אנו מודים לד&quot;ר ג&#39;פרי קפלן לאימונים שלו וייעוץ על ההדמיה confocal. אנו מודים גם למעבדת קק מיקרוסקופית אלקטרונים וד&quot;ר Chaoying Ni לקבלת סיוע SEM. עבודה זו ממומנת על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIDCD, R01DC008965 וR01DC011377). ABZ מודה אינטגרטיבית השכלה בוגרת ותכנית (IGERT) למימון המחקר Traineeship NSF.

1. Bioreactor עצרת (וידאו 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תבנית אלומיניום (למות עגול + סיכת spacer) עם ממדים פנימיים וחיצוניים שנקבעו מראש (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בעובש משלב 1.1, לפברק קרום סיליקון (קוטר: 42 מ&quot;מ, עובי: 1.5 מ&quot;מ, איור 1) עם שרוול מושרש (קוטר: 12 מ&quot;מ, עובי ~ 0.25 מ&quot;מ, מעוצב על ידי סיכת spacer באיור 1) ב האמצע באמצעות ערכת אלסטומר סיליקון זמינה מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך זוג לוקי אקרילי (איור 2 (4, 5)) עם פתח עגול (קוטר: 24 מ&quot;מ) באמצע, לחרוט את החלק העליון (1.8 ס&quot;מ עובי) ותחתון (0.9 ס&quot;מ עובי) בלוקים עם רכסים וחריצים התאמה . 10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כריך קרום סיליקון בין גושי אקריליק לזווג. אבטח את ההרכבה עם ארבעה ברגי פינה באמצעות מברג מומנט מיקרו להגדיר לכוח קבוע (35 CN · מ &#39;). כתוצאה מכך,, מ &#39;24 מים חזקקאמרי רטט עמוק מ &#39;רוחב ו18 מ&quot;מ נוצר (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר 3 מיני וופר טווח ארוך &quot;(איור 2 ד, 8 Ω/20 W) מתחת לתא הרטט דרך קבוצה נוספת של ברגי פינה בשכונה אקריליק התחתונה. בשלב זה, מודול רטט אישי מורכב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל שבעה מודולים רעידות נוספים. להדביק ארבעה מהם לאחת משני ברים נייחים אלומיניום (40 סנטימטר x 10 סנטימטר x 2.5 סנטימטר) על ידי הצבת בסיסי הרמקול בחורים במרווחים שווה עגולים (קוטר: 7 סנטימטר, עובי: 2 סנטימטר) חתוך לסורגים. לייצב את כל רמקול על ידי החדרת ברגים דרך הצד של בר האלומיניום לתוך כל חור עגול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנפרד לשלוט ברמקולים על ידי בורר רמקולים. חבר רמקולי פרט לבורר על ידי הצמדת חוטים לכניסות החיוביות ושליליות על גוף הרמקול אז ליציאות המתאימות בבורר. בורר הרמקול מאפשר את האות מ tהוא מחולל אותות, לאחר שעברו דרך מגבר כוח, כדי להגיע לכל שמונת רמקולים בבת אחת (2E איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את שני המערכים קאמריים, בורר הדובר והאלקטרוניקה קשורה במארז אנטי לחות. בית כולו ההרכבה בתרבית תאי חממה מסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את הכבלים הראשיים (דרך צינורות PVC כיתה רפואית) המחבר את מגבר הכוח ובורר רמקול באמצעות ההרכבה המסנן בחלק האחורי של החממה. </li></ol> 2. ייצור פיגום ואפיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר כדורי PCL בכלורופורם בריכוז של 15% WT. טען את הפתרון לתוך מזרק 10 מיליליטר כתרים עם מחט קהה הסתיים 21 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נעל את המזרק על משאבת מזרק לתכנות ולקבוע את קצב הזרימה ב1 מיליליטר / שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את האספן מכוסה רדיד האלומיניום מול המחט אופקית, עם מרחק קצה מחט לאספן של ~ 18 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את alli החיוביקליפ תנין לאמצע של המחט, וקליפ תנין הקרקע לאספן האלומיניום, ולאחר מכן קבע את המתח באספקה ​​החשמל במתח הגבוה ב15 KV. זהירות: מתח