המחברים מבקשים להודות לגב &#39;מיקה Schaffrinski לקבלת הסיוע הטכני תמיד המעולה שלה במהלך השנים האחרונות. עבודה זו מומנה על ידי המועצה הגרמנית למחקר (DFG) בקבוצת המחקר המשותף 942 (FOR942) ועל ידי תכנית המחקר של הפקולטה לרפואה, גטינגן גיאורג אוגוסט-אוניברסיטה.

.1 הכנת סרום סטרילי AB האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 4-5 שקיות של פלזמה טרי קפואה (FFP). שקיות חנות ב -20 ° C עד מספיק תיקים כבר נאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר שקיות ודגירה של 30 דקות ב 56 מעלות צלזיוס באמבט מים כדי להשבית משלים ולהסיר הפיברין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות לחטא מחוץ לשקיות ולהעביר את הפלזמה ל50 צינורות מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר כדי להיפטר ממשקעים וטסיות דם שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכה כל supernatants וזורקים את כדורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות סרום Aliquot ב15 צינורות מ&quot;ל ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בסרום זמין מסחרי מומת חום נורמלי אנושי AB. </li></ol> .2 בידוד של המונוציטים כדי להקל על איזון של צנטריפוגות, מומלץ לעבד שני מעילים באפי במקביל. עם זאת, לקחת caמחדש להשתמש בחומרים נפרדים לכל תורם ולא לערבב את התאים. במקרה שלא ניתן להשיג את המעילים באפי בקלות, 400 מ&quot;ל של דם היקפי heparinized ניתן להשתמש במקום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא בזהירות את שקיות ניילון המכילות את המעילים באפי ולהעביר את התוכן של כל מעיל באפי לשני צינורות 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל מעיל באפי למלא שלושה 50 צינורות מ&quot;ל עם 15 מ&quot;ל פתרון Ficoll (1.077 g / ml). Ficoll צריך להיות בטמפרטורת חדר להכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבת 30-35 מ&quot;ל של דם המעיל באפי על גבי פתרון Ficoll לשיפוע הצפיפות הראשון. להיות זהיר כדי לעשות לאט ובזהירות זה על מנת למנוע ערבוב שני השכבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 400 ללא בלם 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל שיפוע לאסוף את הטבעת הלבנה של תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) אשר ממוקם בין שני השלבים עם פיפטה פסטר פלסטיק ולהעביר צינור 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלא כל צינור עם PBS-EDTA (1 מ&quot;מ) עד 40 מ&quot;ל בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG 300 10 דקות ללא בלם בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant ולשאוב לשטוף גלולה שוב עם 40 מ&quot;ל PBS-EDTA (1 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל בריכה שתורם כדורים ב20 מ&quot;ל RPMI-1640 ללא FCS% אדומים 10 + פנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון Percoll iso-האוסמוטי לשיפוע הצפיפות השני: לשני תורמים לערבב 23.13 מ&quot;ל פתרון Percoll (צפיפות: 1.131 גר &#39;/ מ&quot;ל) בצינור 50 מ&quot;ל עם 1.87 מ&quot;ל פי 10 PBS. לאחר מכן להעביר 23 מ&quot;ל של פתרון זה לצינור 50 מ&quot;ל חדש ולהוסיף 27 מ&quot;ל RPMI-1640 עם FCS% אדומים 10 + פנול כדי להשיג פתרון Percoll iso-האוסמוטי 46%. Percoll צריך להיות בטמפרטורת חדר להכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל העברה תורמת 25 מ&quot;ל של פתרון Percoll מוכן צינור מ&quot;ל 50 ושכבת פתרון PBMC הערוך 2.9) על גבי פתרון Percoll. להיות זהיר כדי לעשות את זה מאוד לאטד בזהירות, בשתי השכבות נוטות לערבב קלות. אם נעשה בצורה נכונה ניתן להבחין בין שני השלבים בשל ההבדל שלהם בצבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 550 XG ללא בלם 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל שיפוע לאסוף את הטבעת הלבנה של מונוציטים הנמצא בין שני השלבים עם פיפטה פסטר פלסטיק ולהעביר צינור 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלא כל צינור עם PBS-EDTA (1 מ&quot;מ) עד 50 מ&quot;ל בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 400 עבור 10 דקות ללא בלם בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ו resuspend את כדורים ב20 מ&quot;ל RPMI-1640 עם FCS% אדומים 10 + פנול. </li></ol> .3 התמיינות של מונוציטים להמקרופאגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר מונוציטים מבודדים בדילול 1:10 בכחול trypan. לספור רק את התאים הגדולים, לעתים קרובות לא סדירה בצורת, שהם מונוציטים. אל לספור את התאים הקטנים יותר, בצורה העגולה שהם לימפוציטים. NOTE: מספרים מונוציטים לא צריכים להיקבע גם באופן מדויק, כי לתת להם רק רמזו על כמה ואשר מצופה טפלון FEP שקיות (קטנות או גדולות) צריך לשמש להתמיינות התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל1.0-1.5 x 10 8 מונוציטים מתורם אחד, זרע התאים בשקית תרבית תאים מצופה טפלון FEP גדולה. עבור כל שקית להכין מדיום התרבות בהיקף של 174 מ&quot;ל RPMI-1640, 2% בסרום אנושי AB (כפי שהוכן בסעיף 1), 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו2.5 ng / ml M-CSF (נפח כולל: 180 מ&quot;ל). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל3.0-5.0 x 10 7 מונוציטים מתורם אחד, זרע התאים בשקית תרבית תאים מצופה טפלון קטנה. עבור כל שקית להכין מדיום התרבות בהיקף של 28.5 מ&quot;ל RPMI-1640, 2% בסרום אנושי AB (כפי שהוכנו בסעיף 1), 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו2.5 ng / ml M-CSF (נפח כולל: 30 מ&quot;ל). הערה: אם למשל, 8.0 x 10 7 מונוציטים מתקבלים, אנו ממליצים לזרעם בtwo שקיות נפח קטנות יותר עם ​​4.0 x 10 7 תאים כל אחד. במקום M-CSF, יכולים לחלופין להיות מובחנים מונוציטים עם גורם מקרופאג granulocyte מגרה מושבה (GM-CSF) באותו הריכוז (2.5 ng / ml). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את ההשעיה התא (20 מ&quot;ל) למדיום מוכן ומערבבים היטב. אם שתי שקיות מוכנות מתורם אחד, להוסיף 20 מ&quot;ל RPMI-1640 להשעית התא ולאחר מכן להוסיף חצי מההשעיה לכל הכנה בינונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: כדי לקבוע אם הכנת מונוציטים נשארה סטרילי, לקרוע ירידה של ההשעיה תא אחד על צלחת אגר דם ודגירה במשך לילה על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדק את הנדן של 50 מ&quot;ל perfusor מזרק על התוספת של שקית תרבית תאים מצופה טפלון FEP ולמלא אותו בהשעית התא מוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את המזרק ולדחוף את האוויר שנותר מחוץ לשקית. סגור את השקית עם קונוס סגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקיות של 6-7 ימים ב3776; C עם 5% CO 2. </li></ol> .4 מקרופאג קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקיות תרבית תאים מצופים טפלון FEP עם מקרופאגים המובחנים על קרח למשך שעה לפחות 1 כדי להקל על ניתוק של התאים (דגירה של עד 3 שעות אפשרית). לוודא כי פני השטח של התיק כולו מכוסה בקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את השקית עם לחץ מינימאלי 10x מעבר לקצה שולחן / לוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא בזהירות מחוץ לתיק ולהסיר את חרוט הסגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדק מזרק 50 מ&quot;ל בתוספת של התיק, להסיר את ההשעיה התא, ולהעביר אותו ל50 צינורות מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 400 עבור 10 דקות בטמפרטורת חדר כדי לסובב את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant וברכת כדורים משקית אחת ב10 מ&quot;ל RPMI-1640 10 + FCS% בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את מספר התא בhemocytometer (1: 4-1: 10 דילול בכחול trypan). לספור את התאים עגולים הגדולים בלבד. הערה: לאחר ההבחנה מקרופאגים בשקיות מצופות טפלון FEP, לא יכול להיות תאים שיורית למשל, לימפוציטים, בהתאם לתורם ועל איכות בידוד מונוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעשות שימוש חוזר בשקיות מצופות טפלון FEP, לשטוף אותם פעמיים עם 70% אתנול להסרת תאי שיורי. למלא אותם עם 50 מ&quot;ל 70% אתנול ו דגירה הלילה. שטוף את השקיות 3x עם PBS סטרילי, לעטוף אותם בנייר עיקור, ולעקר ב החיטוי באמצעות נהלים סטנדרטיים. הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר שקיות תרבית תאים מספר פעמים ללא כל הפסד בתשואות מקרופאג. עם זאת, החלטנו לבטל את שקים אחרי 10 משתמש לפני שהם מתחילים לדלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקרופאגים תרבות הניסויים הבאים בFCS + 10% RPMI-1640. אם ריכוזים נמוכים יותר בסרום נדרשים, טיפוח בRPMI-1640 עם 1% FCS הוא גם אפשרי. זרע ותאי דגירה ל3-4 שעות. לאחר תקופה זו, לציין כי מקרופאגים לצרף אל פני השטח של אותו זמן צלחת תרבית תאיםכל תאים מזהמים (כלומר אריתרוציטים, לימפוציטים, ותאים דנדריטיים) להישאר בהשעיה. שטוף תאים לפחות פעמיים עם PBS להסיר תאים שאינם חסיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק מקרופאגים תרבותיים מצלחת תרבית תאים לניסויים נוספים, לגרד בזהירות אותם מעל פני השטח. לחלופין, דגירה מנות ל20 דקות על קרח, לשאוב את מדיום התרבות, ולהוסיף למאגר תא דיסוציאציה ללא אנזים 1 מ&quot;ל. אחרי 5 דקות דגירה על 37 מעלות צלזיוס, להוסיף 4 מ&quot;ל PBS, ולנתק תאים על ידי pipetting למעלה ולמטה לפחות 3 דקות. </li></ol>

