עבודה זו נתמכה על ידי מארי קירי Reintegration גרנט (IRG249084). אנו מודים לכל חברי המעבדה Kurant.

כדי לעקוב אחר הדינמיקה של אישור אפופטוטיים תא in vivo שתי אוכלוסיות של תאים חייבים להיות מתויגים: תאי phagocytic ותאים אפופטוטיים. כדי לסמן אוכלוסיות תאי phagocytic אנו משתמשים שורת דרוזופילה המכילים את הסמן Simu-cytGFP, אשר תוויות תאים באופן בלעדי phagocytic בעובר: מקרופאגים, גליה והאאקטודרם 8. אפשר להשתמש בסמנים שונים לתאי phagocytic, כולל שורות המכילות נהג Gal4 hemocyte ספציפי (CRQ-Gal4) או גליה ספציפי Gal4 נהג (repo-Gal4) וכתב ניאון מקודד גנטי תחת שליטת כטב&quot;מ (כטב&quot;מ-GFP). כדי לפקח על תאים אפופטוטיים במהלך פינוי תאים אפופטוטיים אנו משתמשים אפופטוזיס שונה / סמני פאגוציטוזיס. Annexin V (בדיקות מולקולריות) משמש כסמן מוקדם לתאים אפופטוטיים 10; Phiphilux (OncoImmunin) הוא caspase-3 מצע fluorogenic, המשמש כapopto מאוחר יותראחותי סמן, וLysotracker (בדיקות מולקולריות) עובד כסמן phagosome. אנו מזריקים חומרים כימיים אלה באמצעות מערכת microinjection PicoPump PV 820. 1. מתכונן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק heptane: לפרוש קלטת דו צדדית ולשים עד כמה שאתה יכול בבקבוקון נצנץ, למלא עם heptane, לאטום את הבקבוקון עם Parafilm, וסלע במשך 24 שעות. הוסף heptane אם הדבק עבה מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו מאפשרים את הזבובים להניח על צלחת מחוממת מראש מיץ ענבים אגר + שמרים להדביק לשעה 2, ולאחר מכן להעביר את הצלחת עד 25 מעלות צלזיוס במשך 10-12 שעות (תלוי בשלב הרצוי) לפני ההקלטות לשגות microinjection וזמן של עוברים מוזרקים. אנו אוספים עוברים מהצלחות אגר נשמרו על 25 מעלות צלזיוס, ובכך לספק עובר מן השלב 15 או 16 של פיתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מחט: כדי להכין את המחטים להזרקה, אנו משתמשים בחולץ המחט &#39;מכשיר סאטר&#39; וסיבי זכוכית חומה דקים (צינור נימי FHC). הטיפ של נימים ונקווה שברהn לקוטר של 0.5-2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip עם דבק: באמצעות קצה פיפטה לפזר טיפת דבק heptane בשורה אחת באמצע של coverslip. לתת לו להתייבש במשך כמה שניות. הכן כמה coverslips אלה. </li></ol> 2. הכנת עובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עובר מצלחות אגר ולהעבירם למסננת תא (מדעי החיים SPL) באמצעות מברשת צבע נקי ומים זורמים. המסננת מתקיימת מעל כוס כדי לאסוף מים לבזבז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף עובר במסננת התא באמצעות מים עד שכל עיסת השמרים מוסרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבש את עודפי מים על ידי ניגוב מחוץ למסננת באמצעות Kimwipes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מסננת התא בצלחת פטרי נקי ולהוסיף מספיק אקונומיקה 50% כדי לכסות את העוברים במסננת התא. Dechorionate את העוברים במשך 2 דקות מדי פעם (2-3 פעמים) ערבובם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים בהרחבה עד שעוברים רופפים ריח אקונומיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מסננת התא לנקיצלחת פטרי ולכסות את העוברים עם מים כדי למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחיל הגדרת עוברים, טען μl 1 של המגיב הרצוי לשתי מחטים (לפעמים יכולה להיות סתומה מחט). זה לוקח בערך 5 דקות לנוזל להגיע לקצה המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חתיכה מלבנית של אגר מיץ ענבים ולמקם אותו בשקופית מיקרוסקופ. העברה עובר dechorionated מצלחת פטרי לפיסה אגר באמצעות מברשת צבע נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתיחה בחר כראוי מבוימת עוברים המבטאים את סמן GFP באמצעות מברשת צבע רטובה ומניח את כל עובר בסמוך לקצה של החתיכה אגר בשורה אחד אחרי השני (איור 1 א). העוברים צריכים להיות ממוקמים עם צד גחונם לphagocytosis הדמיה על ידי גליה במערכת העצבים המרכזית (CNS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקים כ -10 עוברים בשורה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצרף את העוברים לcoverslip מצופה באמצע עם רצועת דבק heptane (איור 1 ב, ג </strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את coverslip בתא ההתייבשות לכ -5 דקות (זה תלוי בלחות של החדר ואת הסכום להיות מוזרקים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ייבוש עד לכסות את העוברים עם שמן halocarbon 700 (Sigma), כדי למנוע התייבשות נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את coverslip בשקופית מיקרוסקופ עם העוברים פונים כלפי מעלה. אתה יכול לשים טיפת מים על השקופיות כדי למנוע ההעברה של coverslip. הם עוברים עכשיו הוא מוכן להזרקה. מיקום הזרקה הוא בדרך כלל בצד לרוחב באמצעו של העובר. </li></ol> 3. הזרקת עובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המחט לmicromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשבור את קצה המחט לשים את קצה coverslip בשדה הראייה ולהתאים את המחט לאותו מישור המוקד. מאוד להעביר בזהירות את coverslip עד שהוא פוגע בקצה המחט ושובר אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התמקדות בעוברים, למקם את המחט לתוך השמן ולוודא שאתה מקבל טיפת נוזל מהמחט. זה אומר שקצה המחט כברנשבר גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלי לגעת בבעל המחט להזיז את העובר לתוך המחט ולהזריק טיפה לעובר. להזיז את העובר משם ולהמשיך לשלב הבא עד שכל העוברים מוזרקים. </li></ol> 4. הדמיה אנחנו תמונה את העוברים במיקרוסקופ confocal הפוך עם מטרת 40X או 100X. אנחנו מחפשים עובר ממוקם יפה עם מערכת העצבים המרכזית באמצע, מה שמראה ביטוי של GFP חזק ותיוג טוב של תאים אפופטוטיים לאחר הזרקה. להקלטות זמן לשגות של עוברי חיות אנחנו בדרך כלל לבחור 5 או 6 פרוסות confocal (2 מיקרומטר עבה כל אחד). לאחר מכן, אנו עושים השלכה של 3 פרוסות (עובי מיקרומטר 6) על מנת לבחון תאים שלמים. אנו משתמשים בסמנים לתאים אפופטוטיים שהם יציבים ולא להלבין בקלות. כדי להימנע מהלבנת GFP לבצע הקלטות במרווחים של 60 שניות. במקרים מסוימים עובר עשוי להתחיל להתגלגלבזמן הקלטת וידאו. לכן, אנחנו נסתכל פעם בכמה זמן בהקלטה על מנת לעצור ולהתחיל מחדש במידת צורך.

