עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות גרנט NS-024,572 (לRSW).

1. כתם ההכנה עם Supravital צבעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרוטוקול נתיחת נחש הבירית לראות סטיוארט et al. 5 וטנג et al. 6 רקמות זוחלות נשארה פיסיולוגיות לזמנים ארוכים יותר, ועם פחות זיהום חיידקים, כאשר כל הזמן בטמפרטורות נמוכות (ראה להלן). רקמות יונקים בדרך כלל נשמרו בטמפרטורת חדר ומעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים צבע חיוני lysosomal, לפזר את הצבע ב1:5,000 הקר הזוחל אצבעות פתרון (0.2 מיקרומטר). דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לשטוף מספר פעמים עם אצבעות קרות. תמונה בהקדם האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לFM1-43 צביעה באמצעות גירוי KCl, לדלל את הצבע ב-high-KCl האצבעות 1:500 (7 מיקרומטר). דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 30-60 מרבי שניות. שטוף במהירות שלוש פעמים עם אצבעות קרות, ~ דקות 1 / שטיפה. תמונה בהקדם האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לFM1-43 צביעה באמצעות גירוי hypertonic (סוכרוז), לדלל את הצבע ב0.5 M אצבעות סוכרוז כאמור לעיל. דגירה על 4 &amp; #176; C למשך 2-5 דקות. שטוף כמו בשלב 1.3 לעיל עם אצבעות קרות. תמונה בהקדם האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים FM1-43 באמצעות גירוי חשמלי, ראה טנג et al. 6 בקצרה, ההכנה ממוקמת מנה המכילה תמיסת מלח פיזיולוגית וצבע. עצב מגורה עם רכבת מתוכנת מראש של 200 μsec פולסים מלבניים (~ 7 V, 30 הרץ, 18 μsec). שטוף כמו בשלב 1.3 לעיל עם אצבעות קרות. תמונה בהקדם האפשרי. </li></ol> 2. הגדר את ההכנה להדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכוון את ההכנה כך שמבנים של עניין הם קרובים ככל האפשר למטרת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוכה, לנצל את תא תחתון שמכיל להחליק את מכסה עגול דק. בדרך כלל, חדר ההדמיה צריך תחתית נירוסטה דקה עם תלוש 25 מ&quot;מ קוטר # 1 זכוכית עובי כיסוי במרכז. אם נעשה שימוש במיקרוסקופ זקוף, coverslip תחתון הוא לא חובה אבל שימושיכדי לאפשר הדמיה עם אור מועבר (למשל התערבות ההפרש לעומת זאת, DIC) כדי לכוון את הדגימה ולאתר אובייקטים של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אובייקטיבי מתאים לקבל את ההחלטה ב3D הגבוהה ביותר האפשרית. ישנן פשרות בין צמצם מספרי (na), מרחק עבודה, הגדלה, וסוג של עדשה (יבש, מים ונפט טבילה). להכנות דקות כמו תרביות רקמה, מטרות נפט הן הטובות ביותר. השימוש במיקרוסקופ זקוף, לצוף להחליק את מכסה על האמבט המימית, ולהשתמש בשמן טבילה בין החלק העליון של להחליק את המכסה והאובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תוכנת deconvolution משמשת, הספק עשוי לספק פונקציות שנקבעו מראש נקודת התפשטות (PSFs) למטרות מסוימות. אם אין מידע כזה מסופק, או אם מטרה שאינה נתמכת נבחרה, לקבוע את כוחות הביטחון הפלסטיניים על ידי הדמיה ממוזערת ניאון או אובייקטים עקיפה מוגבל דומים 7,8. </li></ol> 3. להקים את עומק הרצוי של שדה ומספר ImaGES הרצוי לכל מסגרת זמן לשגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בעומק הכולל של שדה, כך שהעברה או אינטראקציה מבנים של עניין לא נעלמים או ללכת מחוץ לפוקוס, כאשר הם עוברים בכיוון-z. Z-השדה צריך מעט לחרוג מהממד האנכי של התא בתהליך או תא להיות הדמיה. למסופים מנוע חוליות, 15-20 מיקרומטר הוא טיפוסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את צעד Z-ציר צורך שלכל תוספת של מוקד. החלטה לאורך ציר Z-משתנה בהתאם מאפיינים של המטרה; זה בערך רבע מרזולוצית מישור XY. אם אחד confocal הדמיה או תוכנת deconvolution משמשת, ברזולוציה Z-ציר משופרת. שפר את ההחלטה סופית על ידי דגימת יתר מכוונת בכיוון-z 5, אבל ראית גם צעד 3.3 להלן. מרווח צעד אופייני הוא בטווח של 400-1,500 ננומטר למטרות 