המחברים מבקשים להודות לקרן ומחלקה למענק מחקר ניתוח מדרום אוניברסיטת אילינוי, בית הספר לרפואה של סטארט אפ; ומענק הקרן רפואית לזכר.

1. אחזור כירורגי הערה: אישור IRB הושג לאסוף את גדם ACL במהלך ניתוח שחזור ACL. פטור IRB ניתנו כגדם ACL משמש, בדרך כלל, מושלך כפסולת כירורגית. 20 חולים שימשו כדי לאסוף את גדם ACL. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל הרדמה כללית ואנטיביוטיקה לפני ניתוח לפי הפרוטוקול של מוסד למטופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל חוסם עורקים ולנפח מעל לחץ דם הסיסטולי 100 מ&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם את המטופל במצב שכיבה. לעשות חתך anterolateral אופקי עם הברך בכיפוף ° 30-45 לפורטל 5 מ&quot;מ ולהכניס נקז ארתרוסקופי ומצלמה לתוך כיס suprapatellar ב30 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ארתרוסקופיה אבחון שגרתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן ברמה גבוהה וdebride הסינוביום הקרומי על ACL הקרוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במכונת גילוח 4.5 מ&quot;מ וablator לזהות את גדם ACL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במקור ברווז ישר מרים לאסוף SPE מרובהcimens מגדם ACL הנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על המדגם במלח רגיל במכל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלח את הדגימות לפתולוגיה לפענוח ואספקה ​​סופית למתקן במעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר מטופל ולבצע טיפול שלאחר ניתוח לפי הפרוטוקול של המוסד. </li></ol> 2. עיכול רקמות ובידוד hACL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רקמת ACL האדם קיבלה מהפתולוגיה בצלחת פטרי עם תמיסת מלח סטרילית / PBS (פוספט שנאגרו מלוח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכך את הרקמה באמצעות מספריים סטרילי לתוך 1-2 מ&quot;מ 3 חתיכות ולשטוף את הרקמה הטחון עם מי מלח לפחות 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את הרקמה הטחון עם Collagenase 0.4% בDMEM/F-12 (50/50, 1x) בינוני בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין ל4-6 שעות על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים XG ב 1000 למשך 5 דקות ולאחר מכן resuspend התאים במדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם המדיום ל2-3 פעמים ולאחר מכן seed / תרבות בT-25 צלוחיות ל2-3 ימים. </li></ol> 3. ההרחבה נייד, הקפאה להפשרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ אור כדי להמחיש את התאים בתרבית למשך 2-3 ימים בבקבוק T-25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על התאים ב37 מעלות צלזיוס בDMEM/F-12 (50/50, 1x) הבינוני בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S). הערה: שנה את התקשורת כאשר תאים להראות דבקות ומורפולוגיה סטנדרטית. השתמש במיקרוסקופ אור כדי לבחון את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את התאים ומחוברות עם PBS ביום 7 (~ 1.3 X 10 6 תאים / בקבוק). הוספת טריפסין (0.5 g / L) ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הוסף מדיה לתאים הושעו לנטרל טריפסין. מחלקים את תערובת מדיה התאים בין שלוש T-25 צלוחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את התאים ומחוברות עם PBS, להוסיף טריפסין (0.5 גר &#39;/ ל&#39;), וresuspend אותם בהקפאת מדיום המכיל DMSO, FBS ובינוני המלא (DMEM/F-12 בינוני + 10% P FBS 1% + / S) ב 1:02:07 יחס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנותבקבוקוני קריוגני ב -80 ° C אם התאים ישמשו בתוך חודש, ובחנקן נוזלי, אם התאים יישמרו במשך תקופות ארוכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את המבחנות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לשימוש חוזר. הערה: בדרך כלל תאי 90-95% לשרוד. </li></ol> 4. ייצור של רקמות מהונדסות 2-D לקטית, חומצה גליקולית שיתוף פולי פיגום (PLAGA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמס 1 גרם של PLAGA ב12 מיליליטר dichloromethane בבקבוקון נצנץ 20 מיליליטר ומערבולת הפתרון במשך 8 שעות במהירות קבועה (800 סל&quot;ד). הערה: תיאור פרטני בגופטה ואח&#39; 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הפתרון המומס לצלחת פטרי זכוכית מרופדת בנייר הגנת Fluorinated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת פטרי מתחת למכסת מנוע ואקום ל30 דקות. השאר את צלחת פטרי ב -20 מעלות צלזיוס למשך לילה ולאחר מכן בטמפרטורת חדר. הנח את צלחות פטרי בlyophilizer כדי להבטיח אידוי של הממס מלא להשיג סרטים דקים של הפולימר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בדיוני הפולימרLMS בייבוש ל24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את סרטי פולימר ל12 דיסקים עגולים בקוטר מ&quot;מ ולאחסן אותם בתא ייבוש עד צורך. </li></ol> 5. סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים (SEM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים (50,000 תאים / דיסק) זורעים על TCPS השליטה ופיגום PLAGA עם PBS 7 ימים לאחר זריעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש glutaraldehyde 1.5% במאגר M 0.1 cacodylate לתקן תאים ו2.5% Oso 4 במאגר M 0.1 cacodylate להודעה קיבעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים הקבועים עם מאגר M 0.1 cacodylate. ייבש את התאים הקבועים באמצעות התייבשות סידורי אתנול (50%, 70%, 80%, 90% ו100%) ל15 דקות כל אחד, ועוד יותר יבש בHexamethyldisilazane (HMDS) למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vent הקאמרית של מערכת ציפוי גמגום SEM עם שסתום לחץ ולהעלות את הצלחת העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגימות יבשות בחדר. מנמיכים את הצלחת העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את ידית השליטה לשאוב כדי להתחיל בפינוי החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שסתום דליפת ארגון פתח. חכהלוואקום לרדת ל 0.05 mbar. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות המעיל היבשים בשכבה דקה (0.13 ננומטר) של זהב / פלדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את שסתום דליפת ארגון למצב הסגור שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את ידית שליטה לכבויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vent קאמרי עם שסתום לחץ ולהעלות את הצלחת העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הדגימות ולאחסן אותם בתא ייבוש ל24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב הדגימות תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. </li></ol> 6. Immunofluorescence מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים (50,000 תאים / דיסק) זורעים על TCPS השליטה ופיגום PLAGA עם PBS 7 ימים לאחר זריעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים באמצעות 70% אתנול (קר) ל10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים הקבועים בטמפרטורת חדר עם 1% הסרום אלבומין שור (BSA) ב-PBS שיש 0.05% טריטון X-100 עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הדגימות בTween 1% בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נוגדן חד שבטי עכבר Anti-β-אקטין (1:400) ודגירת התאים overnighלא ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם Tween 0.05%. הוספת נוגדנים משני (עז אנטי העכבר F (ab &#39;) 2 שבר של IgG מצומדות עם בדיקה הקרינה, 1:400) לתאי דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS. כתם התאים עם כתם גרעיני והר באמצעות 80% גליצרול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ confocal. </li></ol>

