Biz konfokal görüntüleme onun eğitim ve tavsiye için Dr Jeffrey Caplan&#39;ı teşekkür ederim. Biz de SEM yardım için Keck Elektron Mikroskopi Lab ve Dr Chaoying Ni teşekkür ederim. Bu çalışma Sağlık (NIDCD, R01DC008965 ve R01DC011377) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edilmektedir. ABZ NSF Bütünleştirici Lisansüstü Eğitim ve Araştırma staj finansman için (IGERT) programı kabul eder.

1.. Biyoreaktör Meclisi (Video 1) <ol><li> Önceden belirlenmiş bir iç ve dış boyutlara sahip bir alüminyum kalıp (dairesel kalıp + boşluk pin) (Şekil 1) olun. </li><li> In: (Şekil 1 &#39;de boşluk pim ile şekillenen 12 mm, kalınlığı ~ 0.25 mm, çap) bir sabit kol ile aşama 1.1 kalıp kullanılarak, silikon membran (1.5 mm, Şekil 1: 42 mm, kalınlık çap) üretmek Bir ticari olarak temin edilebilen bir silikon elastomer kiti kullanılarak orta. </li><li> Eşleşen çıkıntı ve oluklar ile blok (0.9 cm kalınlığında) üst oyma (1.8 cm kalınlığında) ve alt, ortada: dairesel bir açıklığa (24 mm çap) sahip akrilik bir çift bloğu (Şekil 2 (4, 5)) Yap . 10. </li><li> Eşleştirilmiş akrilik bloklar arasındaki silikon membran sandviç. Sabit bir kuvvet (35 cN · m) ayarlanmış bir mikro tork tornavida kullanarak dört köşe vida ile düzeneğini sabitleyen. Sonuç olarak, bir su geçirmez, 24 mm genişliğinde ve 18 mm derinliğinde titreşim odası (Şekil 2C) oluşturulur. </li><li> Alt akrilik blokta köşe vidalar başka bir dizi titreşim odasının altında bir 3 &quot;uzun menzilli mini woofer (Şekil 2B, 8 Ω/20 W) monte edin. Bu noktada, tek bir titreşim modülü monte edilir. </li><li> Yedi ek titreşim modülleri çoğaltmak. Çubuklar halinde kesilir eşit aralıklı bir dairesel delik (: 7 cm, kalınlığı 2 cm çapında) hoparlör bazları yerleştirilerek iki sabit alüminyum çubuklar (40 cm x 10 cm x 2.5 cm) birine dördü yapıştırın. Her bir dairesel deliğe alüminyum çubuğun tarafı boyunca bir vida sokulmasıyla her bir hoparlör stabilize. </li><li> Bireysel bir hoparlör seçici tarafından hoparlörleri kontrol. Seçici üzerindeki karşılık gelen çıkışlarına sonra hoparlör vücut üzerinde pozitif ve negatif girişleri için teller takılarak seçicinin tek tek hoparlör bağlayın. Hoparlör Seçici olanak t sinyaliO fonksiyon jeneratörü, bir güç amplifikatörü geçtikten sonra, bir kez (Şekil 2E) bütün sekiz hoparlör ulaşmak için. </li><li> Bir anti-nem muhafaza içinde iki odası dizileri, hoparlör seçici ve ilgili elektronik yerleştirin. Ticari bir hücre kültürü inkübatör tüm montaj ev. </li><li> Inkübatör arka filtre düzeneği üzerinden güç amplifikatör ve hoparlör seçici bağlantı (a medikal PVC boru yoluyla) ana kablolar besleyin. </li></ol> 2.. İskele Üretimi ve Karakterizasyonu <ol><li> 15 ağırlık% &#39;lik bir konsantrasyonda kloroform içinde PCL pelet çözülür. Bir 21 G kör uçlu iğne ile kapatılmış bir 10 ml şırınga içine solüsyonu yerleştirin. </li><li> Bir programlanabilir şırınga pompa üzerine şırınga Kilit ve / ml &#39;de 1 saat akış hızını ayarlayın. </li><li> ~ 18 sm bir iğne ucu-toplayıcı için mesafe ile yatay olarak iğne arasında alüminyum folyo kaplı toplayıcı yerleştirin. </li><li> Pozitif alli Kelepçeiğne ortasında ve alüminyum kollektör için zemin timsah klibi timsah klibi, sonra 15 kV yüksek gerilim güç kaynağı gerilimini ayarlayabilirsiniz. DİKKAT: yüksek gerilim, iğne mesafe tutmak. </li><li> Sırasıyla şırınga pompa ve güç kaynağı açın; hızlı bir şekilde temiz / stabil fiber jetleri önce kuru bir kağıt havlu kullanarak iğne ucu çevreleyen kalan polimer çözüm kaldırmak ve Taylor koni 19 oluşturulmuştur. </li><li> Lifler, 250-300 um ~ bir kalınlığa Al toplayıcı üzerinde birikmesine izin verir (~ mevcut eğirme koşulları altında 7 saat). Herhangi bir artık çözücünün çıkması için 1-2 gün için bir vakumlu desikatör içinde sonuçtaki iskeleleri saklayın. </li><li> Görüntü iskelesi, tutarlı bir elyaf morfolojisi gösteren bir Tarama Elektron Mikroskobu kullanılarak, üzeri serpme altınla kaplanır. 