<ol>
	<li>Kinchen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+to+die+for:+signaling+to+apoptotic+cell+removal+in+worm,+fly+and+mouse.">A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse.</a> Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).</li><li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+going+through+the+acid+test.">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).</li><li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+signaling:+you+can+touch,+but+you+can't+eat.">Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat.</a> Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).</li><li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+elegant+complexity.">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li><li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+cells:+getting+rid+of+the+corpses.">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).</li><li>Henson, P. M., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+removal+in+development+and+tissue+homeostasis.">Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis.</a> Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).</li><li>Kurant, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+the+CNS+clear:+glial+phagocytic+functions+in+Drosophila.">Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila.</a> Glia. 59, 1304-1311 (2011).</li><li>Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-microns-under+acts+upstream+of+Draper+in+the+glial+phagocytosis+of+apoptotic+neurons.">Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons.</a> Cell. 133, 498-509 (2008).</li><li>Mergliano, J., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-independent+cell+engulfment+mirrors+cell+death+pattern+in+Drosophila+embryos.">Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos.</a> Development. 130, 5779-5789 (2003).</li><li>van den Eijnde, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+exposure+of+phosphatidylserine+during+apoptosis+is+phylogenetically+conserved.">Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved.</a> Apoptosis. 3, 9-16 (1998).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אישור תאים אפופטוטיים הוא שלב אחרון קריטי של אפופטוזיס, שהוא מאוד דינמי. לכן לימודים בזמן אמת של התהליך הם בעלי חשיבות עליונה. כאן אנו מתארים פרוטוקול המאפשר ניטור של אישור תאים אפופטוטיים בחיים עובר תסיסנית מתפתחים. בהליך זה, שתי אוכלוסיות של תאים חייבים להיות מסומנות באמצעות סמנים ספציפיים: תאים וphagocytes אפופטוטיים. כתב Simu-cytGFP מתאים לניטור מקרופאגים phagocytic, גליה והאאקטודרם בו זמנית באותו העובר, W hich מאפשר לעקוב אחר אוכלוסיות תאי phagocytic שונות באותו הזמן. זהו יתרון גדול ללימוד &#39;מקצועי&#39; ו &#39;לא מקצועי&#39; אישור במקביל, משווה היבטים ספציפיים של התהליך, כגון קצב, סגוליות ויכולת השפלה. חסרון של גישה זו הוא שסמן Simu-cytGFP בא לידי ביטוי מאוד חזק במקרופאגים וחלשים בהרבה בגליה, שעלולה להיות מסובכת לכוונון באותו הסרט. עם זאת, אפשר אישור תמונת אפופטוטיים תא על ידי מקרופאגים בנפרד מתהליך זה של מערכת העצבים המרכזית, על ידי הנהיגה הביטוי של GFP עם Gal4s הספציפי (CRQ-Gal4 למקרופאגים וריפו-Gal4 לגליה). סמנים שונים לתאים אפופטוטיים המשקפים שינויים מולקולריים ומורפולוגי ספציפיים הם בעלי ערך רב להבנת הדינמיקה וההפיכות של אפופטוזיס ואישור תא. יתר על כן, הקלטות בזמן אמת של פינוי תאים אפופטוטיים באמצעות סמנים אלה להוסיף מידע נוסף על פנוטיפים שעברו מוטציה, אשר לא יכול להיות מושגת על ידי שימוש בטכניקות אימונוהיסטוכימיה קונבנציונליות בעוברים קבועים. הצעד הקשה ביותר של הפרוטוקול המתואר, כאשר ההדמיה של מערכת העצבים המרכזית מתפתחים, הוא המיצוב המדויק מאוד של העוברים לפני ההזרקה. אפילו מהלך קל של coverslip במהלך ההתקשרות של מוכןעוברים לדבק יכולים לשנות את עמדתם, שלא תהיה מתאימה להדמיה של מערכת העצבים המרכזית. העובר מצרף צעד צריך להיעשות עם תשומת הלב מרבית. פיתוח של סמנים נוספים לשלבים מסוימים באפופטוזיס וphagocytosis יהיה רצוי מאוד לנתיחה עדינה ומניפולציה אפשרית של אישור תאים אפופטוטיים. הפרוטוקול המובא כאן משמש כבסיס טוב לפיתוח עתידי.

