אנו מודים לד&quot;ר פרד Rieke הסבר מינו של הכנת אגר מוטבע-פרוסה רשתית כשהתחלנו באמצעות פרוטוקול במעבדה שלנו. אנו מודים גם לורי Vaskalis להמחשה של סכמטית סקירה בני הזוג. Veeramuthu Balakrishnan ו Soyoun צ&#39;ו עבור הערות מועילות על טקסט ווידאו. עבודה זו נתמכה על ידי ניי-NIH RO1 מענק, והוא גם נתמך בחלקו על ידי קרן המחקר קוריאה גרנט ממומן על ידי ממשלת קוריאה [KRF-2008-357-E00032].

<ol>
	<li>Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levodopa+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">Levodopa motor complications in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).</li><li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+biological+samples:+localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS.">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li><li>Obeso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+and+origin+of+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease.</a> Neurology. 55, S13-S20 (2000).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncommunicable+Diseases+and+Mental+Health+Cluster,+Noncommunicable+Disease+Prevention+and+Health+Promotion+Department,+Ageing+and+Life+Course+.">Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course .</a> Active ageing: a policy framework. , (2002).</li><li>Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+disorders:+advances+in+cause+and+treatment.">Movement disorders: advances in cause and treatment.</a> Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).</li><li>Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+levodopa-induced+dyskinesias+in+Parkinson's+disease:+problems+with+the+current+model.">Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model.</a> Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).</li><li>Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-DOPA-induced+dyskinesia+in+the+rat+is+associated+with+striatal+overexpression+of+prodynorphin-+and+glutamic+acid+decarboxylase+mRNA.">L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA.</a> Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).</li><li>Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+fosB+expression+is+causally+linked+with+l-DOPA-induced+abnormal+involuntary+movements+and+the+associated+upregulation+of+striatal+prodynorphin+mRNA+in+a+rat+model+of+Parkinson's+disease.">Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).</li><li>Hanrieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+striatal+neuropeptides+revealed+by+imaging+mass+spectrometry.">Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry.</a> Molecular &#38; Cellular Proteomics. , (2011).</li><li>Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+imaging+mass+spectrometry:+molecular+snapshots+of+biochemical+systems.">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).</li><li>Ljungdahl, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Elevated+Nigral+Levels+of+Dynorphin+Neuropeptides+in+L-DOPA-Induced+Dyskinesia+in+Rat+Model+of+Parkinson's+Disease.">Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease.</a> PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).</li><li>Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+directly+from+tissue:+in+situ+tryptic+digestions+coupled+with+imaging+mass+spectrometry.">Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).</li><li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides:+3D+volume+reconstruction.">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction.</a> Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).</li><li>Deininger, S. -. O., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Mass Spectrometry. , 199-208 (2010).</li><li>Norris, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+MALDI+Mass+Spectra+to+Improve+Mass+Spectral+Direct+Tissue+Analysis.">Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis.</a> Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).</li><li>Ihaka, R., Gentleman, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Language+for+Data+Analysis+and+Graphics.">A Language for Data Analysis and Graphics.</a> Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).</li><li>Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass Spectrometry Binning Software GAB. , (2012).</li><li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response.">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).</li><li>Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ion+exchange+chromatography+and+radioimmunoassay+procedure+for+measuring+opioid+peptides+and+substance+P.">An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P.</a> Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).</li><li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidomics+strategies+for+specific+and+sensitive+identification+of+endogenous+peptides.">Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).</li><li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+database+designed+for+endogenous+peptides+and+mass+spectrometry.">a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).</li></ol>

אין לנו מתחרים אינטרסים לחשוף.