<ol>
	<li>Johnson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anterior+cruciate+ligament:+A+dilemma+in+sports+medicine.">The anterior cruciate ligament: A dilemma in sports medicine.</a> Int J Sports Med. 3, 71-79 (1982).</li><li>Owings, M. F., Kozak, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ambulatory+and+inpatient+procedures+in+the+United+States,+1996.">Ambulatory and inpatient procedures in the United States, 1996.</a> Vital Health Stats. 13, 1-119 (1998).</li><li>Frank, C. B., Jackson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+reconstruction+of+the+anterior+cruciate+ligament.">The science of reconstruction of the anterior cruciate ligament.</a> J Bone Joint Surg Am. 79, 1556-1576 (1997).</li><li>Miyasaka, K. C., Daniel, D. M., Stone, M. L., Hirshman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+knee+ligament+injuries+in+the+general+population.">The incidence of knee ligament injuries in the general population.</a> Am J Knee Surg. 4, 3-8 (1991).</li><li>Taylor, D. C., Posner, M., Curl, W. W., Feagin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+tears+of+the+anterior+cruciate+ligament:+over+30+year+follow-up+of+patients+treated+with+arthrotomy+and+primary+repair.">Isolated tears of the anterior cruciate ligament: over 30 year follow-up of patients treated with arthrotomy and primary repair.</a> Am J Sports Med. 37 (1), 65-71 (2009).</li><li>Liljedahl, S. O., Lindvall, N., Wetterfors, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+diagnosis+and+treatment+of+acute+ruptures+of+the+anterior+cruciate+ligament:+a+clinical+and+arthrographic+study+of+forty-eight+cases.">Early diagnosis and treatment of acute ruptures of the anterior cruciate ligament: a clinical and arthrographic study of forty-eight cases.</a> J Bone Joint Surg Am. 47, 1503-1513 (1965).</li><li>Oensten, M., Lysholdm, J., Gillquist, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suture+of+fresh+ruptures+of+the+anterior+cruciate+ligament:+A+5+year+follow+up.">Suture of fresh ruptures of the anterior cruciate ligament: A 5 year follow up.</a> Acta Orthop Scan. 55, 270 (1984).</li><li>Buckley, S. L., Barrack, R. L., Alexander, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+history+of+conservatively+treated+partial+anterior+cruciate+ligament+tears.">The natural history of conservatively treated partial anterior cruciate ligament tears.</a> Am J Sports Med. 17 (2), 221-225 (1989).</li><li>Noyes, F. R., Mooar, L. A., Moorman, C. T., McGinnis, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+tears+of+the+anterior+cruciate+ligament.+Progression+to+complete+ligament+deficiency.">Partial tears of the anterior cruciate ligament. Progression to complete ligament deficiency.</a> J Bone Joint Surg Br. 71 (5), 825-833 (1989).</li><li>Bak, K., Scavenius, M., Hansen, S., Norring, K., Jensen, K. H., Jorgensen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+partial+rupture+of+the+anterior+cruciate+ligament.+Long+term+followup+of+56+cases.">Isolated partial rupture of the anterior cruciate ligament. Long term followup of 56 cases.</a> Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 5 (2), 66-71 (1997).</li><li>Fritschy, D., Panoussopoulos, A., Wallensten, R., Peter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+predict+the+outcome+of+a+partial+rupture+of+the+anterior+cruciate+ligament?+A+prospective+study+of+43+cases.">Can we predict the outcome of a partial rupture of the anterior cruciate ligament? A prospective study of 43 cases.</a> Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 5 (1), 2-5 (1997).</li><li>Sommerlath, K., Odensten, M., Lysholm, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+late+course+of+acute+partial+anterior+cruciate+ligament+tears.+A+nine+to+15+year+follow-up+evaluation.">The late course of acute partial anterior cruciate ligament tears. A nine to 15 year follow-up evaluation.</a> Clin Orthop. , 281-2152 (1992).</li><li>Barrack, R. L., Buckley, S. L., Bruckner, J. D., Kneisl, J. S., Alexander, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+versus+complete+acute+anterior+cruciate+ligament+tears:+the+results+of+nonoperative+treatment.">Partial versus complete acute anterior cruciate ligament tears: the results of nonoperative treatment.</a> J Bone Joint Surg Br. 72 (4), 622-624 (1990).</li><li>Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+and+potential+of+primary+ACL+repair.">Current status and potential of primary ACL repair.</a> Clin Sports Med. 28 (1), 51-61 (2009).</li><li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+walled+carbon+nanotube+composites+for+bone+tissue+engineering.">Single walled carbon nanotube composites for bone tissue engineering.</a> J Orthop Res. 9, 1374-1381 (2013).</li><li>Fruensgaard, S., Johannsen, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incomplete+ruptures+of+the+anterior+cruciate+ligament.">Incomplete ruptures of the anterior cruciate ligament.</a> J Bone Joint Surg Br. 71, 526-530 (1989).</li><li>Sandberg, R., Balkfors, B., Nilsson, B., Westlin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operative+versus+non-operative+treatment+of+recent+injuries+to+the+ligaments+of+the+knee.