עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי מענק מחקר מהשילוב הלאומי בית ספר מחקר ההולנדי, קטליזה בשליטה כימית עיצוב (NRSC-קטליזה). ד&quot;ר HY Steensma וד&quot;ר GPH ואן Heusden מאוניברסיטת ליידן, מקבלים הכרה על תמיכתם בביטוי רקומביננטי של ס &#39; cerevisiae Nar1.

1. הכנת תוכנית ההתקנה ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מאגר המכיל 100 מ&quot;מ טריס, גליצרול 250 מ&quot;מ NaCl ו- 10% ב- pH 8.5. Deaerate החיץ על ידי שטיפה עם ארגון. להציג את החיץ לתא אנאירובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את החיץ בשתי מנות. לחלק אחד (חיץ) להוסיף 1 מ&quot;מ DL-dithiothreitol (DTT, M r 154.25 g / mol) ו- L-ציסטאין 1 מ&quot;מ. החלק האחר (חיץ B) אינו מכיל צמצום סוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות חמצון וreductant. הפוך את פתרונות 1 מיליליטר של 2, 20, ו -200 ferricyanide אשלגן מ&quot;מ (FIC, M r 329.26 g / mol) ושל dithionite נתרן (SD, M r 174.11 g / mol) בB. חיץ אנאירובי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת מתווך כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 160 מיקרומטר של כל אחד ממתווכי חיזור הבאים ו -50 מ&quot;מ NaCl למאגר ב &#39;: N, N, N&#39;, N &#39;-p-phenylendediamine -tetramethyl (TMPD, M r 237.17 g / mol, 0 0.276 V &quot;E) , Indophenol 2,6-dichlorophenol(DCIP, M r 290.08 g / mol, E &#39;0 0.217 V), ethosulphate phenazine (PES, M r 334.4 g / mol, E&#39; 0 0.055 V), מתילן כחול (r M 319.85 g / mol, E &#39; 0 0.011 V), Resorufin (235.17 g / mol, E r M &#39;0 -.051 V), Indigodisulphonate (466.35 g / mol, r M E&#39; 0 -.125 V), 2-1,4-naphtaquinone הידרוקסי ( r M 174.15 g / mol, &#39;0 -.145 V), anthraquinone-2-sulfonate (r M 328.28 g / mol, E&#39; E 0 -.225 V), Phenosafranin (r 322.8 g / mol M, E &#39;0 -.252 V), Safranin O (r M 350.84 g / mol, E &#39;0 -.280 V), אדום ניטראלי (r M 288.8 g / mol, E&#39; 0 -.340 V), viologen נזיל (r 409.4 g / mol M, E &#39;0 -.350 V), וviologen מתיל (M r 257.16 g / mol, E&#39; 0 -.440 V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף את הבקבוק בנייר אלומיניום כדי להגן המתווךים מהאור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו 10 מ&quot;ג / מיליליטר S. חלבון cerevisiae מתויג סטרפטוקוקוס Nar1 (181 מיקרומטר, M r 55.2 KDA) בא חיץ Express S. cerevisiae Nar1 בE. coli כחלבון מתויג סטרפטוקוקוס באמצעות וקטור ביטוי pET24A. לטהר את החלבון בתא אנאירובי באמצעות מדיה כרומטוגרפיה דלקת-tactin (רשות השידור) ולטהר באמצעות מערכת טיהור חלבון כמו מטהר תקטע (GE Healthcare). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התקנת טיטרציה חיזור בתא אנאירובי כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר אלקטרודה התייחסות Ag / AgCl ואלקטרודה חוט פלטינה לכלי שיט טיטרציה. חבר את שני אלקטרודות למד מתח שיכול למדוד מmV עד V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס בר ערבוב קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את כלי טיטרציה מעל stirrer מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את כלי טיטרציה עם הצפת B, פתרון תערובת מתווך ופתרון חלבון לעד 2 מיליליטר, כלומר לריכוזים סופיים של חלבון 72 מיקרומטר ו -38 מיקרומטר של כלמתווך. הערה: תלוי בריכוז החלבון והמתווך נדרש ריכוזי הסכומים של שלושה הפתרונות צריכים להיות מותאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים למשך 30 דקות ולעבור על מד המתח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 צינורות EPR זכוכית קוורץ נקיים. להציג את הצינורות בתא אנאירובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא דיואר חנקן נוזלי קטן (בסביבות 200 מיליליטר) עם חנקן נוזלי. </li></ol> .2 בצע החיזור טיטרציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה עד שהפוטנציאל של הפתרון הוא יציב. הערה: בפועל זה אומר שהפוטנציאל נסחפים mV פחות מ 1 לדקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את הפוטנציאל שניתן על ידי מד המתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את הדוגמא הראשונה של 200 μl ולהזריק לתוך צינור EPR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שווי הצינור עם פקק גומי ולהסיר את הצינור מחדר אנאירובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את הצינור בחנקן נוזלי באופן הבא: שים לב! זה צריך להיעשות לאט, אחרת הצינור ישבור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשון להכניס את tip של הצינור בחנקן הנוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה עד שניתן לשמוע קול שריקה. הערה: הפעולה זו עשויה להימשך עד 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להכניס את שאר הצינורית כך שחלק המדגם הוא שקוע באופן מלא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף aliquot 1-2 μl קטן של פתרון 2 מ&quot;מ SD לפתרון בכלי טיטרציה להנמיך את הפוטנציאל של הפתרון ל-0.6 V. הערה: אם יותר מ -10 μl יש להוסיף, לעבור לפתרון מ&quot;מ 20. כפי שקשה מאוד לשמור על שווי משקל לערך פוטנציאלי ספציפי, הערכים בפועל נרשמו על מד המתח כתובים למטה ומשמשים לבניית עקומת טיטרציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר מדגם כמתואר בשלב 2.3-2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את הפוטנציאל האמיתי שניתן על ידי מד המתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף חמצון עד פוטנציאלי גדל בסביבות 50 mV. התחל על ידי הוספת aliquot 1-2 μl קטן של פתרון 2 מ&quot;מ FIC. אם יותר מ -10 μl יש להוסיף, לעבור לפתרון מ&quot;מ 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום הוw הרבה של הפתרונות נוספו לו. הערה: זה הכרחי כדי לתקן את דילול מדגם במהלך טיטרציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר מדגם כפי שמתואר ב2.3-2.5 הצעדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את הפוטנציאל האמיתי שניתן על ידי מד המתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.9 ועד 2.12 הטווח הפוטנציאלי מ-0.6 V ל0.2 V כבר מכוסה וכל 10 צינורות EPR מלאים כל אחד עם 200 μl. הערה: כנפח עם כל נסיגה מצטמצם המיצוב של אלקטרודות עשוי צריך להיות מותאם במגע טוב עם הפתרון ללא התערבות של ערבוב. זה עלול להיות קשה למדוד את הפוטנציאל לאחר נסיגה של המדגם האחרון ולכן הפוטנציאל של מדגם שעשוי להיות פחות מדויק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לאחסן דגימות EPR קפואות בחנקן נוזלי עד מדידות EPR יכולות להתקיים. </li></ol> 3. דוגמאות כותרות למדוד בעזרת EPR ספקטרוסקופיה וניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא EPR ספקטרום של שונהדגימות טיטרציה כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במשאבת ואקום גבוה לפנות cryostat קוורץ ל&lt; 10 -5 בר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור על קירור המים של מגנט EPR. פתח את הזרימה של אוויר היבש דרך חלל EPR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את אספקת החשמל למגנט והמחשב של EPR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל תכנית כיול. הגדר את הפרמטרים המדידה EPR. חבר את cryostat לדיואר הליום הנוזלי. לקרר את החלל ל9-16 ק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג מדגם EPR בחלל. רשום את ספקטרום EPR. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות את מין EPR שונה ולהשתמש בספקטרום הטוב ביותר לכמת את האותות. להשיג כימות EPR על ידי שילוב כפול של הספקטרום והשוואה עם הספקטרום של נחושת חיצונית פתרון סטנדרטי 10 מ&quot;מ CuSO 4/10 מ&quot;מ HCl / 2 M 4 NaClO. 8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את עקומת טיטרציה כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה משרעת אות EPR בg-ערך שאופייני לסעיףמינים מגנטיים של עניין נגד את הפוטנציאל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את קנה המידה משרעת אות EPR לספינים / קנה מידה מולקולה באמצעות כימות EPR מהשלב 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את משרעת האות של כל דגימה לדילול שחל עקב התוספות של חמצון או צמצום סוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את פוטנציאל פוטנציאל נקודת האמצע של האלקטרודה התייחסות Ag / AgCl. הערה: אלקטרודת Ag / AgCl ההתייחסות (עם KCl הרווי) יש פוטנציאל נקודת אמצע של 0.194 V לעומת אלקטרודה המימן רגילה (היא) של 25 מעלות צלזיוס. לכן, אם האפשרי על מד המתח קורא בסביבות -0.6 V, הפוטנציאל תוך התייחסות להוא -0.4 V. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את האות למשוואת נרנסט כדלקמן: למינים שהם פאראמגנטיים במדינה המופחתת: <img alt="משוואת 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq1.jpg" width="200" /> למינים שהם פאראמגנטיים בoמדינת xidized: <img alt="משוואה 2" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq2.jpg" width="200" /> למינים שהם פאראמגנטיים במצב ביניים: <img alt="משוואה 3" fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq3.jpg" width="220" /> משוואות אלה תקפות לתגובות חמצון-חיזור שבו אלקטרון אחד מועבר, כך n = 1. E = פוטנציאל בוולט מ &#39;E = פוטנציאל נקודת אמצע בוולט F = פאראדיי קבוע = 96480 C · mol -1 R = הקבוע = 8.314 J גז · K -1 · mol -1 T = הטמפרטורה בקלווין </li></ol>

<ol>
	<li>Lippard, S. J., Berg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Bioinorganic Chemistry. , (1994).</li><li>Bertini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioinorganic Chemistry. , 611 (1994).</li><li>Leger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+Electrokinetics:+Using+Protein+Film+Voltammetry+To+Investigate+Redox+Enzymes+and+Their+Mechanisms.">Enzyme Electrokinetics: Using Protein Film Voltammetry To Investigate Redox Enzymes and Their Mechanisms.</a> Biochemistry. 42, 8653-8662 (2003).</li><li>Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Electron+Transfer+of+Redox+Proteins+at+the+Bare+Glassy+Carbon+Electrode.">Direct Electron Transfer of Redox Proteins at the Bare Glassy Carbon Electrode.</a> Eur. J. Biochem. 182, 523-530 (1989).</li><li>Pierik, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+Properties+of+the+Iron-Sulfur+Clusters+in+Activated+Fe-Hydrogenase+from+Desulfovibrio+vulgaris+(Hildenborough).">Redox Properties of the Iron-Sulfur Clusters in Activated Fe-Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough).</a> Eur. J. Biochem. 209, 63-72 (1992).</li><li>Balk, J., Pierik, A. J., Netz, D. J., Muhlenhoff, U., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hydrogenase-like+Nar1p+is+Essential+for+Maturation+of+Cytosolic+and+Nuclear+Iron-Sulphur+Proteins.">The Hydrogenase-like Nar1p is Essential for Maturation of Cytosolic and Nuclear Iron-Sulphur Proteins.</a> EMBO J. 23, 2105-2115 (2004).