גבוה, מרחק לשמור מהמחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף להפעיל את משאבת המזרק ואספקת חשמל; מהירות נקי / להסיר את פתרון הפולימר השיורי המקיף את קצה המחט באמצעות מגבת נייר יבשה לפני שמטוסי סיבים יציבים וקונוס טיילור 19 נוצרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר הסיבים מצטברים על אספן אל לעובי של ~ 250-300 מיקרומטר (~ 7 שעות בתנאי ספינינג הנוכחיים). אחסן את הפיגומים שנוצר בייבוש ואקום ל1-2 ימים כדי להסיר כל ממס שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת הפיגומים, גמגום מצופים בזהב, תוך שימוש במיקרוסקופ אלקטרוני סורק כדי להראות מורפולוגיה סיבים עקבית. 10 </li></ol> 3. עצרת Bioreactor ואפיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אגרוף דיסק גלילי (קוטר: 8 מ&quot;מ) עם ארבע זרועות (אורך: 2מ&quot;מ) מחוץ למזרן PCL כ- סובב (איור 2 א) על ידי השימוש ראשון ביופסיה בקוטר מ&quot;מ 12 לחתוך את הקוטר החיצוני של הדיסק. לאחר מכן להשתמש בביופסיה שנייה, 8 מ&quot;מ לעשות חריצים ארוכים ארבעה 2 מ&quot;מ מחולקים באופן שווה סביב הלהב המעגלי להבקיע בי הזרועות הן להיחתך. לאחר הבקיע עם אגרוף 8 מ&quot;מ, השתמש בלהב סכין מנתחים כדי לחתוך את הקצוות של הזרועות כלפי חוץ. הכנס את הפיגום לתוך החריץ של קרום סיליקון באמצעות זרועות המורחבות (וידאו 1). שטח את הפיגום מוחדר בעדינות על ידי הלחיצה על המשטח באמצעות פינצטה השטוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף חתיכה קטנה של רדיד אל הדק (8 מ&quot;מ x 2 מ&quot;מ, צורה מאונך, איור 2) לפיגום PCL כדי לסייע השתקפות לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את הקרום / הפיגום התאסף סיליקון PCL (כמפורט בשלב 1.4) בחדר הרטט. הוסף 1.5 מיליליטר מים בחדר כדי ללחלח את פיגום PCL לפני הרטט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחולל הפונקציה, להציג את רטט סימןals (למשל, גלי סינוסי 200 הרץ עם מתח שיא לשיא, VPP, של 0.1 V) לתא אקריליק דחוק. השתמש במד מתח כדי למדוד את המתח בצורה מדויקת בכל קלט רמקול. הערה: את הודעת Vpp ממחולל הפונקציה יהיה שונה ממתח סופו של הדבר נמסר לרמקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את LDV הנקודה אחת ולאבטח את ראש חיישן לייזר הסיב אופטי לחצובת ראש Pan-Tilt. זווית ראש החיישן, כך שהוא מצביע בניצב לשולחן. חבר את ראש חיישן LDV למודול רכישת נתונים דרך כבל קואקסיאלי אז מודול למחשב הנייד באמצעות כבל USB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקד את קרן הלייזר בניצב בנקודות שנקבעו מראש שונות על קרום סיליקון (איור 2 ואיור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת רכישת נתונים, להקליט עקירת אמצע קרום. לחץ על &quot;הגדרות רכישה&quot; מתפריט &quot;אפשרויות&quot;; לאחר מכן לשנות את מצב המדידה ל&quot; FFT221;. בשלב הבא, לחץ על &quot;המדידה רציפה&quot; בסרגל הכלים הראשיים ולאחר מכן לחץ על השיא שנוצר בתדירות שנבחרה (איור 6 ד) כדי להקליט את העקירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה העקירה הרגילה אמצע קרום (w 0) כפונקציה של המיקום היחסי על פני המצע. לבנות מפת צבעי 3D של פרופיל התנודה פני השטח באמצעות תוכנת ניתוח 8.5 נתוני מקור. </li></ol> 4. תרבית תאי רטט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MSCs עצם אנושי תת התרבות שמקורם במח בצלוחיות תרבית רקמת T150 בצפיפות זריעה ראשונית של 4,000-5,000 תאים / 2 סנטימטר בתקשורת תחזוקת MSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 7-8 