+A+prospective+randomized+study.">Operative versus non-operative treatment of recent injuries to the ligaments of the knee. A prospective randomized study.</a> J Bone Joint Surg Am. 69, 1120-1126 (1987).</li><li>Lamar, D. S., Bartolozzi, A. R., Freedman, K. B., Nagda, S. H., Fawcett, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+modification+of+partial+tears+of+the+anterior+cruciate+ligament.">Thermal modification of partial tears of the anterior cruciate ligament.</a> Arthroscopy. 21 (7), 809-814 (2005).</li><li>Indelli, P. F., Dillingham, M. F., Fanton, G. S., Schurman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monopolar+thermal+treatment+of+symptomatic+anterior+cruciate+ligament+instability.">Monopolar thermal treatment of symptomatic anterior cruciate ligament instability.</a> Clin Orthop. 407, 138-147 (2003).</li><li>Smith, D. B., Carter, T. R., Johnson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+failure+rate+for+electrothermal+shrinkage+of+the+lax+anterior+cruciate+ligament:+a+multicenter+follow-up+past+2+years.">High failure rate for electrothermal shrinkage of the lax anterior cruciate ligament: a multicenter follow-up past 2 years.</a> Arthroscopy. 24 (6), 637-641 (2008).</li><li>Buda, R., Ferruzzi, A., Vannini, F., Zambelli, L., Di Caprio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmentation+technique+with+semitendinosus+and+gracilis+tendons+in+chronic+partial+lesions+of+the+ACL:+clinical+and+arthrometric+analysis.">Augmentation technique with semitendinosus and gracilis tendons in chronic partial lesions of the ACL: clinical and arthrometric analysis.</a> Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 14 (11), 1101-1107 (2006).</li><li>Sekiya, J. K., Golladay, G. J., Wojtys, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autodigestion+of+a+hamstring+anterior+cruciate+ligament+autograft+following+thermal+shrinkage:+a+case+report+and+sentinel+of+concern.">Autodigestion of a hamstring anterior cruciate ligament autograft following thermal shrinkage: a case report and sentinel of concern.</a> J Bone Joint Surg Am. 82 (10), 1454-1457 (2000).</li><li>Farquharson-Roberts, M. A., Osborne, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+rupture+of+the+anterior+cruciate+ligament+of+the+knee.">Partial rupture of the anterior cruciate ligament of the knee.</a> J Bone Joint Surg Br. 65, 32-34 (1983).</li><li>Rue, J. P., Ghodadra, N., Bach, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femoral+tunnel+placement+in+single-bundle+anterior+cruciate+ligament+reconstruction:+a+cadaveric+study+relating+transtibial+lateralized+femoral+tunnel+position+to+the+anteromedial+and+posterolateral+bundle+femoral+origins+of+the+anterior+cruciate+ligament.">Femoral tunnel placement in single-bundle anterior cruciate ligament reconstruction: a cadaveric study relating transtibial lateralized femoral tunnel position to the anteromedial and posterolateral bundle femoral origins of the anterior cruciate ligament.</a> Am J Sports Med. 36, 73-79 (2008).</li><li>Carey, J. L., Dunn, W. R., Dahm, D. L., Zege, S. L., Spindler, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+with+autograft+compared+with+allograft.">A systematic review of anterior cruciate ligament reconstruction with autograft compared with allograft.</a> J Bone Joint Surg. 91, 2242-2450 (2009).</li><li>Murray, M. M., Martin, S. D., Martin, T. L., Spector, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+changes+in+the+human+anterior+cruciate+ligament+after+rupture.">Histological changes in the human anterior cruciate ligament after rupture.</a> J Bone Joint Surg Am. 82, 1387-1397 (2000).</li><li>Andrish, J., Holmes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+synovial+fluid+on+fibroblasts+in+tissue+culture.">Effects of synovial fluid on fibroblasts in tissue culture.</a> Clin Orthop Relat Res. (138), 279-283 (1979).</li><li>Murray, M. M., Spindler, K. P., Ballard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+histologic+repair+in+a+central+wound+in+the+anterior+cruciate+ligamentwith+a+collagen-platelet-rich+plasma+scaffold.">Enhanced histologic repair in a central wound in the anterior cruciate ligamentwith a collagen-platelet-rich plasma scaffold.</a> J Orthop Res. 25, 1007-1017 (2007).</li><li>Carter, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+cruciate+ligament+thermal+shrinkage.">Anterior cruciate ligament thermal shrinkage.</a> Clin Sports Med. 21, 693-700 (2002).</li><li>Perry, J. J., Higgins, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+and+posterior+cruciate+ligament+rupture+after+thermal+treatment.">Anterior and posterior cruciate ligament rupture after thermal treatment.</a> Arthroscopy. 16, 732-736 (2000).</li><li>Cheng, M. T., Yang, H. W., Chen, T. H., Lee, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+multipotent+stem+cells+from+human+cruciate+ligaments.">Isolation and characterization of multipotent stem cells from human cruciate ligaments.</a> Cell Prolif. 42 (4), 448-460 (2009).</li><li>Matsumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+anterior+cruciate+ligament-derived+vascular+stem+cells.">Isolation and characterization of human anterior cruciate ligament-derived vascular stem cells.</a> Stem Cells Dev. 21 (6), 859-872 (2012).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