החיסול התקין של תאים לא רצויים או חריגים באמצעות אפופטוזיס וphagocytosis הבא הוא קריטי להתפתחות עוברית, כמו גם לאיזון רקמות במבוגר. Phagocytosis של תאים אפופטוטיים או סילוק תאים אפופטוטיים הוא תהליך דינמי מאוד אשר ממשיך בארבעה שלבים: (1) גיוס של phagocytes לתאים אפופטוטיים (&quot;למצוא אותי&quot;), (2) הכרה בתא כיעד לphagocytosis ( &#39;אוכל אותי&#39;) ו (3) היבלעות, ואחריו (4) הבשלת phagosome והשפלה של החלקיקים אפופטוטיים 1-5. ישנם שני סוגים של phagocytes: מקרופגים &quot;מקצועיים&quot; ותאים דנדריטיים, ולא בשלה &quot;הלא מקצועי&quot; תאים שכנים רקמת תושבים, שהם חיוניים לשחרור מתאים אפופטוטיים במהלך מטזואניים פיתוח 6,7. בפיתוח דרוזופילה, חיסול התאים מיותרים באמצעות אפופטוזיס מתרחש בשלושה מ &#39;שלבים ראשון בעין, באמצע לעובר מאוחר, ואז באמצע שנתי הגולם, ושוב בבוגרים המוקדמים. במהלך embryogenesis חלקיקים אפופטוטיים יוסרו על ידי phagocytes &quot;מקצועי&quot;, מקרופאגים, ועל ידי האאקטודרם וגליה 8,9 &quot;לא מקצועיים&quot;. בעבודה הקודמת שלנו שזיהינו קולט phagocytic, שישה מיקרונים-תחת (Simu), אשר בא לידי ביטוי אך ורק בתאים phagocytic במהלך embryogenesis. באמצעות אמרגן Simu נוצר סמן ספציפי לאוכלוסיות תאי phagocytic (Simu-cytGFP) אשר מאפשרת לנו לעקוב אחר מקרופאגים, האאקטודרם וגליה במקביל בעובר חי 8 בפיתוח. בנוסף לכך, על ידי שימוש בסמנים ספציפיים לתאים אפופטוטיים בשלבים של אפופטוזיס שונים, אנו מסוגלים לעקוב אחר הדינמיקה של פינוי תאים אפופטוטיים in vivo.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Annexin V </td>
 <td>Molecular Probes</td>
 <td>A35108</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PhiPhiLux G2D2</td>
 <td>OncoImmunin</td>
 <td>A304R2G-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LysoTracker</td>
 <td>Molecular Probes</td>
 <td>L-7528</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Halocarbon oil 700</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>H8898</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Capillary tubing</td>
 <td>FHC </td>
 <td>30-30-0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell Strainer</td>
 <td>SPL</td>
 <td>93100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paintbrush</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