ימים של תרבית תאים (ל~ confluency 85%), trypsinize התאים עם מגיב תא דיסוציאציה כגון Accutase, לספור באמצעות hemocytometer, צנטריפוגה (440 XG במשך 5 דקות), ומחדש להשעות את התא גלולה ב תקשורת טרי MSC תחזוקה בריכוז של 4.5 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את scaffo PCLld ב70% O / נ אתנול לאחר הממס מתאדה, חושף את שני הצדדים של הפיגום לקוטל חידקים אור UV (254 ננומטר) ל5-8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את פיגום PCL בפתרון פיברונקטין 20 מיקרוגרם / מיליליטר ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הכנס את הפיגום מצופה פיברונקטין לתוך קרום סיליקון. להרכיב את bioreactor כמפורט בשלב 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ 40 μl של ההשעיה התא באופן שווה על פיגום PCL המאובטח. אפשר התאים לצרף ל1-1.5 שעה לפני הוספת 1.5 מיליליטר נוסף תקשורת טריות לתא הרטט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות פיגום MSC העמוס PCL באופן סטטי במשך 3 ימים ולרענן את התקשורת עם השלמת תרבות סטטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטיל משטרי רטט שנבחרו למבנים התאיים. הערה: כדוגמא, תאים חשופים ל- HR-off 1-HR-on-1 (של) רטט ב200 הרץ עם aw 0 של ~ 40 מיקרומטר ל12 שעות ליום לתקופה של עד 7 ימים. מבני נתונים לגירויי רטט מיועדים לשמש כדגימות VIB וcultu אלהאדום באופן סטטי בתאי רטט זהים ישמש פקדים סטטיים כ( Stat). </li></ol> 5. הערכות ביולוגיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 200 תקשורת תרבות תא μl מכל תא בכל יום אחר (יום 1, 3, 5, ו -7) וברכה aliquots מהמדגם זהה יחד (800 μl כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את הייצור התאי של מטריקס metalloproteinase-1 (MMP1) וHA באמצעות ערכת ELISA MMP1 פיתוח וערכת ELISA תחרותית hyaluronan, בהתאמה, בעקבות ההליך של היצרנים. בינתיים, assay הייצור של מבשר אלסטין מסיס בעקבות הליך ELISA שדווח בעבר. 8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם ההשלמה של מחזור הרטט שעבר ביום 7, להסיר במהירות את המבנים התאיים מתאי הרטט באמצעות פינצטה חדה ובקצרה לשטוף אותם עם שנאגרו מלוח פוספט הקר (PBS, 4 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצביעה החי / המתה, דגירה המבנים עם יודיד propidium (1:2,000 PBS) וSyto-13 (1:1,000 ב-PBS) בו זמנית למשך 5 דקות ב RT. תמונת המבנים המוכתמים במיקרוסקופ confocal multiphoton. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנפרד, Snap-להקפיא את המבנים תאיים ושטף PBS על קרח יבש ולחלץ את RNA הסלולרי בסך הכל בעקבות פרוטוקול שדווח בעבר לניתוח גנטי. 9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הכמות והאיכות של RNA חילוץ באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis. דגימות RNA עם יחס A260/A280 וA260/A230 של 1.8-2.2 משמשות לניתוח qPCR שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך לתמלל RNA (500 ng / מדגם) לתוך cDNA באמצעות ערכת שעתוק לאחור זמינה מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את תגובת PCR על מערכת זיהוי רצף זמן אמת באמצעות תערובת הורים PCR זמינה מסחרי בעקבות ההליך שפורט קודם לכן. 8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את תוצאות qPCR באמצעות תוכנת ניתוח נתונים qPCR מסחרית. כדי להבטיח את האמינות של ניתוח נתונים, גנים התייחסות מרובים (YWHAZ, TBP, PPIA) מועסקים כintפקדי ernal, והשונות של יעילות פריימר ספציפית נלקחים בחשבון. 8 </li></ol>