המטרה העיקרית של מחקר פיגום hACL/2D זה הייתה להשתמש בתאים שהתקבלו בתיקון כדי להגדיל את התיקון עיקרי של דמעות ACL חלקיות. ניהול שמרני של דמעות ACL חלקיות עשוי לכלול תקופה קצרה של חוסר תנועה, מחזק אותו, תכנית שיקום מתקדמת, והערכות מעקב קבועות 13,16,17. עם זאת, מחקרים רבים מרא...

הרצועות הצולבות הקדמית (ACL) היא רצועת התוך מפרקים נפוצות נפצעה בברך. כ 200,000 פציעות (ACL) מדווחות מדי שנה בארצות הברית. מעל 75% מהחולים חווים opt פציעת ACL לניתוח שחזור אורתופדי 1,2,3,4. התערבות כירורגית היא לעתים קרובות הצביעה בשל פוטנציאל ריפוי לקוי מיסודו 3. שחזור ACL נעשה בדרך כלל באמצעות autograft או גיד של שתל. Autograft ושתל מייצגים את תקן הזהב לשיקום כפי שהם מתגאים בשיעורי הצלחה גבוהים, ותיקון תפר ראשוני, אפשרות טיפול אחרת, הראה שיעורי כישלון של עד 94% 5,6,7. דמעות חלקיות של ACL מייצגות 10% ל28% מכל דמעות ACL 8. במחקר פרוספקטיבי, נויס ואח&#39;. ההערכה היא כי 50% מהחולים עם דמעות חלקיות משפיעים על יותר ממחצית ACL התקדמו כדי להשלים ספיקת ACL לאחר איטיפול אופרטיבי 9. מחקרים אחרים מדווחים על חוסר יציבות מתמשכת וירידה בתפקוד עם פחות מ 30% מהחולים יוכלו לחזור ל9,10,11,12,13 רמת פעילות שלפני פציעתם. אפשרויות טיפול מוגבלות וכוללות שיטות שמרניות, הצטמקות תרמית של ACL שנותר, או שחזור ACL. לאחרונה, יש כבר עלה עניין בתיקון עיקרי מתוגבר. טכניקות אלה להשתמש ביולוגיים כדי לשפר את תיקוני תפר עיקריים 14. מחקר שנערך לאחרונה ניסה לקצור hACL כמו mesenchymal נגזר בתאי גזע כדי לעקוף מגבלות שתל, 31,32 אבל התוקף והיעילות של תאים אלה עדיין אינם ידועים. נראה מקור התא האידיאלי עבור יישומי הנדסת רקמות להיות בלתי mesechymal hACL נגזר תאי פיברובלסטים. מחקר הנוכחי התמקד בזיהוי חומר מטריצה ​​מתאים ומקור תא לפיגום המהונדס. זה הליך סטנדרטי עבור ACL קרוע להיות מושלך כמו suפסולת rgical במהלך ניתוח שחזור, לעומת זאת, רצועה פגום עשויה להיות מקור באיכות לרכישת התאים הדרושים כדי לפתח ולשפר את רקמה מהונדסת אידיאלית החלפת ACL. המעבדה שלנו פיתחה פרוטוקול להרחבה במבחנה של תאי hACL נקטפו אלה נגזרים. שימוש במטריצת 2D מהונדס רווי תאי hACL נגזרים, עיצבנו תיקון שעלול להגדיל את תיקון ACL חלקי ולחזק את הרצועות קרועות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1004px;" width="1003">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:139px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:507px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri-dish</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">08-757-103C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Collagenase</td>
			<td style="width:139px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">17018-029</td>
			<td>Store at 40C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:139px;">Cellgro</td>
			<td style="width:143px;">10-092-CV</td>
			<td>Store at 40C. Warm in 370C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:139px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">10082</td>
			<td>Store at -800C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:139px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">17-602E</td>
			<td>Store at 40C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge Tubes- 15 ml</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T-25 flasks</td>
			<td style="width:139px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:143px;">3013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Trypsin-Versene mixture</td>
			<td style="width:139px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">17-161E</td>
			<td>Store at 40C. Warm in 370C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BP231-100</td>
			<td>Combustible liquid. Can cause skin, eye and respiratory tract irritation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cryogenic vials</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">430489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">PLAGA</td>
			<td style="width:139px;">Purac Biomaterials</td>
			<td style="width:143px;">Purasorb PLG8523</td>
			<td>Store at -800C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TCPS disks</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">12-545-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Dichloromethane</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">AC36423-0010</td>
			<td>Possible cancer hazard. Store in a dry, cool place.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Bytac paper</td>
			<td style="width:139px;">Saint gobin performance plastics</td>