40-100X. אור צריך להיות מוגף מבין כל תמונת Z-צעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מספר התמונות לZ-מחסנית, כלומר העומק הרצוי של שדה מחולקעל ידי מרווח הצעד. זמן כדי להשלים את Z-מחסנית טיפוסית הוא 1-10 שניות. אובייקטים הנעים במהירות (100 ננומטר / sec) יכולים להופיע מטושטשים בערימת תמונת 3D משום שכל מטוס תמונה מתאים לנקודת זמן שונה במקצת. כמו כן, כל תמונה נוספת תורמת לphotobleaching וphototoxicity האפשרי (ראה דיון). אם אחד המצב נוגע, לבחור Z-צעד גדול יותר כדי לאסוף פחות תמונות לכל מחסנית. לפצות מאוחר יותר באמצעות תוכנת אינטרפולציה תמונה (שלב 6.3 בהמשך). </li></ol> 4. בחר מסגרת שיעור הזמן לשגות בחירה לפי ניסויי שיעור, כי הוא פשוט מספיק כדי לפתור בצורה חלקה משתנה עם זמן, כגון תנועה, אינטראקציות או אירועי היתוך 9. על פי דגימה יכולה לייצר חפצי תנועה (טעויות דגימה), ואילו דגימת יתר שלא לצורך מגדילה את החשיפה לאור. לאסוף או רצף ארוך אחד או כמה רצפים חוזרים ונשנים של אותה הכנה, כל אחד עם סך מרווח קטן יחסית בזמן ( <e10 נקודות זמן x מרווח = 5 דקות 30 שניות&gt; מ &#39;לדוגמא). במידת האפשר, להציג את ההכנה עם תאורת epifluorescence מתמשכת בערך מהירויות תנועת הערכה, כולל סחיפה של כל ההכנה אם הוא קיים. 5. להשלים את כל הדמית החיה להכנה מסוימת הכנות זוחלים בדרך כלל להישאר חזקות עבור ~ שעה 1-2, יותר אם מקוררות. 6. לנתח את הנתונים על פי שימוש רצוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור את כל קבצי הנתונים הגולמיים. בעוד אחסון דיגיטלי הוא בדרך כלל לא בעיה, זמן עיבוד הוא משמעותי גם עם מחשבים אישיים מהירים או תחנות עבודה. מסיבה זו, יבול תמונות לתוך אזור של [ROI] ריבית. להבטיח כי האזור כולו של עניין הוא בחלון שנחתכו במהלך הזמן כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deconvolve תמונת ערימות באמצעות תוכנה מתאימה ופונקצית נקודת ההתפשטות הנכונה. לאשר החלטה שהוא השתפר וששום חפץ כבר נוצר על ידיאלגוריתם deconvolution. איור 3 מציג תמונות ירושלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באלגוריתם אינטרפולציה להרחיב רזולוציה לכאורה Z-ציר. התרחבות 6X מהפרדת מטוס בפועל תמונת 1.5 מיקרומטר להפרדת מיקרומטר לכאורה 0.25 הוא הציע. לחלופין, להשתמש בחלק שילוב של דגימת יתר (שלב 3.2) ואינטרפולציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע ניגודיות, בהירות, סינון רעש, photobleaching והתאמות עיבוד תמונה טיפוסיות אחרות אם תרצה בכך. סטנדרטים תמונת מניפולציה להכתיב כי עבור רוב העבודה מדעית, מן ראוי שאותם התיקונים שיחולו על כל התמונות, גם בתוך ערימה ובנקודות זמן שונות. התוצאה של התאמה מסוימת יש לבחון בין כל התמונות 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מצב תצוגה מיוחד ליצוא של נתונים. התצוגה הברורה ביותר היא וידאו סטריאו או באמצעות anaglyphs אדום ירוק או אדום הכחול (דוגמאות באיור 3), זוגות סטריאו, או לסירוגין שמאל / righהעין לא מסגרות עם משקפיים תריס. Anaglyphs מוגבל לצבע יחיד. שפר את עומק תמונה נראית לעין אם תרצה בכך כדי לשפר את הרזולוציה חזותית Z-ציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתנסות בשיפור טכניקות סינון ותמונה שונות. לדוגמא, סינון Laplacian שימושי כדי להגדיל את הניגודיות של מבנים קטנים מעל רקע. הבהירות של פיקסלים במרכזו של חלון הפעלה משופרת תוך בהירות של הסביבה היא מופחתת. שים לב שכמה שיטות סינון אינן פועלות היטב בשילוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל תיקון להיסחף אם יש תנועה משמעותית של התכשיר לאורך זמן. תנועה כזו היא נפוצה בחיים שריר, אפילו עם סמים הוסיפו לדכא את פוטנציאל פעולה ופוטנציאל הסינפטי. אלגוריתם רישום פיקסל (למשל. Imaris, תוצאות הלוואי של Adobe, תוסף TurboReg לImageJ) מיישר זמן לשגות תמונות ויכול להפחית, אבל בדרך כלל לא לבטל לחלוטין, תנועה כזו. </li></ol>