<ol>
	<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496, 445-455 (2013).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Adaptive+Immunity+by+the+Innate+Immune+System.">Regulation of Adaptive Immunity by the Innate Immune System.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J Clin Invest. 122, 787-795 (2012).</li><li>Lionakis, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX(3)CR1-dependent+renal+macrophage+survival+promotes+Candida+control+and+host+survival.">CX(3)CR1-dependent renal macrophage survival promotes Candida control and host survival.</a> J Clin Invest. 123 (3), 5035-5051 (2013).</li><li>Blumenthal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wingless+homolog,+WNT5A+and+its+receptor+Frizzled-5+regulate+inflammatory+responses+of+human+mononuclear+cells+induced+by+microbial+stimulation.">The Wingless homolog, WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation.</a> Blood. 108, 965-973 (2006).</li><li>Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasome-derived+IL-1+beta+production+induces+nitric+oxide-mediated+resistance+to+Leishmania.">Inflammasome-derived IL-1 beta production induces nitric oxide-mediated resistance to Leishmania.</a> Nat Med. 19, 909-915 (2013).</li><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis.">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 4, 71-78 (2004).</li><li>Subramanian, V., Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+inflammation,+and+macrophages.">Obesity, inflammation, and macrophages.</a> Nestle Nutrition workshop series. Paediatric programme. 63, 151-159 (2009).</li><li>Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+atherosclerosis:+a+dynamic+balance.">Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance.</a> Nat Rev Immunol. 13, 709-721 (2013).</li><li>Pradere, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+macrophages+but+not+dendritic+cells+contribute+to+liver+fibrosis+by+promoting+the+survival+of+activated+hepatic+stellate+cells+in+mice.">Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice.</a> Hepatology. 58, 1461-1473 (2013).</li><li>Danciger, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+large+scale+isolation,+culture+and+cryopreservation+of+human+monocytes+suitable+for+chemotaxis,+cellular+adhesion+assays,+macrophage+and+dendritic+cell+differentiation.">Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation.</a> J Immunol Methods. 288, 123-134 (2004).</li><li>Reiling, N., Blumenthal, A., Flad, H. D., Ernst, M., Ehlers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria-induced+TNF-alpha+and+IL-10+formation+by+human+macrophages+is+differentially+regulated+at+the+level+of+mitogen-activated+protein+kinase+activity.">Mycobacteria-induced TNF-alpha and IL-10 formation by human macrophages is differentially regulated at the level of mitogen-activated protein kinase activity.</a> J Immunol. 167, 3339-3345 (2001).</li><li>Andreesen, R., Picht, J., Lohr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cultures+of+Human+Blood-Borne+Macrophages+Grown+on+Hydrophobic+Teflon+Membranes.">Primary Cultures of Human Blood-Borne Macrophages Grown on Hydrophobic Teflon Membranes.</a> J Immunol Methods. 56, 295-304 (1983).</li><li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+bone+marrow+in+the+teflon+culture+bag:+identification+of+the+human+monoblast.">Culture of human bone marrow in the teflon culture bag: identification of the human monoblast.</a> Journal of the Reticuloendothelial Society. 32, 355-369 (1982).</li><li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+human+monocytes+cultured+in+the+Teflon+culture+bag.">Characteristics of human monocytes cultured in the Teflon culture bag.</a> Immunology. 47, 617-625 (1982).</li><li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization:+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression.">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+and+macrophage+heterogeneity.">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat Rev Immunol. 5, 953-964 (2005).</li><li>Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+macrophage+colony-stimulating+factor-induced+growth+and+differentiation+of+human+monocytes+by+interleukin-10.">Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10.</a> Blood. 89, 315-321 (1997).</li><li>Tushinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+Mononuclear+Phagocytes+Depends+on+a+Lineage-Specific+Growth-Factor+That+the+Differentiated+Cells+Selectively+Destroy.">Survival of Mononuclear Phagocytes Depends on a Lineage-Specific Growth-Factor That the Differentiated Cells Selectively Destroy.</a> Cell. 28, 71-81 (1982).</li><li>Rietkotter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronic+acid+inhibits+macrophage/microglia-assisted+breast+cancer+cell+invasion.">Zoledronic acid inhibits macrophage/microglia-assisted breast cancer cell invasion.</a> Oncotarget. 4, 1449-1460 (2013).</li><li>Pilling, D., Fan, T., Huang, D., Kaul, B., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Markers+that+Distinguish+Monocyte-Derived+Fibrocytes+from+Monocytes,+Macrophages,+and+Fibroblasts.">Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts.</a> Plos One. 4, E7475 (2009).</li><li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions.">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> Plos One. 7, e42656 (2012).</li><li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques.">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am J Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li><li>Chernykh, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+and+properties+of+human+M2-like+macrophages:+potential+candidates+for+CNS+repair?.">The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair?.</a> Cell Ther Transplant. 2, (2010).</li><li>Verreck, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IL-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+IL-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+(myco)bacteria.">Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li><li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+5a+signaling+is+critical+for+macrophage-induced+invasion+of+breast+cancer+cell+lines.">Wnt 5a signaling is critical for macrophage-induced invasion of breast cancer cell lines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 5454-5459 (2006).</li><li>Hagemann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+induce+invasiveness+of+epithelial+cancer+cells+via+NF-kappa+B+and+JNK.">Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-kappa B and JNK.</a> J Immunol. 175, 1197-1205 (2005).</li><li>Pereira, C., Schaer, D. J., Bachli, E. B., Kurrer, M. O., Schoedon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt5A/CaMKII+signaling+contributes+to+the+inflammatory+response+of+macrophages+and+is+a+target+for+the+antiinflammatory+action+of+activated+protein+C+and+interleukin-10.">Wnt5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10.</a> Arterioscl Throm Vas. 28, 504-510 (2008).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף כמו שאף ניגוד העניינים קיים.