			<td style="width:143px;">1420652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scintillation vial</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-21G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">A7906</td>
			<td>Store at 40C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:216px;">mouse Anti-&#946;-actin antibody (10 Ab)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">A5441</td>
			<td>Store at -200C</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:216px;">goat-anti-mouse antibody (20 Ab)</td>
			<td style="width:139px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:143px;">4408</td>
			<td>Store at -200C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Hoechst dye</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">14530</td>
			<td>Store at -200C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">BP2547-1</td>
			<td>Toxic by inhalation and if swallowed. Causes burns by all exposure routes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hexamethyldisilazane</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">AC43085-1000</td>
			<td>Flammable liquid and vapor. Causes burns by all exposure routes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile Scissors</td>
			<td style="width:139px;">McKesson</td>
			<td style="width:143px;">25-716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:139px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:143px;">5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Light Microscope</td>
			<td style="width:139px;">Olympus</td>
			<td style="width:143px;">CK40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Water Bath</td>
			<td style="width:139px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:143px;">2845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vortex</td>
			<td style="width:139px;">Labnet&#160;</td>
			<td style="width:143px;">VX-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Petri plates</td>
			<td style="width:139px;">fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">S31473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acu-Punch</td>
			<td style="width:139px;">Acuderm Inc.</td>
			<td style="width:143px;">P1225</td>
			<td>Acu-Punch was used to cut 12mm disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cacodylate buffer</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">97068</td>
			<td>Flammable liquid, carcinogen and irritant.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Osmium tetraoxide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">201030</td>
			<td>Highly toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">T8787</td>
			<td>Harmful if swallowed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:139px;">Decon Labs</td>
			<td style="width:143px;">2705</td>
			<td>Keep away from heat, sparks, flame and other form of ignition.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">General/regional Anesthesia</td>
			<td style="width:139px;">Amphastar pharmaceuticals</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>1% Lidocaine, 0.25% Bupivacaine,Anesthetic agents for induction and maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:139px;">Hospira</td>
			<td>0409-0805-01</td>
			<td>Ancef 1g i.v.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Arthroscopy trocar</td>
			<td style="width:139px;">Smith and Nephew</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Arthroscopy Camera</td>
			<td style="width:139px;">Smith and Nephew</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Arthroscopic grasper and bitter</td>
			<td style="width:139px;">Arthrex&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4.5mm shaver</td>
			<td style="width:139px;">Arthrex&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Interference Screws</td>
			<td style="width:139px;">Arthrex&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>stainless steel screws</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sputter Coater</td>
			<td style="width:139px;">Polaron</td>
			<td style="width:143px;">E5400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical retrieval, isolation and in vitro expansion of human anterior cruciate ligament-derived cells for tissue engineering applications