10 </li></ol> 3.. Biyoreaktör Montaj ve Karakterizasyonu <ol><li> Dört kol (uzunluğu: silindir şeklinde bir disk (8 mm çapında) 2: zımbailk olarak, diskin dış çapı azaltmak için bir 12 mm çaplı biyopsi zımba kullanılarak bükümlenmiş PCL mat (Şekil 2A) üzerinden mm). Ardından eşit silah kesilecek nerede puan dairesel bıçak çevresinde aralıklı dört 2 mm uzunluğunda çentikler yapmak için ikinci bir 8 mm biyopsi yumruk kullanın. 8 mm yumruk attıktan sonra, dışa kollarının kenarlarını kesmek için bir neşter bıçak kullanın. Uzatılmış kollar üzerinden silikon membran oluk içine yerleştirin iskele (Video 1). Nazikçe flathead cımbız kullanarak yüzeyi basarak eklenen iskele düzleştirin. </li><li> Lazer yansıma yardımcı olmak üzere PCL iskele ince Al folyo küçük bir parça (8 mm x 2 mm, ortogonal şekil, Şekil 2B) takın. </li><li> Titreşim odası içindeki monte silikon membran / PCL iskele (aşama 1.4 &#39;de açıklandığı gibi) elde edin. Titreşim önce PCL iskele hidrat için odacık içinde 1.5 ml su ilave edilir. </li><li> Fonksiyon jeneratör kullanarak, titreşim işareti tanıtmakals sandviç akrilik haznesine (0,1 V bir tepe-tepe voltaj, Vpp olan, örneğin, 200 Hz sinüs dalgaları). Doğru her hoparlör girişindeki voltajı ölçmek için bir voltmetre kullanın. Not: fonksiyon jeneratöründen gelen Vss okuma hoparlör teslim nihai geriliminden farklı olacaktır. </li><li> Tek-nokta LDV birleştirin ve bir pan-tilt kafa tripod fiber-optik lazer sensör kafasını sabitlemek. Açı sensör kafasını o masa dik bakacak şekilde. Koaksiyel kablo üzerinden veri toplama modülüne LDV sensör kafasını bağlayın ardından USB üzerinden laptop modülü. </li><li> Silikon membran (Şekil 2B ve Şekil 3) üzerinde çeşitli önceden belirlenmiş noktalarda dik olarak bir lazer ışını Odak. </li><li> Veri toplama yazılımı kullanarak, orta zar deplasman kaydedebilirsiniz. &quot;Seçenekler&quot; menüsünden &quot;Acquisition Ayarlar&quot; ı tıklayın; sonra ölçüm modunu &quot;FFT değiştirin221;. Sonra, ana araç çubuğundaki &quot;Sürekli Ölçüm&quot; tıklatın deplasman kaydetmek için seçilen frekansta (Şekil 6D) de oluşturan tepe tıklatın. </li><li> Alt-tabaka üzerinde göreli konumun bir fonksiyonu olarak normal orta zar yer değiştirme (w 0) çizilir. Origin 8.5 veri analiz yazılımı kullanılarak yüzey titreşim profilinin 3D renk haritası oluşturun. </li></ol> 4. Titreşimli Hücre Kültürü <ol><li> Bakım MSC medya / cm 2 4,000-5,000 hücrelik bir başlangıç ​​yoğunluğunda tohumlama T150 doku kültürü şişelerinde alt kültür İnsan kemik iliğinden türetilmiş MSC. </li><li> Hücre kültürü 7-8 gün sonra (~% 85 konfluansa kadar), bu Accutase gibi bir hücre ayrıştırma maddesi ile hücreleri trypsinize, bir hemositometre, santrifüj (5 dakika için 440 x g) kullanılarak sayısı ve yeniden askıya hücre peleti içinde 4.5 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda taze MSC bakım ortamı. </li><li> PCL scaffo daldırın% 70 etanol O / N. ld Çözücü buharlaştırılmıştır sonra 5-8 dakika boyunca UV ışığı (254 nm) için mikrop öldürücü skafoldun iki tarafını ortaya çıkarmak. </li><li> 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de 20 ug / ml fibronektin çözeltisi içindeki PCL iskele bekletin. Silikon membran içine fibronektin kaplı iskele yerleştirin. 