המקרופאגים הם תאי מפעיל חשובים של מערכת החיסון המולדת ולהציג תפקידים חשובים במשפר תפקוד מערכת חיסון, הצגת אנטיגן והומאוסטזיס רקמה. בשל הפלסטיות המדהימה שלהם, הם מסוגלים להגיב לגירויים שונים עם שינויים של הפנוטיפ שלהם. עם זאת, עד כה הרבה נתונים לגבי קיטוב מקרופאג מתקבלים במערכת העכברית, אם כי יש דיווחים שהראו כי רק כ 50% מסמני קיטוב מקרופאג יכולים להיות מתורגמים ישירות מעכבר ל16 אנושיים. לכן, אנו מציגים כאן שיטה כדי להשיג מקרופאגים אנושיים ראשוניים במספר ובטהרה מספקים ללא הצורך בחומרים יקרים, למשל, חרוזים מגנטיים MACS או מכשיר elutriation צנטריפוגלי נגדי. השיטה שלנו מבוססת על הבידוד של מונוציטים מPBMCs והבידול הבא שלהם למקרופאגים בFEP הטפלון מצופים שקיות תרבית תאים בנוכחות conce הנמוךntrations של M-CSF 11-13. בעוד מונוציטים מהווים פחות מ -5 10% מכדוריות דם לבנות בדם היקפי בבני אדם, על גירוי שהם מגויסים לאתרים היקפיים שבו הם לבדל למקרופאגים רקמת תושב או תאים דנדריטים 17. ציטוקינים M-CSF הוא חשובים להישרדות מונוציטים ומניעים את הבידול שלהם למקרופאגים 18,19. עד כה, ריכוזי M-CSF שנבחרו לבידול מונוציטים נעו עד 100 ng / ml, לעומת זאת, בפרוטוקול שלנו אנו מסוגלים להשיג כמות מספקת של מקרופאגים הבוגרים עם ריכוז M-CSF של רק 2.5 ng / ml 12 , 20. בנוסף, תאים בתרבית בשקיות תרבית תאים מצופים טפלון FEP המאפשרות הניתוק של מקרופאגים והזריעה הבאה שלהם במספרים סלולריים שהוגדרו. מאז ניתן לעשות שימוש חוזר בשקיות כמה פעמים, זה מקטין עוד יותר את העלויות לתהליך הבידוד. מקרופאגים מתקבלים על ידי הליך זהחיוביים מאוד עבור CD45, CD14, CD11b, CD11c ולהראות ביטוי של CD206 קולט מנוז אשר טוען לאוכלוסייה של מקרופאגים הטהורים, בוגרים 21,22. במיוחד ביטוי CD14 גבוה אופייני למקרופאגים מובחנים בנוכחות M-CSF 23. לאחר הזריעה של התאים, הם מציגים את דבקות מהירה למשטחי פלסטיק עם כמה תאים מראים מורפולוגיה כמו ציר טיפוסי, בעוד שאחרים מפגינים פנוטיפ ביצה מטוגן. זה בהתאם לתצפיות ממחברים אחרים 18,22,24. נמסר כי בידול מונוציטים בנוכחות M-CSF גורם למקרופאגים מקוטבים-M2 16,25. עם זאת, מקרופאגים המבודדים על ידי הפרוטוקול שלנו עדיין מסוגלים להגיב למגוון רחב של גירויים הכוללים חשיפה לmicrovesicles שמקורן בתאי גידול והתרבות משותפת עם תאי גידול 26,27 או חשיפה לLPS שאליו הם מגיבים עם גיוס של הפרו גנים דלקתיים כגון IL-1 &amp;# 946 ;, TNFα, Wnt5a, או metalloproteinases מטריצה ​​השונים שנחשבים אופייניות למקרופאגים מקוטבים-M1 3,5,28. לסיכום, את בידודה של מונוציטים על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות הכפולה והבחנה שלאחר מכן לכיוון מקרופאגים בתוצאות שקיות תרבית תאים מצופים טפלון FEP במספרים גבוהים של מקרופאגים ללא הצורך בהליכים קשים או יקרים מבחינה טכנית. מקרופאגים שהושגו יכולים להיות מנוצלים לניתוח שלאחר מכן החל הפעלה קלאסית דרך LPS לתרבות המשותפת עם תאים סרטניים.