הפגיעה ACL היא בעיה בדרך נתקלה באנשים פעילים. אפילו דמעות חלקיות של רצועה בברך להוביל תוך מפרק זה לליקויים ביומכניים הפוגעים בתפקוד ויציבות. אפשרויות הנוכחיות לטיפול בדמעות ACL החלקיים נעות בין ניהול שמרני, שמרני לאפשרויות כירורגיות מרובות, כגון: שינוי תרמי, תיקון יחיד צרור, שחזור מלא, ובנייה מחדש של החלק הפגום של רצועת הילידים. מחקרים מעטים, אם בכלל, הוכיחו בכל שיטה יחידה עבור ניהול להיות מעולה באופן עקבי, ובמקרים רבים חולים ממשיכים להפגין חוסר יציבות מתמשכת ומחלות רקע אחרות. מטרתו של מחקר זה היא לזהות מקור תא פוטנציאל לניצול בפיתוח של תיקון רקמות מהונדסות שיכול להיות מיושם בתיקון של ACL קרוע באופן חלקי. פרוטוקול רומן פותח להרחבת התאים שמקורם patieלילות עוברים שחזור ACL. כדי לבודד את התאים, רקמות hACL טחונות שהושגו במהלך שחזור ACL היו מתעכל בפתרון Collagenase. הרחבה בוצעה באמצעות מדיום DMEM/F12 תוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S). התאים אוחסנו לאחר מכן ב-80 º C או בחנקן נוזלי בהקפאה בינונית בהיקף של DMSO, FBS ובינוני ההתרחבות. לאחר הפשרה, תאי hACL נגזרים היו אז זורעים על פיגום רקמה מהונדסת, PLAGA (לקטית, חומצה גליקולית שיתוף פולי) וקלקר תרבות רקמות שליטה (TCPS). לאחר 7 ימים, SEM בוצע כדי להשוות הידבקות סלולרית לPLAGA לעומת TCPS השליטה. מורפולוגיה תאית הוערכה באמצעות מכתים immunofluorescence. SEM micrographs (סריקת אלקטרונים מיקרוסקופ), הוכיח כי תאים גדלו ודבק בשני משטחי PLAGA וTCPS והיו מחוברות על פני כל המשטחים ביום 7. מכתים Immunofluorescence הראה מורפולוגיים רגיל, שאינו לחוץדפוסי אל על שני המשטחים. טכניקה זו מבטיחה עבור יישומים בהתחדשות ACL ובנייה מחדש.