<ol>
	<li>Titze, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical-Stress+in+Phonation.">Mechanical-Stress in Phonation.</a> J. Voice. 8, 99-105 (1994).</li><li>Titze, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Relation+Between+Subglottal+Pressure+and+Fundamental-Frequency+in+Phonation.">On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation.</a> J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).</li><li>Gray, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+physiology+of+the+vocal+folds.">Cellular physiology of the vocal folds.</a> Otolaryngol. Clin. N. Am. 33, 679-698 (2000).</li><li>Thibeault, S. L., Gray, S. D., Bless, D. M., Chan, R. W., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+rheologic+characterization+of+vocal+fold+scarring.">Histologic and rheologic characterization of vocal fold scarring.</a> J. Voice. 16, 96-104 (2002).</li><li>Hansen, J. K., Thibeault, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+and+review+of+the+literature:+Vocal+fold+scarring.">Current understanding and review of the literature: Vocal fold scarring.</a> J. Voice. 20, 110-120 (2006).</li><li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells.">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li><li>Hanson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Mesenchymal+Stem+Cells+From+Human+Vocal+Fold+Fibroblasts.">Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Vocal Fold Fibroblasts.</a> Laryngoscope. 120, 546-551 (2010).</li><li>Tong, Z., Duncan, R. L., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+the+behaviors+of+mesenchymal+stem+cells+via+the+combination+of+high-frequency+vibratory+stimulations+and+fibrous+scaffolds.">Modulating the behaviors of mesenchymal stem cells via the combination of high-frequency vibratory stimulations and fibrous scaffolds.</a> Tissue Eng. Part A. 19, 1862-1878 (2013).</li><li>Tong, Z., Sant, S., Khademhosseini, A., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+Fibroblastic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Via+the+Combination+of+Fibrous+Scaffolds+and+Connective+Tissue+Growth+Factor.">Controlling the Fibroblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Via the Combination of Fibrous Scaffolds and Connective Tissue Growth Factor.</a> Tissue Eng. Part A. 17, 2773-2785 (2011).</li><li>Jones, D. L., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+place+like+home:+anatomy+and+function+of+the+stem+cell+niche.">No place like home: anatomy and function of the stem cell niche.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 11-21 (1038).</li><li>Wang, J. H., Thampatty, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+Adult+and+Stem+Cells.">Mechanobiology of Adult and Stem Cells.</a> Int. Rev. of Cell Mol. Biol. 271, 301-346 (2008).</li><li>Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+tensile+culture+promotes+fibroblastic+differentiation+of+marrow+stromal+cells+encapsulated+in+poly+(ethylene+glycol)-based+hydrogels.">Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly (ethylene glycol)-based hydrogels.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 3457-3466 (2010).</li><li>Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+mechanical+strain+regulates+the+development+of+engineered+smooth+muscle+tissue.">Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue.</a> Nat. Biotechnol. 17, 979-983 (1999).</li><li>Webb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+strain+increases+fibroblast+proliferation,+matrix+accumulation,+and+elastic+modulus+of+fibroblast-seeded+polyurethane+constructs.">Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs.</a> J. Biomech. 39, 1136-1144 (2006).</li><li>Kim, Y. J., Sah, R. L. Y., Grodzinsky, A. J., Plaas, A. H. K., Sandy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Regulation+of+Cartilage+Biosynthetic+Behavior+-+Physical+Stimuli..">Mechanical Regulation of Cartilage Biosynthetic Behavior - Physical Stimuli..</a> Arch. Biochem. Biophys. 311, 1-12 (1994).</li><li>Titze, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+bioreactor+for+engineering+vocal+fold+tissues+under+combined+tensile+and+vibrational+stresses.">Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses.</a> J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).</li><li>Kutty, J. K., Webb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibration+stimulates+vocal+mucosa-like+matrix+expression+by+hydrogel-encapsulated+fibroblasts.">Vibration stimulates vocal mucosa-like matrix expression by hydrogel-encapsulated fibroblasts.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 62-72 (2010).</li><li>Farran, A. J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Characterization+of+a+Dynamic+Vibrational+Culture+System.">Design and Characterization of a Dynamic Vibrational Culture System.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2011).</li><li>Reneker, D. H., Yarin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+jets+and+polymer+nanofibers.">Electrospinning jets and polymer nanofibers.</a> Polymer. 49, 2387-2425 (2008).</li><li>Wang, Y., Theobald, P., Tyrer, J., Lepper, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+scanning+vibrometer+in+mapping+ultrasound+fields.">The application of scanning vibrometer in mapping ultrasound fields.</a> J. Phys.: Conf. Ser. 1, 167-173 (2004).</li><li>Brown, W. S., Morris, R. J., Hollien, H., Howell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speaking+Fundamental-Frequency+Characteristics+as+a+Function+of+Age+and+Professional.">Speaking Fundamental-Frequency Characteristics as a Function of Age and Professional.</a> J. Voice. 5, 310-315 (1991).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanotransduction:+putting+all+the+pieces+together+again.">Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again.</a> Faseb J. 20, 811-827 (2006).</li><li>Titze, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+bioreactor+for+engineering+vocal+fold+tissues+under+combined+tensile+and+vibrational+stresses.">Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses.</a> J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).</li><li>Moore, J., Thibeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+Into+the+Role+of+Elastin+in+Vocal+Fold+Health+and+Disease.">Insights Into the Role of Elastin in Vocal Fold Health and Disease.</a> J. Voice. 26, 269-275 (2012).</li><li>Thibeault, S. L., Bless, D. M., Gray, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+protein+alterations+in+rabbit+vocal+fold+with+scar.">Interstitial protein alterations in rabbit vocal fold with scar.</a> J. Voice. 17, 377-383 (2003).</li><li>Branski, R. C., Verdolini, K., Sandulache, V., Rosen, C. A., Hebda, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vocal+fold+wound+healing:+A+review+for+clinicians.">Vocal fold wound healing: A review for clinicians.</a> J. Voice. 20, 432-442 (2006).</li><li>Clark, I. A., Swingler, T. E., Sampieri, C. L., Edwards, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors.">The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Int. J. Biochem. Cell B. 40, 1362-1378 (2008).</li><li>Silver, F. H., Horvath, I., Foran, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelasticity+of+the+vessel+wall:+The+role+of+collagen+and+elastic+fibers.">Viscoelasticity of the vessel wall: The role of collagen and elastic fibers.</a> Crit. Rev. Biomed. Eng. 29, 279-301 (2001).</li><li>Kutty, J. K., Webb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Engineering+Therapies+for+the+Vocal+Fold+Lamina+Propria.">Tissue Engineering Therapies for the Vocal Fold Lamina Propria.</a> Tissue Eng. Part B: Rev. 15, 249-262 (2009).</li></ol>