<ol>
	<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy-tips+and+tools.">Live-cell microscopy-tips and tools.</a> J. Cell Sci. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Tinevez, J. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+method+for+measuring+phototoxicity+of+a+live+cell+imaging+microscope.">A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope.</a> Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).</li><li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy.">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).</li><li>Snapp, E. L., Hegde, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+and+evaluation+of+FRETexperiments+to+measure+proteinproximities+in+cells.">Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).</li><li>Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late"+macroendosomes+and+acidic+endosomes+in+vertebrate+motor+nerve+terminals.">Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals.</a> J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).</li><li>Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroendocytosis+and+endosome+processing+in+snake+motor+boutons.">Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons.</a> J. Physiol. 582, 243-262 (2007).</li><li>McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+by+deconvolution+microscopy.">Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy.</a> Methods. 19, 373-385 (1999).</li><li>Swedlow, J. R., Platani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+using+wide-field+microscopy+and+deconvolution.">Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution.</a> Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).</li><li>Cromey, D. W., Taatjes, D. J., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+images+are+data:+and+should+be+treated+as+such.">Digital images are data: and should be treated as such.</a> Methods Mol. Biol. 931, 1-27 (2013).</li><li>Teng, H., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-mediated+endocytosis+near+active+zones+in+snake+motor+terminals.">Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals.</a> J. Neurosci. 20 (21), 7986-7993 (2000).</li><li>Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+active+zones:+hot+spots+for+endocytosis+in+vertebrate+nerve+terminals.">Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals.</a> J. Neurosci. 19 (12), 4855-4866 (1999).</li><li>Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L., Mendez-Vilas, A., Diaz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+recent+advances+in+live+cell+bioimaging.">Challenges and recent advances in live cell bioimaging.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. , 1495-1505 (2010).</li><li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+C.+elegans+embryos+using+an+epifluorescent+microscope+and+open+source+software.">Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

ההיבט הקריטי ביותר של ההדמיה 4D הוא ניהול של המשך ועוצמת חשיפה לאור. Photobleaching יורד יחס אות לרעש בתמונה ויכול להיות בעייתי או לא תלוי בגורמים שונים, לרבות בחירה של fluorophores. נזק ספציפי לרקמת חיה (phototoxicity) קשור לphotobleaching, ולעתים ניתן לזהות באמצעות בדיקות ניאון נועדו למטרה 2...