מודל העבודה לאחזור כירורגית, עיכול רקמה ובידוד של הקדמית הצולבת הרצועה האנושית (hACL) תאי שמקורם מוצג באיור 1. התאים הגרו מexplants ודבקו בחולצת 25 צלוחיות. תאים אלה היו בתרבית במשך 3 ימים ולאחר מכן היו דמיינו תחת מיקרוסקופ אור (איור 2). Monolayer מחוברות הושג ביו?...

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications at JoVE.com

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

עבור יישומים עתידיים כתיקון כדי לתקן דמעות חלקיות של הקדמית הצולבת הרצועה (ACL), תאי שמקורם ACL האנושי בודדו מרקמות שהושגו במהלך הליכים שיקומיים, הרחיבו במבחנה וגדלו על פיגומי רקמה מהונדסת. הידבקות ומורפולוגיה תאיות הייתה אז מבוצעים כדי לאשר התאמה ביולוגית על פני פיגום.

אחזור כירורגי, בידוד ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הרחבת תאים הצולבות קדמי אדם נגזרים רצועה עבור יישומי הנדסת רקמות

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

surgical-retrieval-isolation-vitro-expansion-human-anterior-cruciate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

11.4K Views.  Southern Illinois University School of Medicine.  עבור יישומים עתידיים כתיקון כדי לתקן דמעות חלקיות של הקדמית הצולבת הרצועה (ACL), תאי שמקורם ACL האנושי בודדו מרקמות שהושגו במהלך הליכים שיקומיים, הרחיבו במבחנה וגדלו על פיגומי רקמה מהונדסת. הידבקות ומורפולוגיה תאיות הייתה אז מבוצעים כדי ...