אין אינטרסים כלכליים מתחרים קיימים.

הנדסה מוצלחת של רקמות לקפל ווקאלית פונקציונליות במבחנה דורשת הבילוי של microenvironment כמו מתקפל קולני לתווך ההתנהגויות של תאי multipotent. הדעה מקובלת היא כי מבני רקמה או איבר משקפים את הפונקציות שהם נדרשים לבצע. 22 לרקמות לקפל ווקאלית, התנודות בתדירות גבוהות המתרחשו...

לקפל ווקאלית האנושית, מורכבת משכבת ​​האפיתל, propria lamina (LP) ושרירי vocalis, הוא ברקמות רכות מיוחדות שממירה את זרימת אוויר מהריאות לגלים אקוסטיים להפקת צליל. 1 קפלי קול להתנדנד באופן קבוע במהלך phonation הנורמלי, תערוכת זנים של עד 30% בתדרים בסיסיים החל 100-300 הרץ. LP לקפל ווקאלית 2 מבוגרים הוא צבע מבנה מורכב משטחי (SLP), ביניים (ILP) ושכבה עמוקה (DLP). קבוצות נוספות סיווג האפיתל וSLP כשכבת רירית, ומשלבים את ILP וDLP לתוך הרצועה ווקאלי. 3 שכבת SLP מכילה בעיקר מטריקס אמורפי עם סיבי collagenous מפוזרים בדלילות, ואילו הרצועה מועשרת בקולגן בוגר וסיבים האלסטין כדי לספק כוח מספיק. 4 המבנה והמכניקה של קפלי קול יילוד להשתנות באופן משמעותי מעמיתיהם בוגרים שלהם. למרות שמנגנוןשל ויסות התפתחות לקפל ווקאלית והתבגרות עדיין לא מובן לחלוטין, ראיות ניסיוניות הצביעו על תפקידי ההגדרה של לחץ מכאני המופק מניקוד. כמה מצבים רפואיים, ובכלל זה שימוש לרעה בקול, זיהומים, חומרים מגרים כימיים וניתוחים, עלולים לגרום נזק לקפל ווקאלית. הפרעות לקפל ווקאלית להשפיע 3-9% מאוכלוסיית ארה&quot;ב. שיטות טיפול הנוכחיות להפרעות לקפל ווקאלית מוגבלות 5 וגישה הנדסית גזע מבוסס תאי רקמה התפתחה כאסטרטגיה מבטיחה לשחזור תפקוד לקפל ווקאלית. תאי גזע mesenchymal (MSCs) הם אלטרנטיבה מתאימה לfibroblasts לקפל ווקאלית העיקרית להנדסת רקמות לקפל ווקאלית. 6-9 מפרט גורל תאי גזע ופיתוח רקמות הבא מתווכים על ידי הנישה הספציפית שהם מתגוררים, אשר מצבו המכני הוא גורם חיוני. 10 כוחות מכאניים הם רגולטורים חיוניים של המורפוגנזה רקמהnd הומאוסטזיס, במיוחד לרקמות שנחשפות באופן שיגרתי לטעינה. 11 מנקודת מבט של הנדסת רקמות, זה כבר הוכיח כי חשיפה לגירויים פיזיולוגית מכאניים רלוונטיים מקדם גזע התמיינות תאים ושיפוץ מטריצת רקמות ספציפיות. 12-15 bioreactors תרבית רקמה נועדו לדמות את הסביבה הפיזיולוגית הרצויה לצמיחת תאים או רקמות במבחנה. להנדסת רקמות לקפל ווקאלית, זה קריטי במיוחד כדי לשחזר את הסביבה מכאנית של קפלי קול phonating. Bioreactor לקפל ווקאלית אידיאלית צריך למעשה לספק רמזי רטט לתאי תרבות, המאפשר שליטה קלילה על תדר, המשרעת ומשך זמן של תנודות. Titze ועמיתים לעבודה המציאו bioreactor וקאלי לקפל (bioreactor T1) 16 שמשלב מתיחה סטטית עם תדירות גבוהה (20-200 הרץ) תנודות כדי לעורר את הייצור של חלבוני מטריצה. מנצלגרם bioreactor זה, ווב ועמיתים 17 חקרו את ההשפעות של 10 יום, תנודות 100 הרץ על fibroblasts עורי בתרבית בחומצה היאלורונית (HA) מבוסס הידרוג&#39;ל. מבני נתונים לרעידות הציגו ביטוי גבוה של HA synthase-2, decorin, fibromodulin ומטריקס metalloproteinase-1 (MMP1), ביחס לבקרות סטטי (HAS2). השפעות גירוי נמצאו להיות תלוי בזמן. לאחרונה, הקבוצה שלנו 18 התאסף bioreactor וקאלי לקפל (bioreactor J1) באמצעות מגבר כוח, מחוללים אותות, רמקול חזק ומוקף קרום סיליקון circumferentially מעוגני המעביר את אוויר נדנוד לתאים המצורפים. fibroblasts עורלת ילודים טיפח בbioreactor J1 היו נתונים לשעה 1 של רטט ב60, 110 או 300 הרץ, עם מתח במטוס של עד 0.05%. תוצאות qPCR הציעו כי הביטוי של גנים מסוימים ECM שונו באופן מתון בתגובה לתדרי רטט המגווניםואמפליטודות. עיצובי bioreactor אלה, בעוד מסקרן, יש כמה מגבלות. לדוגמא, מערכת T1 דורשת מספר רב של מחברים וברים לצימוד מכאני, להגביל את התדרים מקסימאלי שניתן להשיג. יתר על כן, תאים עשויים להיות חשופים להפרעות חרדה ונוזל מכאניות בלתי רצויות שתסבכנה את פרשנות הנתונים. Bioreactor J1, לעומת זאת, מציג את יעילות המרת אנרגיה נמוכה יחסית ואינו ידידותי למשתמש. בנוסף, רטט בתדירות גבוהה מנתק את מבני התא עמוס מקרום סיליקון בסיסי. Bioreactor J2 לקפל ווקאלית שדווח כאן, שתוכנן על בסיס אותו העיקרון כמו גרסת J1, מותאם במיוחד עבור עקביות ושחזור. התנודות מחקה-phonation נוצרות מבחינה אווירודינמית בתאי רטט מותאמים באופן אישי שבו פולי MSC-מאוכלסים סיביים (ε-caprolactone) פיגומים (PCL) הם effectivהשיג איליי. הלייזר דופלר vibrometry (LDV) מאפשר למשתמש לאמת את פרופיל הרטט של ההרכבה קרום / פיגום. בהפגנה שלנו, MSCs חשופים לתנודות סינוסי 200 הרץ עם דפוס 1-HR-on-1-HR-off (של) עבור סכום כולל של שעות 12 ביום למשך 7 ימים. תגובות תאיות לרמזי רטט הוטלו נחקרות באופן שיטתי. בסך הכל, לקפל ווקאלית J2 מספק את התכונות הכי ידידותי למשתמש, המאפשר לימודי תרבות תא דינמי להתנהל בתפוקה גבוהה ואופנה לשחזור.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="853">
	<tbody>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;width:248px;">silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:188px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:124px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:293px;">cure the membrane at 100 C for 2 hr</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">PCL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>440744-500G</td>
			<td>Mn ~ 80 kDa, dissolve overnight</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7559-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">human bone marrow-derived MSCs</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td>received with passage 2</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">MSC maintenance media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td style="width:293px;">10% FBS in basal media supplemented 