שלב קריטי וקשה בפרוטוקול שלנו היא העברת היצירה של הרשתית לתוך הפתרון אגר (פרוטוקול 3.4). יש צורך להסיר בזהירות את ההומור זגוגי פתרון פרוסה שיורית מן היצירה רשתית ולהעביר אותו ללא עיוות או כיפוף. כדי להשיג זאת, אנו משתמשים מרית קטנה (21-401-25B, Fisherbrand) עם קצה כפוף לטו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> אגר gelling בטמפרטורה נמוכה </td><td> סיגמא </td><td> A0701 </td><td> Agarose סוג ז&#39; </td></tr><tr><td> תיקון פיפטה </td><td> העולם מכשירים Precision </td><td> 1B150F-4 </td><td> חומה עבה (1.5 מ&quot;מ קוטר חיצוני) בורוסיליקט זכוכית </td></tr><tr><td> אנכי חולץ </td><td> Narishige </td><td> PP830 </td><td></td></tr><tr><td> שיניים שעווה </td><td> Cavex </td><td></td><td></td></tr><tr><td> האביב מספריים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td> 45 ° זווית מלקחיים קצה קנס </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> להב התער </td><td> Personna </td><td></td><td> פיפיות, לנקות עם 70% אתנול ו - H 2 O </td></tr><tr><td> גלילי צינור </td><td> Fisherbrand </td><td> 03-338-1B </td><td> מדגם פוליאתילן בקבוקונים 2.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> סיגמא </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome מבצעה </td><td> לייקה </td><td> VT1000S או VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> זקוף מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> BX51WI </td><td></td></tr><tr><td> המטרה 60x מים טבילה </td><td> אולימפוס </td><td> LUMPlanFl </td><td> NA 0.90 </td></tr><tr><td> מצלמת CCD </td><td> סוני </td><td> XC-75 </td><td></td></tr><tr><td> מצלמה בקר </td><td> Hamamatsu </td><td> C2400 </td><td></td></tr><tr><td> צג &lt;/ Td&gt; <td> סוני </td><td></td><td> 13 &quot;שחור ולבן לפקח </td></tr><tr><td> מזרק מסנן </td><td> Nalgene </td><td></td><td> 0.2 מיקרומטר </td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> סאטר Instrument </td><td> MPC-200 </td><td></td></tr><tr><td> Lock-in amplifier </td><td> HEKA </td><td></td><td> EPC-9/10 מגברים יש תוכנת אמולציה </td></tr><tr><td> ספינינג לייזר דיסק confocal מיקרוסקופ </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-X1 </td><td> הדמיה תא חי לאחר תיקון מהדק הקלטה התא כולו </td></tr><tr><td> Slidebook תוכנה </td><td> Intelligent הדמיה מכשירים (3i) </td><td></td><td> הדמיה וניתוח נתונים הרכישה </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> סיגמא </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> פוספט חיץ פתרון </td><td> GIBCO </td><td> 70013 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost שקופיות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td></td><td> שקופיות הזכוכית </td></tr><tr><td> נגד דהייה סוכנים </td><td> Biomeda קורפ. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Confocal מיקרוסקופ לייזר סורק </td><td> Carl Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td> הדמיה של רקמות קבוע </td></tr><tr><td> מרית </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-401-25B </td><td></td></tr><tr><td> מנואל אנכי מבצעה </td><td> Narishige </td><td> ST-20 </td><td></td></tr><tr><td> אורגון גרין 488 BAPTA-1 </td><td> Invitrogen </td><td> O-6806 </td><td> Ca 2 + צבע פלואורסצנטי רגיש </td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 555 Hydrazide </td><td> Invitrogen </td><td> A-20501MP </td><td> פלורסנט צבע </td></tr></tbody></table>

patch-clamp capacitance measurements and ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices

גירויים חזותיים מזוהים והועברה על פני טווח דינמי רחב של עוצמות אור ושינויים תדירות על ידי נוירונים מתמחים הרשתית החולייתנים. שתי כיתות של נוירונים, קולטני האור ברשתית תאים דו קוטבית, לעשות זאת באמצעות סרט מסוג אזורים פעילים, המאפשרים שחרור הנוירוטרנסמיטר מתמשכת תפוקה גבוהה על פני תקופות זמן ארוכות. על סוג המעורבות דו קוטבית (MB) תא מסופי ברשתית דגי זהב, אשר depolarize לגירויים אור ולקבל מוט מעורבת קלט חרוט photoreceptor, מתאימים ללימוד סרט מסוג סינפסות הן בשל גודל גדול שלהם (~ 10-12 מיקרומטר קוטר) וכן קשרים סינפטיים רבים שלהם לרוחב והדדית עם דנדריטים תא amacrine. גישה ישירה מסופי Mb דו קוטבית תא פרוסות דג זהב רשתית עם טכניקה טלאי-clamp מאפשר מדידת Ca presynaptic 2 + זרמים, קיבול שינויים קרום, משוב הדדי עיכוב סינפטי בתיווכו של GABA &lt;תת&gt; A ו-C קולטני GABA הביע על המסופים. Presynaptic קיבול הממברנה מדידות של exocytosis לאפשר אחד כדי ללמוד את הפלסטיות לטווח קצר של שחרור הנוירוטרנסמיטר מעוררים 14,15. בנוסף, גמישות לטווח הקצר ולטווח הארוך של שחרור נוירוטרנסמיטר מדכא מתאי amacrine יכול להיות גם נחקר על ידי הקלטות של עיכוב משוב הדדי להגיע למסוף Mb 21. במהלך פרקי זמן קצרים (למשל 10 ~ ים), משוב GABAergic עיכוב הדדי מתאי amacrine עובר לזווג הדופק דיכאון דרך דלדול בריכה GABA שלפוחית ​​11. הדינמיקה הסינפטי של הרשתית microcircuits בשכבת plexiform הפנימי של הרשתית כך ניתן ללמוד באופן ישיר. הטכניקה המוח פרוסה הוצג למעלה מ 40 שנה אבל הוא עדיין מאוד שימושי עבור חקירת התכונות החשמליות של נוירונים, הן סומה תא בודד, יחיד או דנדריט האקסון, ואת מ &#39;icrocircuit ברמה הסינפטית 19. רקמות כי הם קטנים מדי כדי להיות מודבק ישירות על גבי התא חיתוך לעיתים קרובות מוטבעים הראשון אגר (או להציב על גבי נייר פילטר) ופרוסים אז 20, 23, 18, ​​9. בסרטון הזה, אנו מעסיקים את הטכניקה מראש הטבעה אגר באמצעות הרשתית דגי זהב. חלק מסופי ענק דו קוטבית תא פרוסות שלנו הרשתית דגי זהב הם axotomized (האקסון לחתוך) במהלך ההליך חיתוך. זה מאפשר לנו לבודד אחד presynaptic מסוף תשומות עצב, כי הקלטה של ​​מסופי axotomized כולל את האותות מתא סומה, דנדריטים. לחלופין, אפשר גם להקליט מתאי Mb שלמים דו קוטבית, על ידי הקלטה של ​​מסופים המחוברים אקסונים שלא נותקו במהלך ההליך חיתוך. באופן כללי, השימוש בפרוטוקול זה הניסוי יסייעו לימודים של פיסיולוגית הסינפטי ברשתית, ניתוח Microcircuit פונקציונלי, שידור הסינפטי ב סינפסות סרט.

Watch this Scientific Journal Video about Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices at JoVE.com

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת אגר, מוטבע פרוסות רשתית המתאימים electrophysiology ו Ca2 + הדמיה. שיטה זו מאפשרת ללמוד סרט מסוג הסינפסות microcircuits הרשתית באמצעות תיקון ישיר, מהדק הקלטות של אחד מסופי העצב presynaptic.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

patch-clamp-capacitance-measurements-ca2-imaging-at-single-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

18.1K Views.  Oregon Health and Science University. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת אגר, מוטבע פרוסות רשתית המתאימים electrophysiology ו Ca2 + הדמיה. שיטה זו מאפשרת ללמוד סרט מסוג הסינפסות microcircuits הרשתית באמצעות תיקון ישיר, מהדק הקלטות של אחד מסופי העצב presynaptic.