זמן לשגות הדמיה של רקמת חיה מספקת גישה חזותית ליחסי תפקוד והמבנה דינמיים, שלא ניתן להערכה בהכנות קבועות או חיים צילמו בנקודה אחת בזמן. לעתים קרובות, עם זאת, שהתגמול עבור גישה למידע זמני הוא ירידה ברזולוציה אופטית. מטרות נפט טבילה צמצם מספרי גבוהה הן מעשיות ברקמת חיה בגלל הטווח הצר שלהם בפוקוס, והשאירו את הטבילה במים או מטרות יבשות כחלופות בלבד. יתר על כן, ברזולוציה המוגברת המוענקת על ידי אופטיקה confocal לא יכולה להיות מנוצל בכמה הכנות חיים בשל phototoxicity מהרמות גבוהות היחסי של תאורה הנדרשת 1,2. לבסוף, בעוד כמה שיטות אופטיות בזמן אמת או זמן לשגות זמינות שרזולוציה משופרת ההצעה, תחולתם מוגבלת להכנות שבו מבנים של עניין יכולים להיות ממוקמות בתוך כמה מאה ננומטרים של המטרה 1. השיטה המתוארתעושה שימוש בציוד בעלות נמוכה יחסית, הוא תכליתי, ובכל זאת מציעה רזולוציה משופרת בהשוואה לטכניקות זמן לשגות יותר נפוץ בשימוש. הוא מיועד לשימוש במעבדות בודדות, כמו גם מתקני הדמיה. השיטה משתמשת במיקרוסקופ epifluorescence קונבנציונלי, בשילוב עם מצלמה דיגיטלית רגישה ועם חומרה שנועדה לרכוש במהירות סטים של תמונות במישורים שונים מעט מוקד (Z-ערימות). כל Z-מחסנית היא deconvolved דיגיטלי כדי להגדיל את הרזולוציה. תכונה אחת של 3D הדמיה זמן לשגות (4D) היא מעקב מדויק של העברת אברונים או מבנים אחרים. כאשר להגדיר כראוי, מבנים צילמו לא לצאת מפוקוס, ותנועה בכל שלושת הכיוונים ניתן להבחין ולכמת. לכן זה בלתי אפשרי עבור מבנה מוכתם להיעלם מעל מסגרות זמן לשגות אחד או יותר רק על ידי היסחפות מעל או מתחת למישור מוקד צר. השיטה משמשת גם ככלי רגיש להערכת האינטראקציות ופו האפשרישיאון של מבנים קטנים. epifluorescence הקונבנציונלי או תמונות confocal של מבנים סמוכים לגבול ההשתברות (כמה מאה ננומטר) לא לאשר מיזוג גם אם תמונות התמזגו להראות חפיפה של התוויות שלהם 3. היתוך הוא הציע, אבל זה עדיין אפשרי שהאובייקטים מופרדים אופקי או אנכי על ידי מרחק שהוא מתחת לגבול ההשתברות. שלוש או הדמיה ארבעת ממדים, לעומת זאת, מאפשרת צפייה באובייקטים בכל אחד משלושה כיוונים מאונך. המראה של היתוך בכל שלוש התצוגות מגדיל את רמת הוודאות. וגם, בכמה הכנות חיים, בבימוי או תנועה הבראונית של אובייקטים התמזגו putatively מספקת הוכחה נוספת, כאשר שני התוויות לנוע יחד בזמן. כמובן, כאשר סמוך לגבול השתברות רמת הוודאות במבני הבחנה מהרקע, או שמראה שהם מכילים שני צבעים (היתוך), אינה מוחלטת. אם טכניקות ישימות, מיוחדות, כגון העברת הקרינה תהודה אנרגיה (סריג)4, הם מתאימים יותר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:720px;" width="720">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:180px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:180px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SGC5</td>
			<td>Biotium [Hayward, CA]</td>
			<td>70057</td>
			<td>Final conc:10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FM1-43FX</td>
			<td>Invitrogen [Carlsbad, CA]</td>
			<td>F35335</td>
			<td>Final conc:7 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LysoTracker Red</td>
			<td>Invitrogen [Carlsbad, CA]</td>
			<td>L7528</td>
			<td>Final conc:0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Solutions:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reptilian Ringers pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>145 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>2.5&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>3.6&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>1.8&#160; mM</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KH2PO4 (Dibasic)</td>
			<td>1.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>5.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:21px;">High KCL Reptilian Ringers pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>&#160;86&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>&#160;60&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>3.6&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>1.8&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KH2PO4 (Dibasic)</td>
			<td>1.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>5.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:21px;">High Sucrose Ringers pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>145 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>2. 5 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>3.6&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>1.8&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KH2PO4 (Dibasic)</td>
			<td>1.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>5.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>0.5 M (17.1 gm/50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Comments(website)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Axioplan 200 inverted microscope</td>
			<td colspan="2">Carl Zeiss [Thornwood, NY]</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4mm&#160;</td>
			<td colspan="2">Carl Zeiss [Thornwood, NY]</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher</td>
			<td>Sutter instruments [Novato, CA]</td>
			<td>175W Xenon arc lamp</td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Lambda 10-2&#160; emission filterwheel switcher</td>
			<td colspan="2">Sutter instruments [Novato, CA]</td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensicam CCD camera</td>
			<td colspan="2">Cooke Instruments [Tonawanda, NY]</td>
			<td><a href="http://www.cookecorp.com/">www.cookecorp.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cascade 512 CCD camera</td>
			<td colspan="2">Photometrics [Tucson, AZ]</td>
			<td><a href="http://www.photometrics.com/">www.photometrics.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;">Imaging dishes- made in-house-11cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Comments(website)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slidebook 5.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations [Denver, CO]</td>
			<td>Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation</td>
			<td><a href="http://www.intelligent-imaging.com/">www.intelligent-imaging.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMARIS 7.5.2</td>
			<td>Bitplane [South Windsor, CT]</td>
			<td>Drift correction; 3D and 4D data presentation</td>
			<td><a href="http://www.bitplane.com/">www.bitplane.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AfterEffects CS6</td>
			<td>Adobe [San Jose, CA]</td>
			<td>Drift correction</td>
			<td><a href="http://www.adobe.com/">www.adobe.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ 1.46</td>
			<td>National Institutes of Health [Bethesda, MD]</td>
			<td>Multiple plugins available;Stereo pair construction</td>
			<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss LSM</td>
			<td>Carl Zeiss [Thornwood, NY]</td>
			<td>Stereo pair construction</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of endosome dynamics in living nerve terminals with four-dimensional fluorescence imaging