תאים משושלת monocytic והנגזרים סופני מבודלים שלהם - מקרופאגים - תערוכת פלסטיות מדהימה בכל קשור לתפקוד הביולוגי שלהם, שמובילה למעורבותם בתהליכים מגוונים כגון פיתוח, תיקון רקמות, וחסינות 1. האחרון הוא עקב phagocytic ויכולת הצגת אנטיגן אשר מציבה מקרופאגים בצומת שבין תגובת החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות 2. עם זאת, היכולת שלהם להפריש ציטוקינים, כמוקינים, גורמי גדילה, ומולקולות איתות אחרות 1 לא רק מגביר את תפקוד מערכת החיסון-modulatory, אלא גם משמש כבסיס לפונקציות נוספות שלהם. מנסה לשקף את הפעולות הבאות מגוונות הפעלה בהקשר של תנאים בתיווך שאינם חיידקים גרמו בקטגוריות M1 ו M2 3. בעוד סיווג זה אינו שלם, היא מאפשרת להבנה בסיסית של הביולוגיה מקרופאג. בשל היכולות רבת הפנים האלה זה לא מפתיע שמקרופאגים קשורים למצבים רבים שבדרך כלשהי כרוכה שיפוץ רקמות או דלקת. הבא לתפקיד הבסיסי שלהם בהכרה ובאישור של פתוגנים הפולשים 4-6, מקרופאגים הגיעו יותר ויותר למוקד בטרשת עורק, סיסטיק, השמנת יתר, וסרטן 7-10. שיטה לשחזור לדור של מקרופאגים האנושיים לכן חיונית להבנה של פתולוגיות אלה. כאן אנו מציגים שיטה המבוססת על הבידוד של מונוציטים אנושיים מהדם ההיקפי של תורמים בריאים על ידי טכניקה כפולה צנטריפוגה שיפוע צפיפות כפי שתואר לעיל 11. על מנת להקל על בידול כלפי מקרופאגים, תאי monocytic המבודדים מודגרת בנוכחות ריכוזים נמוכים של M-CSF וסרום אנושי נורמלי 12. כדי להקל עוד יותר טיפול וקציר תא, התמיינות מתבצעת בFEP החדיר הגזשקיות תרבית תאים מצופים טפלון עם משטח הידרופובי 12-15. יכולים להיות נתונה מקרופאגים נחים וכתוצאה מכך למגוון רחב של מבחני כפי שהם עדיין מסוגלים להגיב בכל אופנת M1 או כמו-M2. יש להם שיטות אלטרנטיביות של בידוד מונוציטים ובידול שלאחר מכן, כגון תא מופעל מגנטי מיון (MACS) או נגדי elutriation צנטריפוגלי (CCE) מגבלות מסוימות לגבי התשואה, העלות, והזמן הנדרש. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מציע את היתרון שניתן לבצע אותו עם ציוד מעבדה סטנדרטי ללא הצורך בחומרים כימי מיוחדים (למשל, מקים חרוזים מגנטיים) או התקנים (לדוגמא, מנגנון CCE) ומאפשר לעיבוד של כמויות גדולות של תאים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibodies for immunophenotyping</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BioLegends</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200M microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein-AM</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>89201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>combi-stopper closing cones</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4495101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Pan biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td>for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0,5 M EDTA per 500ml PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084211000</td>
			<td>prepare a 0,5 M solution in H2O, use a sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13151-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10091148</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll (density 1.077g/ml)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse FITC</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from E.coli</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8274</td>
			<td>final conc: 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge 3 L-R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (density 1,131g/ml)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusor syringe 50ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728844F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>resuspend in methanol (c = 0,1 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Pasteur Pipettes</td>
			<td>LVL technologies</td>
			<td>2655181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rh M-CSF</td>
			<td>ImmunoTools</td>
			<td>11343117</td>
			<td>Resuspend in 500&#181;l sterile H2O (c = 100 ng/&#181;l), aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilization paper</td>
			<td>VP group</td>
			<td>3KFKFS230116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain (0,4% w/v)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, small</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>72-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, large</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>197-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags

מקרופאגים אדם מעורבים בשפע של תהליכים פתולוגיים הנעים בין מחלות זיהומיות לסרטן. כך הם מהווים כלי רב ערך כדי להבין את המנגנונים העומדים בבסיס של מחלות אלו. לפיכך, אנו מציגים פרוטוקול פשוט לבידודה של מונוציטים אנושיים ממעיילים באפי, ואחריו הליך בידול וכתוצאה מכך תשואות מקרופאג גבוהות. הטכניקה מסתמכת בעיקר על ציוד מעבדה זמין בדרך כלל ובכך מספקת דרך עלויות וזמן אפקטיבית להשגת כמויות גדולות של מקרופאגים אנושיים. בקצרה, מעילי אפים מתורמי דם בריאים נתונים לצנטריפוגה כפולה שיפוע צפיפות למסוק מונוציטים מהדם ההיקפי. מונוציטים אלה בתרבית, בשקיות fluorinated פרופילן אתילן (FEP) מצופי טפלון תרבית תאים בנוכחות גורם macrophage-stimulating מושבה (M-CSF). ניתן לקצור מקרופאגים המובחנים בקלות ולהשתמש בהם ללימודים ופונקציונליים כמו שלאחר מכןאומר. שיטות חשובות לבקרת איכות ואימות של צעדי הבידוד ובידול יהיו מודגשות בתוך הפרוטוקול. לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר למדענים באופן שיגרתי וreproducibly לבודד מקרופאגים אנושיים ללא הצורך בכלי עלות האינטנסיבית. יתר על כן, ניתן ללמוד מודלים של מחלות במערכת אנושית syngeneic עקיפת השימוש במקרופאגים עכבריים.