			with L-glutamine, gentamicin and amphotericin</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">Accutase cell dissociation reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2006-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">MMP1 DuoSet ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DY901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">HA ELISA kit</td>
			<td>Echelon Biosciences</td>
			<td>&#160;K-1200&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">propidium iodide&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">Syto-13&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">QuantiTect reverse transcription kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">SYBR Green PCR master mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4309155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">replacement speaker</td>
			<td style="width:188px;">DAYTON audio 
			(via Parts Express)</td>
			<td>DS90-8</td>
			<td>paper cone, full range (80-13000 Hz), 85dB</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">Ergo Micro torque screwdriver</td>
			<td>Mountz</td>
			<td># 020377</td>
			<td>torque range: 20-120 cN.m</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">stereo speaker selector</td>
			<td>RadioShack</td>
			<td>40-244</td>
			<td>maximum power handling 50 W</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">function generator&#160;</td>
			<td>Agilent&#160;</td>
			<td>33220A</td>
			<td>frequency range 1 &#181;Hz- 20 MHz</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">power amplifier&#160;</td>
			<td>PYLE audio</td>
			<td>PylePro PT2400</td>
			<td style="width:293px;">frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker 
			channels</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">cell culture incubator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>Steri-Cult 3307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">syringe pump&#160;</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE 1000R</td>
			<td>output voltage: 0-30 kV</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">scanning electron microscope&#160;</td>
			<td>JEOL-USA</td>
			<td>JSM-7400F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">desk gold sputter coater</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td>DSK00V-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">Doppler laser vibrometer&#160;</td>
			<td>Polytec</td>
			<td>PDV-100</td>
			<td>non-contact velocity measurement (0-22 kHz)</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">PCR sequence detection system&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>ABI7300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">multiphoton confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss 510Meta NLO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV-VIS Spectrophotometer&#160;</td>
			<td style="width:188px;">NanoDrop Products 
			via Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">VibSoft Data Acquisition Software</td>
			<td>Polytec</td>
			<td></td>
			<td>acquisition bandwidth up to 40 MHz</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">Origin 8.5 data analysis software&#160;</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">qbasePlus qPCR data analysis software&#160;</td>
			<td>Biogazelle</td>
			<td>V2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">aluminium alloy&#160;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>Alloy 6061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">acrylic blocks</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">polycarbonate anti-humidity chamber</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td></td>
			<td style="width:293px;">Impact-Resistant&#160;Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">screws&#160;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">electronic cable/wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">medical grade PVC tubing</td>
			<td>US Plastic Corp.</td>
			<td>Tygon S-50-HL</td>
			<td>clear, biocompatible</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">10 mL syringe&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">21 G blunt ended needle</td>
			<td>Small Parts</td>
			<td>NE-213PL-25</td>
			<td>1-1/2&#34; length</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">Alligator clip adapters&#160;</td>
			<td>RadioShack</td>
			<td>270-354</td>
			<td>fully insulated</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">8 mm biopsy punch</td>
			<td><a href="http://www.sklarcorp.com/ProductListUS.aspx?DepartmentID=10&amp;CategoryID=96">Sklar&#160;Surgical Instruments</a></td>
			<td>96-1152</td>
			<td>sterile, disposable</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">12 mm biopsy punch</td>
			<td>Acuderm (via Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:124px;">NC9998681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">tissue culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>cell culture treated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction and characterization of a novel vocal fold bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 &#181;m. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