Video: Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

הנדסת רקמות של 3D אדם<em&gt; במבחנה</emמערכת מבחן גידול&gt;

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

Athymic עכברוש מודל להערכת הנדסי קדמי צולב גידים שתלי

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

יישומים של<em&gt; In vivo</em&gt; בדיקות פונקציונליות של עכברוש השוקה הקדמי להערכת רקמות מהונדסות תיקון שרירי שלד

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

להמיס Electrospinning הכתיבה של פיגומים Poly(ε-caprolactone) תלת מימדי עם מורפולוגיות לשליטה עבור יישומי הנדסת רקמות

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

בידוד של גזע Mesenchymal מן האדם קרום העצם מכתשיים ואפקטים של ויטמין D על פעילות Osteogenic של תאים נגזר קרום העצם

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

שתי שיטות Decellularization של רקמות הצמח ליישומים הנדסת רקמות

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is required. However, cell culture using xenogenic or allogenic culture media has some disadvantages (i.e., risk of infectious agent transmission or slow cell expansion). Here, an autologous culture system is developed for the expansion of human skin fibroblast cells in vitro using a patient&#8217;s own platelet-rich plasma (PRP). Human dermal fibroblasts are isolated from the patient while undergoing abdominoplasty. Cultures are followed for up to 7 days using a medium supplemented with either fetal bovine serum (FBS) or PRP. Blood cell content in PRP preparations, proliferation, and fibroblast differentiation are assessed. This protocol describes the method for obtaining a standardized, non-activated preparation of PRP using a dedicated medical device. The preparation requires only a medical device (CuteCell-PRP) and centrifuge. This device is suitable under sufficient medical practice conditions and is a one-step, apyrogenic, and sterile closed system that requires a single, soft spin centrifugation of 1,500 x g for 5 min. After centrifugation, the blood components are separated, and the platelet-rich plasma is easily collected. This device allows a quick, consistent, and standardized preparation of PRP that can be used as a cell culture supplement for in vitro expansion of human cells. The PRP obtained here contains a 1.5-fold platelet concentration compared to whole blood together, with a preferential removal of red and white blood cells. It is shown that PRP presents a boosting effect in cell proliferation compared to FBS (7.7x) and that fibroblasts are activated upon PRP treatment.

This protocol presents a device that produces PRP to boost the in vitro expansion of cells in a 100% autologous fibroblast culture system.

ייצור פלזמה אוטולוגית עשירה בטסיות דם להגברת הרחבת פיברובלסטים אנושיים במבחנה

There is currently great clinical interest in the use of autologous fibroblasts for skin repair. In most cases, culture of skin cells in vitro is ...

Anterior Segment Organ Culture Platform for Tracking Open Globe Injuries and Therapeutic Performance

Open globe injuries have poor visual outcomes, often resulting in permanent loss of vision. This is partly due to an extended delay between injury and medical intervention in rural environments and military medicine applications where ophthalmic care is not readily available. Untreated injuries are susceptible to infection after the eye has lost its watertight seal, as well as loss of tissue viability due to intraocular hypotension. Therapeutics to temporarily seal open globe injuries, if properly developed, may be able to restore intraocular pressure and prevent infection until proper ophthalmic care is possible. To facilitate product development, detailed here is the use of an anterior segment organ culture open globe injury platform for tracking therapeutic performance for at least 72 h post-injury. Porcine anterior segment tissue can be maintained in custom-designed organ culture dishes and held at physiological intraocular pressure. Puncture injuries can be created with a pneumatic-powered system capable of generating injury sizes up to 4.5 mm in diameter, similar to military-relevant injury sizes. Loss of intraocular pressure can be observed for 72 h post-injury confirming proper injury induction and loss of the eye&#39;s watertight seal. Therapeutic performance can be tracked by application to the eye after injury induction and then tracking intraocular pressure for multiple days. Further, the anterior segment injury model is applicable to widely used methods for functionally and biologically tracking anterior segment physiology, such as assessing transparency, ocular mechanics, corneal epithelium health, and tissue viability. Overall, the method described here is a necessary next step toward developing biomaterial therapeutics for temporarily sealing open globe injuries when ophthalmic care is not readily available.

Open globe eye injuries may go untreated for multiple days in rural or military-relevant scenarios, resulting in blindness. Therapeutics are needed to minimize loss of vision. Here, we detail an organ culture open globe injury model. With this model, potential therapeutics for stabilizing these injuries can be properly evaluated.

פלטפורמת תרבות איברים מגזריי חיצוני למעקב אחר פציעות גלובוס פתוח וביצועים טיפוליים

Open globe injuries have poor visual outcomes, often resulting in permanent loss of vision. This is partly due to an extended delay between injury and ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

פיברובלסט נגזר רקמת חיבור מהונדסת אנושית עבור יישומי הקרנה

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...