Video: Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

שיטות הצמד תיקון הקלטות קיבול מן Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Biology

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

צמד תיקון הקלטה של ​​תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר Deafferentated רשתית העכבר

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using calcium-sensitive fluorescent dyes that change their emission intensity or wavelength depending on the concentration of free calcium in the cell. There are several methods used to stain cells with calcium dyes. Most common are the processes of loading the dyes through a micropipette or pre-incubating with the acetoxymethyl ester forms of the dyes. However, these methods are not quite applicable to neuromuscular junctions (NMJs) due to methodological issues that arise. In this article, we present a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump of the frog nerve into the nerve endings. Since entry of external calcium into nerve terminals and the subsequent binding to the calcium dye occur within the millisecond time-scale, it is necessary to use a fast imaging system to record these interactions. Here, we describe a protocol for recording the calcium transient with a fast CCD camera.

Here, we describe a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump into the nerve endings. We also present a protocol for the recording and analysis of fast calcium transients in the peripheral nerve endings.

טעינת צבע סידן לתוך צפרדע עצב צפרדע דרך גדם עצב: סידן חולף הרשמה צפרדע Neuromuscular צפרדע

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

דגירה ממושכת של רקמות חריפות עצביות עבור Electrophysiology ו-הדמית סידן

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

הערכת פעילות הסידן בשכבת תאי גנגליון ברשתית

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the impaired light-sensing photoreceptor cells in the degenerated retina, aiming to partially restore vision by inducing visual percepts. One common avenue of investigation involves the design and production of implantable devices with a flexible physical structure, housing a high number of electrodes. This enables the efficient and precise generation of visual percepts. However, with each technological advancement, there arises a need for a reliable and manageable ex vivo method to verify the functionality of the device before progressing to in vivo experiments, where factors beyond the device's performance come into play. This article presents a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer (GCL) following electrical stimulation. Specifically, the following steps are outlined: (1) fluorescently labeling the rat retina using genetically encoded calcium indicators, (2) capturing the fluorescence signal using an inverted fluorescence microscope while applying distinct patterns of electrical stimulation, and (3) extracting and analyzing the calcium traces from individual cells within the GCL. By following this procedure, researchers can efficiently test new stimulation protocols prior to conducting in vivo experiments.

Author Spotlight: גישה חדשנית לגירוי חשמלי עצבי באמצעות הדמיית סידן 

Retinal prostheses have the ability to generate visual perceptions. To advance the development of new prostheses, ex vivo methods are needed to test devices before implantation. This article provides a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer when subjected to electrical stimulation.

הדמיית סידן ברשתית שטוחה עם גירוי חשמלי

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca^{2 +} הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

שיטות הצמד תיקון הקלטות קיבול מן Calyx

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית

צמד תיקון הקלטה של תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר Deafferentated רשתית העכבר

טעינת צבע סידן לתוך צפרדע עצב צפרדע דרך גדם עצב: סידן חולף הרשמה צפרדע Neuromuscular צפרדע

דגירה ממושכת של רקמות חריפות עצביות עבור Electrophysiology ו-הדמית סידן

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

הדמיית סידן ברשתית שטוחה עם גירוי חשמלי

הדמיית סידן ברשתית שטוחה עם גירוי חשמלי

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

שיטות הצמד תיקון הקלטות קיבול מן Calyx

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית

צמד תיקון הקלטה של ​​תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר Deafferentated רשתית העכבר

טעינת צבע סידן לתוך צפרדע עצב צפרדע דרך גדם עצב: סידן חולף הרשמה צפרדע Neuromuscular צפרדע

דגירה ממושכת של רקמות חריפות עצביות עבור Electrophysiology ו-הדמית סידן

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

הדמיית סידן ברשתית שטוחה עם גירוי חשמלי

הדמיית סידן ברשתית שטוחה עם גירוי חשמלי

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca^{2 +} הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

צמד תיקון הקלטה של תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר Deafferentated רשתית העכבר