צנטריפוגה שיפוע הצפיפות הראשונה באמצעות Ficoll מניבה הביניים לבנים המכילים את PBMCs (איור 1 א) כלומר לימפוציטים ומונוציטים. זה יכול להיות אישר באמצעות הכתמת מאי גרינוולד (1B דמויות וC) של התאים שנאספו אשר מציג שני גרעין / יחס ציטופלסמה גבוה (האופייניים של לימפוציטים) וbean- או גרעינים בצורת טבעת (אופייני של מונוציטים). כאשר תאים אלה אז מועמסים על שיפוע צפיפות שני באמצעות Percoll, מונוציטים ניתן להפריד עוד יותר לימפוציטים ומופיעים שוב כביניים לבנים (איורים 1D-F). עבור כל מעיל באפי צנטריפוגה שיפוע הצפיפות כפולה תיארה מניבה באופן שגרתי x 150 ± 40 10 6 מונוציטים שיכולים להיות מובחן לx 70 ± 30 10 6 מקרופאגים (איור 2) למעייל באפי. תשואת מקרופאג הממוצעת מ20 הכנות עצמאיות היו 47 ± 14% ממונוציטים מבודדים סך הכל. לאחר צנטריפוגה שיפוע Percoll עדיין ייתכן שיש כמה תאים שאינם monocytic השיורי נוכחי בהכנה וזה תלוי בתורם הדם, כמו גם על הדיוק של תהליך הבידוד. עם זאת, לאחר שלב ההתמיינות של 6-7 ימים, ההכנה מורכבת בעיקר מקרופאגים בוגרים (איור 3) אשר יכול להעשיר את בשל דבקותם במשטחי פלסטיק, תכונה שאינו משותפת על ידי תאי זיהום האקראי (איורים 4 א וב &#39;). ברגע שמצופה, רוב מקרופאגים להראות מורפולוגיה קלאסית &quot;ביצת עין&quot; בזמן שיש גם תאים עם פנוטיפ כמו ציר נמתח (4C דמויות וD). זה משתקף על ידי הפצת F-תקטין בתוך אשכולות ציטופלסמה והדבקה. התאים המובחניםמאופיינים בביטוי של CD45, CD14, CD16, CD206 (קולט מנוז), CD11b וCD11c שהם סמנים אופייניים למקרופאגים הבוגרים (איור 5). הנוכחות של CD11b טוענת נגד בידול בעיקר דנדריטים אשר נתמך על ידי העובדה שהתאים הם שליליים עבור CD209 דנדריטים סמן תא (DC-SIGN). לאחר תהליך התמיינות התאים נשארים פונקציונלי ומטבולית פעילה כ 5-7 ימים (איור 6) כפי שניתן דמיינו אותו על ידי calcein מכתימה בבוקר ואת היכולת שלהם לקחת את שלפוחית ​​תאית לשפוך מתאי גידול. בנוסף, עדיין יכולים להיות מופעלים התאים כפי שמוצג למשל, לגירוי עם lipopolysaccharide (LPS) אשר גורם לביטוי של מספר גנים פרו דלקתיים (איור 7). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in"src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 51,554 / 51554fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; איור מראה 1 ורכב PBMC- ומונוציטים שכבה לאחר צנטריפוגה שיפוע צפיפות כפולה. לצלם ממחישים את PBMC-band () לאחר שיפוע Ficoll ו( D) מונוציטים-השלב לאחר צנטריפוגה Percoll iso-האוסמוטי. stainings מאי-גרינוולד הכנות cytospin של (B, C) ​​חלק PBMC ו( E, F) שנותרה מונוציטים. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר בB, E, = 50 מיקרומטר בC ו פ <img alt="איור 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig2highres.jpg" width="300" /> תשואת איור 2 של מונוציטים ומקרופאגים. Countings נציג התא של מונוציטים מבודדים ומקרופאגים של יחסי ציבור מעיל 20 אפיםeparations. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig3highres.jpg" width="600" /> Micrographs איור 3 ומדידות גודל תא של מונוציטים ומקרופאגים. מיקרוסקופ לעומת שלב של השעיה תא monocytic לפני () ואחרי בידול מקרופאג (B). מתאים היסטוגרמות גודל תא של מונוציטים (C) ומקרופאגים (ד &#39;). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" width="600" /> איור 4 מורפולוגיה וארגון cytoskeletal של מקרופאגים חסיד. מיקרוסקופ לעומת שלב של מקרופאגים חסיד לפני () וההסרה אחרי (B) של אי adheren<html> תאי T. הכתמה (C, D) Phalloidin-TRITC של אקטין פילמנטיות במקרופאגים חסיד, שאינו מגורה. סרגל קנה מידה בAC = 100 מיקרומטר, 20 מיקרומטר בד <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5 immunophenotype של מקרופאגים המובחנים. זרימת cytometry הניתוח של מקרופאגים לאחר 6 ימים של בידול בשקיות תרבית תאים מצופים טפלון FEP (מסומן באדום). בקרות אלוטיפ המקבילות מוצגות באפור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> -page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" width="600" /> איור 6 ספיג של microvesicles תאים סרטניים על ידי מקרופאגים. Micrographs של מקרופאגים חסיד אחרי האקספוזיציה לmicrovesicles שמקורן בתאים שכותרתו PKH26 גידול (אדום ניאון). תמונות תכסינה לbrightfield המקביל (א) או הכתמת cytosolic (ב &#39;) עם AM calcein צבע הכדאיות. ברים סולם = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig7highres.jpg" width="500" /> איור 7 upregulation של β IL-1, Wnt5a, TNFα, IL-6, MMP-2, MMP-7, וMT1-MMP לאחר stimuויסות של מקרופאגים עם LPS (100 ng / ml) ל24 שעות. התבטאות גנים נמדד על ידי RT-PCR מדגימות כוללת RNA () ומנורמלות על ביטוי HPRT1 וGNB2L1. הערכים המוצגים הם שינויים לקפל בהשוואה לקבוצת הביקורת (פירוש SD ±, n = 5, * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001). האינדוקציה TNFα וIL-6 תחת גירוי LPS אושרה עוד יותר על ידי ELISA (ב) (אמצעי ± SD, * p &lt;0.05).