פיגומי PCL המפוברק על ידי electrospinning מכילים נקבוביות מיקרון בגודל ביניים וסיבים הסתבכו באופן אקראי עם קוטר ממוצע של 4.7 (איור 4 א) מיקרומטר. בהגדלה גבוהה יותר, חריצים ונקבוביים ננו גלויים על סיבים בודדים (איור 4). ציפוי של הפיגומים עם פיברונקטין משפר hydrophilic...

Watch this Scientific Journal Video about Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor at JoVE.com

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(&#949;-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

בנייה ואפיון של Bioreactor פולד רומן וקאלי

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

construction-and-characterization-of-a-novel-vocal-fold-bioreactor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.1K Views.  University of Delaware. A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(ε-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

Video: Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

הנדסה ביולוגית המבוססת דם שתלי שימוש bioreactor pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing material properties 1. Normal voice production relies on healthy tissue and vocal folds, and occurs as a result of complex coupling between aerodynamic, structural dynamic, and acoustic physical phenomena. Voice disorders affect up to 7.5 million annually in the United States alone 2 and often result in significant financial, social, and other quality-of-life difficulties. Understanding the physics of voice production has the potential to significantly benefit voice care, including clinical prevention, diagnosis, and treatment of voice disorders.
Existing methods for studying voice production include in vivo experimentation using human and animal subjects, in vitro experimentation using excised larynges and synthetic models, and computational modeling. Owing to hazardous and difficult instrument access, in vivo experiments are severely limited in scope. Excised larynx experiments have the benefit of anatomical and some physiological realism, but parametric studies involving geometric and material property variables are limited. Further, they are typically only able to be vibrated for relatively short periods of time (typically on the order of minutes).
Overcoming some of the limitations of excised larynx experiments, synthetic vocal fold models are emerging as a complementary tool for studying voice production. Synthetic models can be fabricated with systematic changes to geometry and material properties, allowing for the study of healthy and unhealthy human phonatory aerodynamics, structural dynamics, and acoustics. For example, they have been used to study left-right vocal fold asymmetry 3,4, clinical instrument development 5, laryngeal aerodynamics 6-9, vocal fold contact pressure 10, and subglottal acoustics 11 (a more comprehensive list can be found in Kniesburges et al. 12)
Existing synthetic vocal fold models, however, have either been homogenous (one-layer models) or have been fabricated using two materials of differing stiffness (two-layer models). This approach does not allow for representation of the actual multi-layer structure of the human vocal folds 1 that plays a central role in governing vocal fold flow-induced vibratory response. Consequently, one- and two-layer synthetic vocal fold models have exhibited disadvantages 3,6,8 such as higher onset pressures than what are typical for human phonation (onset pressure is the minimum lung pressure required to initiate vibration), unnaturally large inferior-superior motion, and lack of a "mucosal wave" (a vertically-traveling wave that is characteristic of healthy human vocal fold vibration).
In this paper, fabrication of a model with multiple layers of differing material properties is described. The model layers simulate the multi-layer structure of the human vocal folds, including epithelium, superficial lamina propria (SLP), intermediate and deep lamina propria (i.e., ligament; a fiber is included for anterior-posterior stiffness), and muscle (i.e., body) layers 1. Results are included that show that the model exhibits improved vibratory characteristics over prior one- and two-layer synthetic models, including onset pressure closer to human onset pressure, reduced inferior-superior motion, and evidence of a mucosal wave.

The methodology for fabricating synthetic vocal fold models is described. The models are life-sized and mimic the multi-layer structure of the human vocal folds. Results show the models to self-oscillate at pressures comparable to lung pressure and demonstrate flow-induced vibratory responses that are similar to those of human vocal folds.

סינטטי, רב שכבתיים, עצמי מתנודדת ווקאלי דגם Fold ייצור

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

עיצוב של Bioreactor טוען מכונות Biaxial להנדסת רקמות

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to carefully control temperature, pH, and dissolved oxygen concentrations in particular makes them essential to efficient large scale growth and expression of fermentation products. This video will briefly describe the advantages of the fermentor over the shake flask. It will also identify key components of a typical benchtop fermentation system and give basic instruction on setup of the vessel and calibration of its probes. The viewer will be familiarized with the sterilization process and shown how to inoculate the growth medium in the vessel with culture. Basic concepts of operation, sampling, and harvesting will also be demonstrated. Simple data analysis and system cleanup will also be discussed.