ארבעה ממדים (4D) אור הדמיה נעשתה שימוש כדי ללמוד את ההתנהגות של מבנים קטנים בתוך מסוף עצב המוטורי של transversus abdominis שריר הרזה של נחש הבירית. הנתונים גולמיים כוללים רצפים של Z-ערימות 3D זמן לשגות. כל ערימה מכילה 4-20 תמונות שנרכשו עם אופטיקה epifluorescence במטוסי מוקד מופרדים על ידי 400-1,500 ננומטר. שלבים ברכישת ערימות של תמונות, כגון התאמה של מיקוד, מיתוג של אורכי גל עירור, ותפעול של המצלמה הדיגיטלית, הם אוטומטיים ככל האפשר על מנת למקסם את קצב תמונה ולמזער את הנזק לרקמות כתוצאה מחשיפה לאור. לאחר רכישה, קבוצה של ערימות תמונה deconvolved כדי לשפר את הרזולוציה מרחבית, שהומר לפורמט 3D הרצוי, ומשמש ליצירה &quot;סרט&quot; 4D כי הוא מתאים למגוון רחב של ניתוחים מבוססי מחשב, בהתאם לנתונים הניסיוניים ביקשו. יישום אחד הוא מחקר של ההתנהגות הדינמית של שתי מעמדות של endosomes מצאו במסופים-macroendosomes עצב (MES)וendosomes חומצי (AES), שגדלים (200-800 ננומטר עבור שני הסוגים) הן ליד או לגבול ההשתברות. גישה למידע 3D בכל נקודת זמן מספקת מספר יתרונות על פני הזמן לשגות הדמיה קונבנציונלית. בפרט, גודל ומהירות תנועה של מבנים ניתן לכמת לאורך זמן ללא אובדן המיקוד חד. דוגמאות לנתונים מהדמית 4D עולים כי MES ניגש קרום הפלזמה ונעלמים, מה שמרמז שהם exocytosed ולא רק נעים אנכי ממישור אחד של מוקד. חשף גם הוא היתוך משוער של MES ו-AES, על ידי הדמיה של חפיפה בין שני המבנים המכיל צבען כפי שנצפו בכל שלוש תחזיות המאונכות.