live imaging of apoptotic cell clearance during drosophila embryogenesis

החיסול התקין של תאים לא רצויים או חריגים באמצעות אפופטוזיס וphagocytosis שלאחר מכן (אישור תאים אפופטוטיים) הוא חיוני להתפתחות תקינה בכל היצורים מטזואניים. אישור תאים אפופטוטיים הוא תהליך דינמי מאוד קשר אינטימי עם מוות של תאים, תאים אפופטוטיים unengulfed נראים בקושי in vivo בתנאים רגילים. על מנת להבין את השלבים של אישור תאים אפופטוטיים השונים ולהשוות phagocytes &quot;מקצועי&quot; - מקרופגים ותאים דנדריטיים ל&quot; הלא מקצועי &quot;- תאים שכנים רקמת התושב, בהדמיה לחיות vivo של התהליך הוא יקר מאוד. כאן אנו מתארים פרוטוקול ללימוד אישור תאים אפופטוטיים בעוברים תסיסנית חיים. כדי לעקוב אחר הדינמיקה של שלבים שונים בphagocytosis אנו משתמשים סמנים ספציפיים לתאים וphagocytes אפופטוטיים. בנוסף, אנו יכולים לעקוב אחר שתי מערכות תא בלען במקביל: מקרופאגים &#39;מקצועיים&#39; ו &#39;חצי profeגליה &#39;ssional במערכת העצבים המרכזית בפיתוח (CNS). השיטה המתוארת כאן מעסיקה את עובר דרוזופילה כמודל מצוין ללימודים בזמן אמת של פינוי תאים אפופטוטיים.