1. adımda ayrıntılı olarak biyoreaktör birleştirin. </li><li> PCL güvenli iskele üzerinde düzgün bir şekilde hücre süspansiyonu 40 ul dağıtın. Hücreler titreşim bölmeye ilave bir 1.5 ml taze ortam ilave edilmeden önce 1-1.5 saat boyunca takmak için izin verin. </li><li> Kültür MSC-yüklü PCL 3 gün boyunca statik iskele ve statik kültür tamamlandıktan sonra ortam yenileyin. </li><li> Hücresel yapıları seçilen titreşim rejimleri empoze. Not: Örnek olarak, hücreler kadar 7 gün boyunca günde 12 saat boyunca ~ 40 um aw 0 ile 200 Hz&#39;de titreşim (OF), bir 1-hr-on-1-hr-off tabi tutulur. Titreşimli uyarılara maruz Yapıları Vib örnekleri ve bu kültürlerdeki olarak belirlenmişstatik aynı titreşim odalarına kırmızı olarak statik kontrollerini (İstatistik) hizmet vermektedir. </li></ol> 5.. Biyolojik Değerlendirmeleri <ol><li> Her gün, her bölmeden 200 ul hücre kültür ortamı kazan (gün 1, 3, 5 ve 7) ve (800 ul her biri) ile birlikte, aynı örnekten alikotları havuz. </li><li> MMP-1 (MMP1) ve üreticilerin prosedürü izleyerek, sırasıyla, bir MMP1 ELISA Geliştirme kiti ve bir hiyalüronan rekabetçi ELISA kiti kullanılarak HA hücresel üretim niceliğini. Öte yandan, daha önce bildirilen prosedür takip edilerek ELISA çözünür ön-elastin üretimini tahlil. 8 </li><li> 7. günde, son titreşim döngüsünün tamamlanmasından sonra, hızlı bir şekilde keskin cımbız kullanarak titreşim odalarından hücresel yapıları çıkarın ve kısa bir süre soğuk bir fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, 4 ° C) ile yıkayın. </li><li> Canlı / ölü boyama için, propidyum iyodür (PBS içinde 1:2,000) ile yapıları ve kuluçkaya yatmakSyto-13 oda sıcaklığında 5 dakika boyunca aynı anda (PBS içerisinde 1:1000). Görüntü bir multiphoton konfokal mikroskop ile boyanmış yapılar. </li><li> Ayrı olarak, kuru buz üzerinde PBS ile durulanmıştır hücre yapıları ek dondurma ve gen analizleri için, daha önce rapor protokolü takip edilerek, toplam hücre RNA ekstrakte edin. 9 </li><li> UV-Vis spektrofotometre kullanılarak çıkarılan RNA miktarını ve kalitesini kontrol edin. 1,8-2,2 arasında A260/A280 ve A260/A230 oranları ile RNA numuneleri daha sonra QPCR analizi için kullanılmıştır. </li><li> Ters bir ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılarak ters transkripsiyon cDNA&#39;ya RNA (500 ng / numune) uyarlamak. </li><li> Daha önce detaylı bir prosedür izlenerek ticari olarak temin edilebilir PCR master karışımını kullanarak gerçek zamanlı bir sekans saptama sistemi üzerinde PCR reaksiyonu yapın. 8 </li><li> Ticari QPCR veri analiz yazılımı kullanılarak qPCR analiz sonuçları. Veri analizinin güvenilirliğini sağlamak için, çoklu referans genler (YWHAZ, TBP, PPIA) int olarak istihdam edilmektedirernal kontrol ve spesifik primer verimlilik değişme göz önüne alınır. 8 </li></ol>

<ol>
	<li>Titze, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical-Stress+in+Phonation.">Mechanical-Stress in Phonation.</a> J. Voice. 8, 99-105 (1994).</li><li>Titze, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Relation+Between+Subglottal+Pressure+and+Fundamental-Frequency+in+Phonation.">On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation.</a> J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).</li><li>Gray, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+physiology+of+the+vocal+folds.">Cellular physiology of the vocal folds.</a> Otolaryngol. Clin. N. Am. 33, 679-698 (2000).