המטרה העיקרית של הליך זה היא ליישם פרוטוקול מקיף לתרבית ואפיון מיקרופאג'ים על משטחי השתל השונים ואפיון תת-הסוגים של המיקרופאג'ים. מספר שיטות משמשות כחלק מאפיון זה, כולל qRT-PCR, EISA ו-CLSM, כדי לקבוע את פרופילי ביטוי הגנים, חלבוני ההפרשה וסמני פני התא. התוצאות מראות את התועלת והיעילות של הפרוטוקול המיושם בקיטוב מיקרופאג'ים ומשטחי שתל, וזיהוי מדויק שלהם על סמך ביטוי גנים, חלבונים מופרשים וסמני פני התא.
יתר על כן, הסמנים מתארים דפוסי ביטוי עקביים וספציפיים של מרד שניתן להשתמש בהם כדי להבחין בין תת-סוגים שונים של MDM. בסך הכל, המחקר יתרום לפיתוח ועיצוב של חומרים אימונומודולטוריים לשיפור וקידום תהליכי התחדשות רקמות מוצלחים, מניעת דלקת כרונית הקשורה לשתלים ושיפור האינטגרציה המוצלחת של השתל. כדי להתחיל, השעו מחדש את התאים החד-גרעיניים של הדם ההיקפי האנושי ב-15 מיליליטר של מדיום חיבור מונוציטים שחומם מראש, והעבירו אותם לבקבוק תרבית תאים T-75.
דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 90 דקות להידבקות. לאחר הדגירה, יש להשליך את הסופרנטנט ולשטוף את התאים פעם אחת עם RPMI 1640 Medium שחומם מראש, בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין וסטרפטומיצין על ידי הטיה עדינה של הבקבוק כדי להסיר תאים שאינם נדבקים או דבוקים באופן רופף. הוסף 15 מיליליטר של מדיום שלם המכיל 10 ננוגרם לגורם מגרה מושבת מקרופאגים למיליליטר לתאים הדבקים.
ודגירה במשך שישה ימים כדי לקדם בידול. לאחר ההתמיינות יש להוציא את מדיום התרבות מהבקבוק ולשטוף את התאים עם 10 מיליליטר PBS למשך חמש דקות. כדי לנתק את תאי ההדבקה, הוסף 10 מיליליטר של תמיסת ניתוק תאים מחוממת מראש ודגירה למשך 30 דקות.
לאחר מכן, הקש בעדינות על הבקבוק כדי לשחרר את התאים ולהעביר אותם לצינור של 50 מיליליטר. כדי לנתק את התאים הנותרים, הוסף 10 מיליליטר PBS לבקבוק וגרד את התאים. העבירו את התאים המנותקים לצינור של 50 מיליליטר.
צנטריפוגה את תרחיף התאים המנותק ב-300 גרם למשך 10 דקות, והשליכו את הסופרנטנט לפני השעיית התאים בחמישה מיליליטר של מדיום שלם שחומם מראש. בעזרת צביעה כחולה טריפאן, ספרו את התאים על המוציטומטר כדי לקבוע את מספר התאים ואת כדאיותם. הכן את תרחיף התאים על ידי התאמת מספר התא ל-160,000 תאים למיליליטר אחד של מדיום שלם.
לאחר מכן, נקו את דיסקי הביו-חומר באופן קולי ב-70% אתנול למשך חמש דקות, ולאחר מכן עיקור ב-70% אתנול למשך 30 דקות. לאחר ייבוש דיסקי הטיטניום, הניחו אותם בצלחת לא מטופלת של 24 בארות והוסיפו מיליליטר אחד של תרחיף תאים מוכן לכל באר. דגרו על התאים למשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני כדי לקבל מקרופאגים M0.
כדי להשיג מקרופאגים מקוטבים M1, הוסף אינטרפרון גמא וליפופוליסכריד לבארות של צלחת בת 24 בארות. לקיטוב M2, הוסף אינטרלוקין-4 ואינטרלוקין-13. דגרו על התאים למשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני כדי לגרום לקיטוב.
לאחר השגת מקרופאגים מקוטבים שמקורם במונוציטים מתאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי, אסוף את התא בצינור של 1.5 מיליליטר. העבר את דיסק הטיטניום לצלחת חדשה של 24 בארות. צנטריפוגה של הסופרנטנט התא ב-300 גרם למשך חמש דקות והעבירו את הסופרנטנט לצינור חדש.
מדוד את הציטוקינים והכימוקינים ב-450 ננומטר על פי ההוראות הספציפיות שסופקו על ידי היצרן. חשב את ריכוז הציטוקינים או הכימוקינים המופרשים באמצעות העקומה הסטנדרטית. מדוד את כמות החלבון הכוללת באמצעות ערכת בדיקת חלבון חומצה ביצינצ'ונינית.
לנרמל את ריכוז החלבונים המופרשים למיליגרם של חלבון כולל. שטפו את המקרופאגים המקוטבים פעמיים ב -800 מיקרוליטר PBS. דגרו את הדיסקים ב -400 מיקרוליטר של מאגר קיבוע למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר הסרת מאגר הקיבוע, יש לשטוף את הדיסקים שלוש פעמים ב -400 מיקרוליטר PBS. כעת, דגרו את הדיסקים עם 400 מיקרוליטר של מאגר חסימה למשך 30 דקות כדי לחסום את אתרי הקישור הלא ספציפיים. השליכו את המאגר החוסם ודגרו על הדיסקים למשך שעה עם נוגדנים ראשוניים מדוללים ב-400 מיקרוליטר של מאגר מכתים.
לאחר שעה, הסר את הנוגדנים העיקריים ושטוף את הדיסקים שלוש פעמים עם 400 מיקרוליטר של מאגר כביסה. הוסף פלואור לנוגדנים משניים מסומנים מדוללים במאגר מכתים ודגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר הדגירה, שטפו את הדגימות שלוש פעמים במאגר הכביסה למשך שלוש דקות כל אחת.
הוסיפו 10 מילי-מולרי DRAQ5 ב-PBS ודגרו במשך 15 דקות בחושך. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט ושטוף את הדיסקים פעם אחת עם PBS. הוסף טיפה אחת של מדיום הרכבה, ולאחר חמש דקות, החל את משקפי הכיסוי ותן לדגימות להתייבש במשך שעה.
לאחר הייבוש יש לאטום את הקצוות עם לק שקוף. כדי לקבל סקירה כללית של תאים, צלם את הדגימות במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי בהגדלה של פי 25. שנה את ההגדלה ל-63X כדי לקבוע את המבנה והלוקליזציה של סמני פני השטח.
מקרופאגים ראשוניים שמקורם במונוציטים קוטב בהצלחה למקרופאגים M1 ו-M2 על משטחי טיטניום, כאשר CCR7 מתבטא בצורה חזקה יותר במקרופאגים M1 ו-CD209 במקרופאגים M2. ניתוח qRT-PCR הראה קיטוב מוצלח של מקרופאגים ראשוניים שמקורם במונוציטים הן על טיטניום והן על משטחי החלקה עם ביטוי גבוה של CCR7 ו-TNF-alpha עבור M1 ו-CD209 ו-CCL13 עבור M2. רמות גבוהות של ציטוקין TNF-אלפא דלקתי וכימוקין CCL13 אישרו קיטוב M1 ו-M2 ברמת החלבון.
