כדי לאפיין כמותית הארגון המבני של ה coli Z-טבעת 8. PALM הדמיה מציעה היא ברזולוציה מרחבית גבוהה (~ 35 ננומטר) וסימון ספציפי כדי לאפשר זיהוי חד משמעי של חלבוני היעד. אנחנו מתויגים FtsZ עם mEos2 photoactivatable ניאון החלבון, אשר עובר מהירוק פלואורסצנטי (עירור = 488 ננומטר) לאדום פלואורסצנטי (עירור = 561 ננומטר) עם הפעלה ב405 ננומטר 9. במהלך ניסוי PALM,-mEos2 FtsZ מולקולות בודדות מופעלות stochastically ועמדות centroid המקבילות המולקולות הבודדות נקבעות עם &lt;דיוק ננומטר 20. תמונה ברזולוצית סופר של Z-טבעת אז שוחזר על ידי superimposing את העמדות של כל centroid-mEos2 FtsZ המולקולות זוהו. &lt;כיתת p = &quot;jove_content&quot;&gt; שימוש בשיטה זו, מצאה כי Z-הטבעת יש רוחב קבוע של ~ 100 ננומטר והוא מורכב מצרור רופף של protofilaments FtsZ חופפים זה לזה בשלושה ממדים. נתונים אלה מספקים קרש קפיצה לחקירות נוספות של השינויים התלויים מחזור התא של Z-10 הטבעת ויכולים להיות מיושמים לחלבונים אחרים של עניין.