</li><li>Thibeault, S. L., Gray, S. D., Bless, D. M., Chan, R. W., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+rheologic+characterization+of+vocal+fold+scarring.">Histologic and rheologic characterization of vocal fold scarring.</a> J. Voice. 16, 96-104 (2002).</li><li>Hansen, J. K., Thibeault, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+and+review+of+the+literature:+Vocal+fold+scarring.">Current understanding and review of the literature: Vocal fold scarring.</a> J. Voice. 20, 110-120 (2006).</li><li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells.">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li><li>Hanson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Mesenchymal+Stem+Cells+From+Human+Vocal+Fold+Fibroblasts.">Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Vocal Fold Fibroblasts.</a> Laryngoscope. 120, 546-551 (2010).</li><li>Tong, Z., Duncan, R. L., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+the+behaviors+of+mesenchymal+stem+cells+via+the+combination+of+high-frequency+vibratory+stimulations+and+fibrous+scaffolds.">Modulating the behaviors of mesenchymal stem cells via the combination of high-frequency vibratory stimulations and fibrous scaffolds.</a> Tissue Eng. Part A. 19, 1862-1878 (2013).</li><li>Tong, Z., Sant, S., Khademhosseini, A., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+Fibroblastic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Via+the+Combination+of+Fibrous+Scaffolds+and+Connective+Tissue+Growth+Factor.">Controlling the Fibroblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Via the Combination of Fibrous Scaffolds and Connective Tissue Growth Factor.</a> Tissue Eng. Part A. 17, 2773-2785 (2011).</li><li>Jones, D. L., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+place+like+home:+anatomy+and+function+of+the+stem+cell+niche.">No place like home: anatomy and function of the stem cell niche.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 11-21 (1038).</li><li>Wang, J. H., Thampatty, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+Adult+and+Stem+Cells.">Mechanobiology of Adult and Stem Cells.</a> Int. Rev. of Cell Mol. Biol. 271, 301-346 (2008).</li><li>Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+tensile+culture+promotes+fibroblastic+differentiation+of+marrow+stromal+cells+encapsulated+in+poly+(ethylene+glycol)-based+hydrogels.">Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly (ethylene glycol)-based hydrogels.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 3457-3466 (2010).</li><li>Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+mechanical+strain+regulates+the+development+of+engineered+smooth+muscle+tissue.">Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue.</a> Nat. Biotechnol. 17, 979-983 (1999).</li><li>Webb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+strain+increases+fibroblast+proliferation,+matrix+accumulation,+and+elastic+modulus+of+fibroblast-seeded+polyurethane+constructs.">Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs.</a> J. Biomech. 39, 1136-1144 (2006).</li><li>Kim, Y. J., Sah, R. L. Y., Grodzinsky, A. J., Plaas, A. H. K., Sandy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Regulation+of+Cartilage+Biosynthetic+Behavior+-+Physical+Stimuli..">Mechanical Regulation of Cartilage Biosynthetic Behavior - Physical Stimuli..</a> Arch. Biochem. Biophys. 311, 1-12 (1994).</li><li>Titze, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+bioreactor+for+engineering+vocal+fold+tissues+under+combined+tensile+and+vibrational+stresses.">Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses.</a> J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).</li><li>Kutty, J. K., Webb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibration+stimulates+vocal+mucosa-like+matrix+expression+by+hydrogel-encapsulated+fibroblasts.">Vibration stimulates vocal mucosa-like matrix expression by hydrogel-encapsulated fibroblasts.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 62-72 (2010).</li><li>Farran, A. J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Characterization+of+a+Dynamic+Vibrational+Culture+System.">Design and Characterization of a Dynamic Vibrational Culture System.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2011).</li><li>Reneker, D. H., Yarin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+jets+and+polymer+nanofibers.">Electrospinning jets and polymer nanofibers.</a> Polymer. 49, 2387-2425 (2008).</li><li>Wang, Y., Theobald, P., Tyrer, J., Lepper, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+scanning+vibrometer+in+mapping+ultrasound+fields.">The application of scanning vibrometer in mapping ultrasound fields.</a> J. Phys.: Conf. Ser. 1, 167-173 (2004).</li><li>Brown, W. S., Morris, R. J., Hollien, H., Howell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speaking+Fundamental-Frequency+Characteristics+as+a+Function+of+Age+and+Professional.">Speaking Fundamental-Frequency Characteristics as a Function of Age and Professional.</a> J. Voice. 5, 310-315 (1991).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanotransduction:+putting+all+the+pieces+together+again.">Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again.</a> Faseb J. 20, 811-827 (2006).</li><li>Titze, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+bioreactor+for+engineering+vocal+fold+tissues+under+combined+tensile+and+vibrational+stresses.">Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses.</a> J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).</li><li>Moore, J., Thibeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+Into+the+Role+of+Elastin+in+Vocal+Fold+Health+and+Disease.">Insights Into the Role of Elastin in Vocal Fold Health and Disease.</a> J. Voice. 26, 269-275 (2012).</li><li>Thibeault, S. L., Bless, D. M., Gray, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+protein+alterations+in+rabbit+vocal+fold+with+scar.">Interstitial protein alterations in rabbit vocal fold with scar.</a> J. Voice. 17, 377-383 (2003).</li><li>Branski, R. C., Verdolini, K., Sandulache, V., Rosen, C. A., Hebda, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vocal+fold+wound+healing:+A+review+for+clinicians.">Vocal fold wound healing: A review for clinicians.</a> J. Voice. 20, 432-442 (2006).</li><li>Clark, I. A., Swingler, T. E., Sampieri, C. L., Edwards, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors.">The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Int. J. Biochem. Cell B. 40, 1362-1378 (2008).</li><li>Silver, F. H., Horvath, I., Foran, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelasticity+of+the+vessel+wall:+The+role+of+collagen+and+elastic+fibers.">Viscoelasticity of the vessel wall: The role of collagen and elastic fibers.</a> Crit. Rev. Biomed. Eng. 29, 279-301 (2001).</li><li>Kutty, J. K., Webb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Engineering+Therapies+for+the+Vocal+Fold+Lamina+Propria.">Tissue Engineering Therapies for the Vocal Fold Lamina Propria.</a> Tissue Eng. Part B: Rev. 15, 249-262 (2009).</li></ol>

Hiçbir rakip mali çıkarları var.