הנתונים שמוצגים הם ממסופי התוקפת נחש (לראות תצוגות ההגדלה נמוכות וגבוהות באיור 3; צבע endocytic (FM1-43) הספיגה יוצר אובך שממלא כל אחד בוטון), ובפרט, macroendosomes (MES) וendosomes חומצי (AES) בתוך מסופים אלה 5. MES נוצרים על ידי אנדוציטוזה בתפזורת במהלך פעילות עצבית 10 ומספ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging at JoVE.com

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

הדמיה ארבעה ממדים (4D) מנוצל כדי ללמוד את ההתנהגות ואינטראקציות בין שני סוגים של endosomes בחיים מסוף עצב חוליות. תנועה של המבנים הקטנים האלה מתאפיינת בשלושה ממדים, המאפשרת אישור של אירועים כגון היתוך endosome וexocytosis.

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

visualization-endosome-dynamics-living-nerve-terminals-with-four

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K Views.  Washington University School of Medicine.  הדמיה ארבעה ממדים (4D) מנוצל כדי ללמוד את ההתנהגות ואינטראקציות בין שני סוגים של endosomes בחיים מסוף עצב חוליות. תנועה של המבנים הקטנים האלה מתאפיינת בשלושה ממדים, המאפשרת אישור של אירועים כגון היתוך endosome וexocytosis. 

Video: Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

In the vertebrate retina, phototransduction, the conversion of light to an electrical signal, is carried out by the rod and cone photoreceptor cells1-4. Rod photoreceptors are responsible for vision in dim light, cones in bright light. Phototransduction takes place in the outer segment of the photoreceptor cell, a specialized compartment that contains a high concentration of visual pigment, the primary light detector. The visual pigment is composed of a chromophore, 11-cis retinal, attached to a protein, opsin. A photon absorbed by the visual pigment isomerizes the chromophore from 11-cis to all-trans. This photoisomerization brings about a conformational change in the visual pigment that 
initiates a cascade of reactions culminating in a change in membrane potential, and bringing about the transduction of the light stimulus to an electrical signal. The 
recovery of the cell from light stimulation involves the deactivation of the intermediates activated by light, and the reestablishment of the membrane potential. Ca2+ modulates the activity of several of the enzymes involved in phototransduction, and its concentration is reduced upon light stimulation. In this way, Ca2+ plays an important role in the recovery of the cell from light stimulation and its adaptation to background light.
Another essential part of the recovery process is the regeneration of the visual pigment that has been destroyed during light-detection by the 
photoisomerization of its 11-cis chromophore to all-trans5-7. This regeneration begins with the release of all-trans retinal by 
the photoactivated pigment, leaving behind the apo-protein opsin. The released all-trans retinal is rapidly reduced in a reaction utilizing NADPH to all-
trans retinol, and opsin combines with fresh 11-cis retinal brought into the outer segment to reform the visual pigment. All-trans retinol is 
then transferred out of the outer segment and into neighboring cells by the specialized carrier Interphotoreceptor Retinoid Binding Protein (IRBP).
Fluorescence imaging of single photoreceptor cells can be used to study their physiology and cell biology. Ca2+-sensitive fluorescent dyes can be used to examine in detail the interplay between outer 
segment Ca2+ changes and response to light8-12 as well as the role of inner segment Ca2+ stores in Ca2+ homeostasis13,14. 
Fluorescent dyes can also be used for measuring Mg2+ concentration15, pH, and as tracers of aqueous and membrane compartments16. 
Finally, the intrinsic fluorescence of all-trans retinol (vitamin A) can be used to monitor the kinetics of its formation and removal in single 
photoreceptor cells17-19.