באיור 3Aiv הוא עיבוד דו ממדים, ברזולוצית הסופר של Z-הטבעת שנוצרה משיטת הדמית PALM שתוארה לעיל. להלן אבקש לסכם מידע איכותי וכמוני, שניתן להשיג אותם. איכותי, ראה שZ-הטבעת היא מבנה לא סדיר, המאמץ תצורות מרובות (להקה יחידה או קשת סליל) שאינן מובחנים בתמונות פלואורסצנציה קונבנציונליות (איור 3A-להשוות Dii וד). תצפיות כגון אלה יכולים לשמש כדי לקבוע אחוזים מאוכלוסיית התא שמציגה תצורה מבנית מסוימת. אנחנו יכולים גם כמותית למדוד את ממדי Z-הטבעת. הגישה שלנו לקביעת רוחב הטבעת והקוטר מתואר בשלב 5.1 ומוצגת בתרשים 4. מאיור 4B, רוחב הטבעת היה determined להיות ננומטר 113 (FWHM). ערך זה הוא רחב יותר מרוחבו הצפוי של protofilament FtsZ בודד (ננומטר 5-10 המבוסס על במבחנת 11 EM). באיור 4C, קוטר הטבעת נמדד כ1050 ננומטר. קוטר זה יכול לשמש כדי לתאר כמותית את מידת ההתכווצות בעת חלוקת תא. גישת כמותית נוספת היא כדי לחשב את צפיפות המולקולה על ידי ספירת מספר המולקולות מקומיות בתוך אזור מוגדר. מדידת הצפיפות מספקת מידע על אופן הדוק מולקולות ארוזות במבנה. צפיפות מולקולה יכולה להיות מתוארת בשני מונחים יחסיים ומוחלטים. צפיפות יחסית (לדוגמה: חלק ממולקולות בZ-הטבעת לעומת התא השלם) מספקת מידע על החלוקה של מולקולות לאזורים סלולריים שונים. מדידת צפיפות מוחלטת היא מסובכת בשל עובדה שתמונת כף היד (איור 3Aiv) היא למעשה הקרנת 2Dשל אובייקט 3D. כדי לעקוף את הסיבוך הזה, אנחנו מעסיקים TIR-PALM, המגביל את המטוס לאיתור צד אחד של Z-הטבעת. את הנתונים המתקבלים מודגמים באיור 5E. מאחר שמולקולות המזימה מייצגות קבוצת משנה של אוכלוסיית FtsZ המוחלטת, הצפיפות נקבעת היא גבול תחתון של הצפיפות בפועל. הצפיפות המקסימלי נצפתה בתמונות טיר של Z-הטבעת מצביעה על כך שחלקים מסוימים מכילים חופפים protofilaments 10. <img src="/files/ftp_upload/50048/50048fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1. סכמטית פשוט של התקנת מיקרוסקופ שלנו. כל שלושה הלייזרים נשלטים על ידי תוכנת הדמיה התפתחה מנהג בMetaMorph שמאפשר שליטה מדויקת באורך גל העירור המתאים. הקו האפור הכהה מציין את נתיב אור העירור, ואילו קו האפור הבהיר מציין את נתיב הפליטה. לrefle הפנימי המוחלטמיקרוסקופיה ction (TIR), הפלטפורמה מתכווננת מתורגמת בניצב לנתיב האור כדי לשנות את זווית האירוע. <img src="/files/ftp_upload/50048/50048fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. סיכום של שיטת PALM. בתחילה, כל מולקולות FtsZ-mEos2 הם במצב הירוק פלואורסצנטי. בחשיפה לתאורה רציפה על ידי 405 561 ולייזרים, מולקולות בודדות מומרות stochastically למדינת פלואורסצנטי האדומה. קצב תהליך זה נקבע על ידי הכח של 405 הליזר, בעוד ששיעור photobleaching נקבע על ידי הכח של שניהם 405 ו561 ליזר. באופן אידיאלי, קצב ההפעלה וphotobleaching, מאוזן באופן כזה שרק מולקולה אחת מתגלה לכל מסגרת. לאחר מספר מספיק של מסגרות נרכשים, תמונות מעובדות בMatlab ידי התאמה כל מקום זוהה כמתואר בשלב 4.1. כל uniqאז מולקולת ue זממה (שלב 4.4) במישור אחד, ובכך ליצור תמונת PALM, מופיעה כאן בצבע פסאודו אדום. המסגרת סומנה באדום הייתה נחושה מכילה נקודה חוזרת מאותה המולקולה כמסגרת הקודמת ולכן לא נכללה בעת בניית תמונת PALM. <img src="/files/ftp_upload/50048/50048fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. תמונות מייצגות של תאים קבועים (A ו-B) וחיה (C ו-D) מבטאים FtsZ-mEos2. לכל התאים, את קווי המתאר והצורה כללית ניתן דמיינו בתמונת brightfield (אני). תמונות פלואורסצנציה אנסמבל (ii) נרכשות עם עירור מ488 הליזר (שלב 3.8) ומייצגות את ההתפלגות של כל הברכה של FtsZ-mEos2. תמונת ההרכב שחזרה מPALM הנתונים (iii, צעד 5.4) מספקת בדיקה איכותית לנאמן של השיטהייצוג של מבנה ההרכב הנכון. תמונת PALM נוצר (iv) היא הסיכום של כל-mEos2 FtsZ המגויר הייחודיות ומייצגת מפת צפיפות הסתברות לFtsZ-mEos2. מתווית התא מיוצגת על ידי הקו המקווקו הצהוב בתמונות שלישיות והרביעי. תאי A ו-C בתכנית FtsZ קונפורמציה להקה אחת, בעוד התאים B ו-D להמחיש FtsZ אימוץ קונפורמציה קשת סליל, שהוא בלתי ניתן לגילוי בתמונת ההתאבכות המוגבלת ההרכב (III). ברי קנה מידה, 500 ננומטר. <img src="/files/ftp_upload/50048/50048fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. א תמונת PALM מראה ייצוגים סכמטי של רוחב Z-טבעת (אדום) וקוטר Z-טבעת (ירוק). רוחב טבעת B. מחושבת על ידי התאמה האישית של העצמה המוקרנת יחד (הכחול של X) על ציר זמן של התא עם גאוס פונקציה (graקו Y) ולאחר מכן לקבוע FWHM (קו מקווקו אדום). הנה, את רוחב הטבעת נקבע להיות 113 ננומטר. קוטר טבעת ג נקבע על ידי השלכת 1 פרופיל האינטנסיביות לאורך הציר הקצר של התא ולאחר מכן חישוב אורך המלא (קו מקווקו ירוק) של פרופיל העצמה מעל האפס. הקוטר של Z-הטבעת נקבע להיות 1050 ננומטר. <img src="/files/ftp_upload/50048/50048fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. TIR-PALM מאפשר ספירה המדויקת של מולקולות. כמו באיור 3, תמונת brightfield (), תמונת פלואורסצנטי הרכב (ב &#39;), תמונה משוחזרת פלואורסצנטי הרכב (C) וPALM התמונה (ד) באות לידי ביטוי בתא נתון להביע FtsZ-mEos2. אותם נתונים המשמשים לבניית D הוא replotted כמזימת קווי מתאר של דן מולקולהsity (מולקולות לפיקסל) בדואר. מניתוח הצפיפות הזאת, FtsZ-mEos2 היה נחוש להיות נוכח באופן מקסימאלי 8 מולקולות לפיקסל. בגלל שכבה יחידה של protofilaments FtsZ תגרום צפיפות מקסימלית של 5 מולקולות לפיקסל 10, ניתוח זה עולה כי Z-הטבעת מורכבת ממספר שכבות של protofilaments FtsZ.

Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery at JoVE.com

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

אנו מתארים רזולוצית סופר שיטת הדמיה כדי לבחון את המבנה הארגוני של FtsZ טבעת החיידקים, מנגנון חיוני לחלוקת תא. שיטה זו מבוססת על ניתוחים כמותיים של מיקרוסקופיה תמונות לוקליזציה photoactivated (PALM) ויכולה להיות מיושמת על חלבוני cytoskeletal חיידקים אחרים.

הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

super-resolution-imaging-of-the-bacterial-division-machinery

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Views.  The Johns Hopkins University School of Medicine. אנו מתארים רזולוצית סופר שיטת הדמיה כדי לבחון את המבנה הארגוני של FtsZ טבעת החיידקים, מנגנון חיוני לחלוקת תא. שיטה זו מבוססת על ניתוחים כמותיים של מיקרוסקופיה תמונות לוקליזציה photoactivated (PALM) ויכולה להיות מיושמת על חלבוני cytoskeletal חיידקים אחרים.

Video: Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

אלקטרונים Cryotomography של תאים חיידקיים

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

דוגמאות מבחן לייעול STORM סופר רזולוציה מיקרוסקופית

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

הכנה, הדמיה, וכימות של מבחני תנועתיות Surface בקטריאלי

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

תלת מימדי סופר רזולוציה מיקרוסקופית של סיבים F- אקטין ידי interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופית (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

יישום של מיקרוסקופיית מהירות רזולוציה סופר מהיר ב ריסי העיקרי בשידור חי

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to chromatic aberration and the imperfect alignment of cameras, images acquired in each channel may be shifted, and magnified, as well as rotated relative to each other in any of the three dimensions. With the classical calibration method, chromatic shifts are measured by multicolor beads attached to the surface of a coverslip, and a number of software are available to measure the chromatic shifts from such calibration samples. However, chromatic aberration can vary with depth, change with observation conditions and be induced by the biological sample itself, thus hindering determination of the true amount of chromatic shift in the sample of interest and across the volume. Correcting chromatic shifts at higher accuracy is particularly relevant for super-resolution microscopy where only slight chromatic shifts may affect quantitative analyses and alter the interpretation of multicolor images. We have developed an open-source software Chromagnon and accompanying methods to measure and correct 3D chromatic shifts in biological samples. Here we provide a detailed application protocol that includes special requirements for sample preparation, data acquisition, and software processing to measure chromatic shifts in biological samples of interest.

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Correction of chromatic shifts in three-dimensional (3D) multicolor fluorescence microscopy images is crucial for quantitative data analyses. This protocol is developed to measure and correct chromatic shifts in biological samples through acquisition of suitable reference images and processing with the open-source software, Chromagnon.