In vitro fonksiyonel vokal kord dokuların başarılı mühendislik multipotent hücrelerinin davranışlarını aracılık etmek bir vokal kord benzeri mikroçevresinin rekreasyon gerektirir. Genellikle doku veya organ yapıları da gerçekleştirmek için gerekli işlevleri yansıttığı kabul edilmektedir. Vokal kord dokuları için 22, fonasyon sırasında ortaya çıkan yüksek frekanslı titreşimler doku olgunlaşması için önemli olduğu önerilmiştir. Vokal kord biyoreaktör kültürlü ...

Bir epitel tabakası oluşan insan vokal kord, lamina propria (LP) ve vocalis kas, ses üretimi için akustik dalgalar halinde akciğerlerden hava akışını dönüştüren özel bir yumuşak doku. 1. Vokal kıvrımlar, normal fonasyon sırasında düzenli salınım, değişen temel frekanslarda% 30&#39;a varan suşları sergileyen 100-300 Hz arasında. 2 Adult vokal kat LP yüzeysel (SLP) oluşan bir degrade yapı, bir ara (TDP) ve derin (DLP) tabakasıdır. Bundan başka sınıflandırma grupları epitelyum ve mukoza tabakası olarak SLP ve ses ligamana İLP DLP ve bir araya getirir. 3 bağ olgun kolajen ve elastin lifleri ile zenginleştirilmiştir ise SLP tabaka, seyrek dağılmış kollajen lifleri ile öncelikle bir amorf matrisi içermektedir yeterli gücü sağlamak. 4. yapısı ve doğan vokal kıvrım mekaniği kendi olgun meslektaşları arasında büyük ölçüde değişebilir. Her ne kadar mekanizmasıvokal kord gelişimini ve olgunlaşmasını düzenleyen s henüz tam deneysel kanıt seslendirme kaynaklı mekanik stres tanımlayan rollerine işaret etti, anlaşılamamıştır. Sesli taciz, enfeksiyonlar, kimyasal maddelere ve cerrahi prosedürler dahil olmak üzere birçok tıbbi durumlar, vokal kat zarar verebilir. Vokal kord bozuklukları ABD nüfusunun yaklaşık% 3-9 etkiler. Vokal kord hastalıkları için güncel tedavi yöntemleri 5 sınırlıdır ve bir kök hücre tabanlı doku mühendisliği yaklaşımı vokal kord fonksiyonunu yeniden kazandırmak için umut verici bir strateji olarak ortaya çıkmıştır. Mezenkimal kök hücreler (MKH) vokal kord doku mühendisliği için birincil vokal kord fibroblastlar için uygun bir alternatiftir. 6-9 Kök hücre kaderinin şartname ve sonraki doku gelişimi mekanik durumdur ki onlar ikamet belirli bir niş, aracılık bir önemli bir faktördür. 10. Mekanik kuvvetler doku morfonogenezi a temel düzenleyicileridirlernd özellikle rutin bir doku mühendisliği açısından bakıldığında yükleme. 11 maruz kalan dokular için homeostazı, bu maruz kalma fizyolojik olarak uygun mekanik uyarılarla hücre farklılaşması ve dokuya özel matris yeniden kök teşvik için olduğu gösterilmiştir. 12-15 Doku kültürü biyoreaktörler in vitro hücre veya doku büyümesi için arzu edilen fizyolojik bir ortam simüle etmek için tasarlanmıştır. Vokal kord doku mühendisliği için, phonating vokal kıvrımların mekanik ortamını yeniden oluşturmak için özellikle önemlidir. İdeal vokal kord biyoreaktör etkili frekans, genlik ve titreşim süresi boyunca uyduruk kontrol sağlayan, kültür hücreleri titreşimli ipuçları teslim etmelidir. Titze ve arkadaşları matriks proteinlerinin hücresel üretimini teşvik etmek için yüksek frekanslı (20-200 Hz) salınımları ile statik esneme birleştiren bir vokal kord biyoreaktörünü (T1 biyoreaktör) 16 geliştirmiştir. Istimalg Bu biyoreaktör, Webb ve arkadaşları 17 hyaluronik asit (HA)-tabanlı hidrojel içinde kültüre dermal fibroblastlar üzerinde 10 günlük, 100-Hz titreşimlerin etkilerini inceledi. Titreşime maruz yapılar HA sintaz-2 (var2) statik kontrollere göre, dekorinin, fibromodulin ve matris metaloproteinaz-1 (MMP1), bir yüksek ifade sergiledi. Uyarıcı etkileri bağımlı zaman olduğu bulunmuştur. Daha yakın zamanlarda, grubumuz 18, bir güç yükselticisi, bir fonksiyon jeneratörü, kapalı bir hoparlör ve ekli hücrelere salınımlı hava transfer eden bir çevresel olarak sabitlenmiş silikon membran kullanılan bir ses kat biyoreaktör (J1 biyoreaktör) toplandı. J1 biyoreaktör içinde yetiştirilir Neonatal sünnet derisi fibroblast kadar% 0.05 &#39;lik bir düzlem suşu ile, 60, 110 ya da 300 Hz&#39;de titreşim 1 saat tabi tutulmuştur. QPCR sonuçlar, bazı ECM genlerin ekspresyon orta çeşitli titreşim frekanslarına karşılık olarak değiştirilmiş olduğu ileri sürülmüştürve genlikleri. Bu biyoreaktör tasarımlar, ilginç ederken, çeşitli sınırlamalar var. Örneğin, T1 sistem ulaşılabilir maksimum frekansları sınırlayarak, mekanik