A method is described for the preparation of single living photoreceptor cells from different vertebrate species for fluorescence imaging. The method can be used to image the fluorescence of endogenous fluorophores, such as NADH or vitamin A, or that of exogenously added fluorescent dyes sensitive to Ca2+ or other factors.

הכנת מבודדים תאים חיים בעלי חוליות photoreceptor עבור דימות פלואורסצנטי

In the vertebrate retina, phototransduction, the conversion of light to an electrical signal, is carried out by the rod and cone photoreceptor cells1-4.  ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

גירוי מוחי עמוק עם fMRI סימולטני במכרסמים

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

ניטור אופטי של תיוג מסוף העצב חיים זקיק השיער אזמלי Endings של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עור אוזן עכבר

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into extracellular plaques of the brain. The A&#946; peptides, composed of 40 amino acids, are generated from amyloid precursor proteins (APP) by &#946;- and &#947;-secretases. A&#946; is deposited not only in cerebral parenchyma but also in leptomeningeal and cerebral vessel walls, known as cerebral amyloid angiopathy (CAA). While a variety of A&#946; peptides were identified, the detailed production and distribution of individual A&#946; peptides in pathological tissues of AD and CAA have not been fully addressed. Here, we develop a protocol of matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) on human autopsy brain tissues to obtain comprehensive protein mapping. For this purpose, human cortical specimens were obtained from the Brain Bank at the Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology. Frozen cryosections are cut and transferred to indium-tin-oxide (ITO)-coated glass slides. Spectra are acquired using the MALDI system with a spatial resolution up to 20 &#181;m. Sinapinic acid (SA) is uniformly deposited on the slide using either an automatic or a manual sprayer. With the current technical advantages of MALDI-IMS, a typical data set of various A&#946; species within the same sections of human autopsied brains can be obtained without specific probes. Furthermore, high-resolution (20 &#181;m) imaging of an AD brain and severe CAA sample clearly shows that A&#946;1-36 to A&#946;1-41 were deposited into leptomeningeal vessels, while A&#946;1-42 and A&#946;1-43 were deposited in cerebral parenchyma as senile plaque (SP). It is feasible to adopt MALDI-IMS as a standard approach in combination with clinical, genetic, and pathological observations in understanding the pathology of AD, CAA, and other neurological diseases based on the current strategy.

Molecular imaging with matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) allows the simultaneous mapping of multiple analytes in biological samples. Here, we present a protocol for the detection and visualization of amyloid &#946; protein on brain tissues of Alzheimer&#39;s disease and cerebral amyloid angiopathy samples using MALDI-IMS.

ויזואליזציה של הפקדות β עמילואיד במוח האנושי עם Desorption לייזר בסיוע מטריקס/הדמיה ספקטרומטר מסה יינון

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.

הכנת התינוק היילוד רקמת המוח עבור ניתוח בדיקת מבנית באולטרסאונד של הפצת שלפוחית סינפטית במסופי העצבים

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

הדמיה וניתוח של תעבורת Neurofilament בעצב שוקה עכבר excised

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...