Fermentors are used to increase culture yield and productivity of bioengineered cells. After screening multiple microbial or animal cell culture candidates in shake flasks, the next logical step is to increase the selected culture&#x2019;s biomass with the fermentor. This video demonstrates the setup and operation of a typical benchtop bioreactor system.

מבצע של Bioreactor Benchtop

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

חקירת הפרדת הזרימה התלת מימדית הנגרמת על ידי מודל פוליפ קיפול ווקאלי

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral surgery. Unlike platelet rich plasma (PRP) that is a gel or a suspension, Leukocyte-Platelet Rich Fibrin (L-PRF) is a solid 3D fibrin membrane generated chair-side from whole blood containing no anti-coagulant. The membrane has a dense three dimensional fibrin matrix with enriched platelets and abundant growth factors. L-PRF is a popular adjunct in surgeries because of its superior handling characteristics as well as its suturability to the wound bed. The goal of the study is to demonstrate generation as well as provide detailed characterization of relevant properties of L-PRF that underlie its clinical success.

Leucocyte-Platelet Rich Fibrin (L-PRF) represents an FDA cleared preparation of autologous platelet concentrates that possesses unique fibrin architecture, enriched platelets and abundant growth factors. Here, we present a protocol for chair-side generation of L-PRF as well as evaluate its mechanical properties including uniaxial testing and suture retention strength testing.

אפיון של יקוציט-טסיות העשיר הפיברין, רומן ביולוגי

Autologous platelet concentrates represent promising innovative tools in the field of regenerative medicine and have been extensively used in oral ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

Bioreactor רומן לטיפוח צפיפות גבוה של קהילות חיידקים מגוונות

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Construction and Setup of a Bench-scale Algal Photosynthetic Bioreactor with Temperature, Light, and pH Monitoring for Kinetic Growth Tests

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic performance of microalgae-based biofuel production. Models that estimate microalgal growth under different conditions can help to optimize PBR design and operation. To be effective, the growth parameters used in these models must be accurately determined. Algal growth experiments are often constrained by the dynamic nature of the culture environment, and control systems are needed to accurately determine the kinetic parameters. The first step in setting up a controlled batch experiment is live data acquisition and monitoring. This protocol outlines a process for the assembly and operation of a bench-scale photosynthetic bioreactor that can be used to conduct microalgal growth experiments. This protocol describes how to size and assemble a flat-plate, bench-scale PBR from acrylic. It also details how to configure a PBR with continuous pH, light, and temperature monitoring using a data acquisition and control unit, analog sensors, and open-source data acquisition software.

This paper describes the assembly process and operation of a bench-scale photosynthetic bioreactor that can be used, in conjunction with other methods, to estimate pertinent kinetic growth parameters. This system continuously monitors the pH, light, and temperature using sensors, a data acquisition and control unit, and open-source data acquisition software.

בנייה והתקנה של אלגורית מידה של אלגוריה ביאוריאקטור פוטוסינתטי עם טמפרטורה, אור, וניטור pH עבור בדיקות צמיחה קינטית

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein (HDL)-mimicking nanoparticles (NPs). HDLs are endogenous NPs and have been explored as vehicles for the delivery of therapeutic agents. Various methods have been developed to prepare HDL-mimicking NPs. However, they are generally complicated, time consuming, and difficult for industrial scale-up. In this study, one-step homogenization was used to mix the excipients and form the prototype NPs. NGF is a water-soluble protein of 26 kDa. To facilitate the encapsulation of NGF into the lipid environment of HDL-mimicking NPs, protamine USP was used to form an ion-pair complex with NGF to neutralize the charges on the NGF surface. The NGF/protamine complex was then introduced into the prototype NPs. Apolipoprotein A-I was finally coated on the surface of the NPs. NGF HDL-mimicking NPs showed preferable properties in terms of particle size, size distribution, entrapment efficiency, in vitro release, bioactivity, and biodistribution. With the careful design and exploration of homogenization in HDL-mimicking NPs, the procedure was greatly simplified, and the NPs were made scalable. Moreover, various challenges, such as separating unloaded NGF from the NPs, conducting reliable in vitro release studies, and measuring the bioactivity of the NPs, were overcome.

Simple homogenization was used to prepare novel, high-density, lipoprotein-mimicking nanoparticles to encapsulate nerve growth factor. Challenges, detailed protocols for nanoparticle preparation, in vitro characterization, and in vivo studies are described in this article.

הכנה ואפיון של נוזל HDL מחקה ננו-חלקיקים עבור אנקפסולציה גורם העצב הגדילה

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...