bağlanma için konektörler ve bar bir sayıda gerektirir. Ayrıca, hücreler veri yorumlama karmaşık istenmeyen mekanik çalkalama ve sıvı pertürbasyon tabi tutulabilir. J1 biyoreaktör, diğer yandan, nispeten düşük enerji dönüşüm verimliliği sergiler ve kullanıcı dostu değildir. Buna ek olarak, titreşim sıklıkla temel silikon zardan hücre yüklü yapıları ayırır. J1 sürüm olarak aynı prensibe göre dizayn Burada bildirilen J2 vokal kord biyoreaktör, tutarlılık ve tekrarlanabilirlik için optimize edilmiştir. Fonasyon taklit eden titreşimler MSC nüfuslu lifli poli (ε-kaprolakton) (PCL) iskeleleri effectiv olan tek tek monte titreşim odalarına aerodinamik oluşturulurely güvenli. Lazer Doppler Titreşim Ölçer (LDV) kullanıcı membran / iskele montaj titreşim profilini doğrulamak sağlar. Bizim tanıtımda, MSC 7 gün boyunca 12 saat günlük bir toplam için 1 saatlik-on-1-hr-kapalı (OF) model ile 200 Hz sinüzoidal titreşimlere maruz kalmaktadır. Dayatılan titreşimli ipuçlarını hücresel yanıtlar sistematik olarak incelenmiştir. Genel olarak, J2 vokal kord dinamik hücre kültürü çalışmaları, yüksek verim ve tekrarlanabilir şekilde yapılacak sağlayan, en kullanıcı dostu özellikleri sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="853">
	<tbody>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;width:248px;">silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:188px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:124px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:293px;">cure the membrane at 100 C for 2 hr</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">PCL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>440744-500G</td>
			<td>Mn ~ 80 kDa, dissolve overnight</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7559-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">human bone marrow-derived MSCs</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td>received with passage 2</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">MSC maintenance media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td style="width:293px;">10% FBS in basal media supplemented 
			with L-glutamine, gentamicin and amphotericin</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">Accutase cell dissociation reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2006-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">MMP1 DuoSet ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DY901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">HA ELISA kit</td>
			<td>Echelon Biosciences</td>
			<td>&#160;K-1200&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">propidium iodide&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">Syto-13&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">QuantiTect reverse transcription kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">SYBR Green PCR master mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4309155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">replacement speaker</td>
			<td style="width:188px;">DAYTON audio 
			(via Parts Express)</td>
			<td>DS90-8</td>
			<td>paper cone, full range (80-13000 Hz), 85dB</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">Ergo Micro torque screwdriver</td>
			<td>Mountz</td>
			<td># 020377</td>
			<td>torque range: 20-120 cN.m</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">stereo speaker selector</td>
			<td>RadioShack</td>
			<td>40-244</td>
			<td>maximum power handling 50 W</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">function generator&#160;</td>
			<td>Agilent&#160;</td>
			<td>33220A</td>
			<td>frequency range 1 &#181;Hz- 20 MHz</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">power amplifier&#160;</td>
			<td>PYLE audio</td>
			<td>PylePro PT2400</td>
			<td style="width:293px;">frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker 
			channels</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">cell culture incubator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>Steri-Cult 3307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">syringe pump&#160;</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">High voltage power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>CZE 1000R</td>