מסגרות נציג מסרט שבו תאים אפופטוטיים מסומנים עם Annexin V, וגליה, האאקטודרם ומקרופאגים מסומנים עם Simu-cytGFP מוצגות באיור 2. כל מסגרת היא השלכה של 3 פרוסות 2 מיקרומטר כל אחד. העובר של שלב 15 ממוקם כראוי מראה את מערכת עצבים העובריים באמצע עם גליה שכותרתו היטב (ז). המקרופאגים (מ &#39;), שהם בעיקר מחוץ למערכת העצבים המרכזית, מראים ביטוי של GFP cytoplasmic חזק. תאי ectodermal גם מסומנים עם GFP cytoplasmic (ה). רבים תאים חיוביים Annexin V נתפסים בתוך ומחוץ למערכת העצבים המרכזיים. לעקוב אחרי אירוע ההיבלעות היא לא קל. אנחנו הדגישו אירוע אחד עם מלבן לבן שבו תא גלייה הוא יבלע חלקיקים אפופטוטיים. שימו לב להתנהגות החיטוט של תא גליה: לגעת בחלקיקים אפופטוטיים כמה פעמים בלי שתבלע אותו ולאחר מכן עד הסוף עם היבלעות של V Annexin שכותרתו תאים אפופטוטיים (איור 2 </חזק&gt;). סמנים נוספים לשלבי אפופטוטיים שונים יכולים לשמש באותה הפרוצדורה. <img src="/files/ftp_upload/50151/50151fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1. ייצוג סכמטי של הכנת עובר לmicroinjections. א שקופיות מיקרוסקופיות המכילות פיסת אגר שבעוברים מועברים לאחר dechorionation. כ -20 עוברים ממוקמים בקו אחד, בסמוך לקצה של החתיכה אגר, עם צד גחונם למעלה, להדמיה של מערכת העצבים המרכזית. ב coverslip המכילה רצועת דבק heptane באמצע. ג coverslip מ-B עם עוברים מצורף לרצועת דבק heptane. <img src="/files/ftp_upload/50151/50151fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. ניתוח דינמי של אישור תאים אפופטוטיים. הקלטת זמן לשגותים של אישור תאים אפופטוטיים בעובר בשלב 15. גליה (G), מקרופאגים (מ &#39;) והאאקטודרם (ה) מסומנים עם Simu-cytGFP (ירוק). תאים אפופטוטיים מסומנים בAnnexin V הניאון (אדום). מסגרות נבחרות א &#39;מסרט נציג מוצגים. תא גלייה יבלע תאים אפופטוטיים מתואר על ידי מלבן. ב &#39;סגור את נופים של המלבן המסומן.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis at JoVE.com

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

כאן אנו מתארים שיטה יעילה ללימוד דינמיקה של פינוי תאים אפופטוטיים<em&gt; In vivo</em&gt;. שיטה זו מעסיקה לחיות<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר כמודל רב עוצמה לphagocytosis הניטור של תאים אפופטוטיים באמצעות תיוג ספציפי של תאים וphagocytes אפופטוטיים.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

live-imaging-apoptotic-cell-clearance-during-drosophila

Google

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

13.4K Views.  Technion-Israel Institute of Technology. כאן אנו מתארים שיטה יעילה ללימוד דינמיקה של פינוי תאים אפופטוטיים In vivo. שיטה זו מעסיקה לחיות דרוזופילה עובר כמודל רב עוצמה לphagocytosis הניטור של תאים אפופטוטיים באמצעות תיוג ספציפי של תאים וphagocytes אפופטוטיים.

Video: Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

גישה גנטית הפוך כדי בדיקת יתירות פונקציונלית במהלך embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

הכנת הפרט תסיסנית ביצה צ&#39;יימברס הדמיה חיים

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאי קולטי אור

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

To detect healthy cells in whole animals that contain low levels of caspase activity, the highly sensitive biosensor designated CaspaseTracker was generated for Drosophila. Caspase-dependent biosensor activity is detected in long-lived healthy cells throughout the internal organs of adult animals reared under optimized conditions in the absence of death stimuli.

In vivo biosensor Tracks ללא אפופטוטיים caspase פעילות תסיסנית

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...