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags at JoVE.com

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל לייצור מקרופאגים אנושיים. מעילים באפי מעובדים על ידי צנטריפוגה הכפולה שיפוע צפיפות ולאחר מכן מונוציטים מבודדים נבדלים למקרופאגים בשקיות תרבית תאים מצופים טפלון. זה ממקסם תשואות מקרופאג ומקל על קצירת תאים לניסויים הבאים.

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

isolation-human-monocytes-double-gradient-centrifugation-their

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

69.4K Views.  University Medical Center Göttingen.  אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל לייצור מקרופאגים אנושיים. מעילים באפי מעובדים על ידי צנטריפוגה הכפולה שיפוע צפיפות ולאחר מכן מונוציטים מבודדים נבדלים למקרופאגים בשקיות תרבית תאים מצופים טפלון. זה ממקסם תשואות מקרופאג ומקל על קצירת תאים ל?...

Video: Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Transfection יעיל ביותר של של אדם המקרופאגים THP-1 על ידי nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

הדמיה חיה של פעילות אנטי פטרייתי על ידי אדם מן המעלה הראשונה נויטרופילים ומונוציטים בתגובה<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where immune cells reside and therefore contribute to mucosal immunity in the intestine. A complete understanding of how M cells differentiate in the intestine as well as the molecular mechanisms of antigen uptake by M cells is lacking. This is because M cells are a rare population of cells in the intestine and because in vitro models for M cells are not robust. The discovery of a self-renewing stem cell culture system of the intestine, termed enteroids, has provided new possibilities for culturing M cells. Enteroids are advantageous over standard cultured cell lines because they can be differentiated into several major cell types found in the intestine, including goblet cells, Paneth cells, enteroendocrine cells and enterocytes. The cytokine RANKL is essential in M cell development, and addition of RANKL and TNF-&#945; to culture media promotes a subset of cells from ileal enteroids to differentiate into M cells. The following protocol describes a method for the differentiation of M cells in a transwell epithelial polarized monolayer system of the intestine using human ileal enteroids. This method can be applied to the study of M cell development and function.

This protocol describes how to induce the differentiation of M cells in human stem cell-derived ileal monolayers and methods to assess their development.

המושרה בידול של תאים כמו תא בתאי גזע האדם-הנגזר הנגזרת מונאואיד Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. While antiretroviral therapy efficiently lowers systemic viral load and restores normal CD4+ T cell counts, it does not reconstitute a completely functional immune system. A dysfunctional immune system in HIV-infected individuals undergoing cART may be characterized by immune activation, early aging of immune cells, or persistent inflammation. These conditions, along with comorbid factors associated with HIV infection, add complexity to the disease, which cannot be easily reproduced in cellular and animal models. To investigate the molecular events underlying immune dysfunction in these patients, a system to culture and manipulate human primary monocytes in vitro is presented here. Specifically, the protocol allows for the culture and transfection of primary CD14+ monocytes obtained from HIV-infected individuals undergoing cART as well as from HIV-negative controls. The method involves isolation, culture, and transfection of monocytes and monocyte-derived macrophages. While commercially available kits and reagents are employed, the protocol provides important tips and optimized conditions for successful adherence and transfection of monocytes with miRNA mimics and inhibitors as well as with siRNAs.

Presented here is an optimized protocol for isolating, culturing, transfecting, and differentiating human primary monocytes from HIV-infected individuals and healthy controls.

בידוד, העברה ותרבות של האדם הראשי המונולוציטים

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...