			<td>output voltage: 0-30 kV</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">scanning electron microscope&#160;</td>
			<td>JEOL-USA</td>
			<td>JSM-7400F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">desk gold sputter coater</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td>DSK00V-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">Doppler laser vibrometer&#160;</td>
			<td>Polytec</td>
			<td>PDV-100</td>
			<td>non-contact velocity measurement (0-22 kHz)</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">PCR sequence detection system&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>ABI7300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">multiphoton confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss 510Meta NLO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV-VIS Spectrophotometer&#160;</td>
			<td style="width:188px;">NanoDrop Products 
			via Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">VibSoft Data Acquisition Software</td>
			<td>Polytec</td>
			<td></td>
			<td>acquisition bandwidth up to 40 MHz</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">Origin 8.5 data analysis software&#160;</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">qbasePlus qPCR data analysis software&#160;</td>
			<td>Biogazelle</td>
			<td>V2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">aluminium alloy&#160;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>Alloy 6061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">acrylic blocks</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">polycarbonate anti-humidity chamber</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td></td>
			<td style="width:293px;">Impact-Resistant&#160;Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">screws&#160;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">electronic cable/wire</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">medical grade PVC tubing</td>
			<td>US Plastic Corp.</td>
			<td>Tygon S-50-HL</td>
			<td>clear, biocompatible</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">10 mL syringe&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">21 G blunt ended needle</td>
			<td>Small Parts</td>
			<td>NE-213PL-25</td>
			<td>1-1/2&#34; length</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">Alligator clip adapters&#160;</td>
			<td>RadioShack</td>
			<td>270-354</td>
			<td>fully insulated</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">8 mm biopsy punch</td>
			<td><a href="http://www.sklarcorp.com/ProductListUS.aspx?DepartmentID=10&amp;CategoryID=96">Sklar&#160;Surgical Instruments</a></td>
			<td>96-1152</td>
			<td>sterile, disposable</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">12 mm biopsy punch</td>
			<td>Acuderm (via Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:124px;">NC9998681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:17px;">tissue culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>cell culture treated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction and characterization of a novel vocal fold bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 &#181;m. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

Elektrospinning ile imal PCL iskeleleri mikron büyüklüğünde interstisyel gözenekler ve 4.7 um (Şekil 4A) arasında bir ortalama çapa sahip rastgele bir biçimde dolanmış elyaflar içerir. Daha yüksek bir büyütme oranında nano ölçekli oluklar ve gözenekler tek tek liflerin (Şekil 4B) üzerinde görülebilir. Fibronektinle iskelelerinin kaplama hidrofilikliğin geliştirir ve ilk hücre yapışmasını / PCL iskelesi (yayınlanmamış gözlem) yayılan kolaylaştırır. ...

Watch this Scientific Journal Video about Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor at JoVE.com

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(&#949;-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

Bir Roman Vokal Fold Bioreactor İnşaatı ve Karakterizasyonu

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

construction-and-characterization-of-a-novel-vocal-fold-bioreactor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.1K Görüntüleme.  University of Delaware. A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(ε-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.