</li><li>Sharma, A. K., Pallesen, L. J., Spang, R. J., Walden, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+Iron-Sulfur+Cluster+Assembly+(CIA)+System:+Factors,+Mechanism,+and+Relevance+to+Cellular+Iron+Regulation.">Cytosolic Iron-Sulfur Cluster Assembly (CIA) System: Factors, Mechanism, and Relevance to Cellular Iron Regulation.</a> J. Biol. Chem. 285, 26745-26751 (2010).</li><li>Aasa, R., V&#228;nng&#229;rd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+Signal+Intensity+and+Powder+Shapes.">EPR Signal Intensity and Powder Shapes.</a> A Reexamination. J. Magn. Reson. 19, 308-315 (1975).</li><li>Balk, J., Pierik, A. J. A., Netz, ., J, D., M&#252;hlenhoff, U., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nar1p,+a+conserved+eukaryotic+protein+with+similarity+to+Fe-only+hydrogenases,+functions+in+cytosolic+iron-sulphur+protein+biogenesis.">Nar1p, a conserved eukaryotic protein with similarity to Fe-only hydrogenases, functions in cytosolic iron-sulphur protein biogenesis.</a> Biochem. Soc. Trans. 33, 86-89 (2005).</li><li>Hennessy, D. J., Reid, G. R., Smith, F. E., Thompson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferene+-+a+new+spectrophotometric+reagent+for+iron.">Ferene - a new spectrophotometric reagent for iron.</a> Can. J. Chem. 62, 721-724 (1984).</li><li>Flint, D. H., Emptage, M. H., Guest, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarase+A+from+Escherichia+coli:+purification+and+characterization+as+an+iron-sulfur+cluster+containing+enzyme.">Fumarase A from Escherichia coli: purification and characterization as an iron-sulfur cluster containing enzyme.</a> Biochemistry. 31, 10331-10337 (1992).</li><li>Hagedoorn, P. L., Driessen, M. C., Mvd Bosch, ., Landa, I., Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermophilic+Redox+Chemistry:+a+Re-evaluation.">Hyperthermophilic Redox Chemistry: a Re-evaluation.</a> FEBS Lett. 440, 311-314 (1998).</li><li>Tadesse, M. A., D'Annibale, A., Galli, C., Gentili, P., Sergi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+the+relative+contributions+of+redox+and+steric+issues+to+laccase+specificity+towards+putative+substrates.">An assessment of the relative contributions of redox and steric issues to laccase specificity towards putative substrates.</a> Organic &amp; biomolecular chemistry. 6, 868-878 (2008).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

הסדרה של 13 מתווכי חיזור מאפשרת שיווי משקל חיזור בפתרון בטווח של -.45 ל0.3 V לעומת SHE (טבלה 1 ואיור 3). ובכן מעל ומתחת פוטנציאלים אלה כל המתווכים הם גם צמצמו לחלוטין או מתחמצנים לחלוטין ולכן אין איזון נוסף עם המרכזים הפעילים חיזור של החלבון יכול להתרחש. זה רעיון חשוב...

מה שמדהים הוא התהליכים הכימיים הבסיסיים ביותר לקיום חיים על פני כדור הארץ, פוטוסינתזה, קיבעון ונשימה חנקן זה, הם זרזו ידי קומפלקסי חלבונים גדולים המכילים מגוון רחב של קו-פקטורי חיזור אורגניים ואי-אורגני. הערכה הוא כי כ -30% מכלל החלבונים מכילים קו-פקטורי מתכת אחד או יותר. 1,2 זיהוי ואפיון ניתן להקים הקו-פקטורי חיזור באמצעות אלקטרוכימיה הישירה (למשל, voltammetry סרט חלבון) או titrations חיזור. שתי הטכניקות הן משלימה בטבע ותחולתם. Voltammetry מציע נחישות מהירה של פוטנציאלי אמצע וקינטיקה העברת אלקטרונים של קו-פקטורים שיכולים להגיב עם משטח אלקטרודה. 3,4 בדרך כלל זה עובד היטב עבור חלבוני העברת אלקטרונים, כגון ציטוכרום C או ferredoxin. וזה לפעמים עובד לחלבונים מורכבים יותר, כי כבר משותקים למשטח אלקטרודה. ידע מפורט שלטבעו של קו-פקטורים בחלבון צריך להיות זמין, כvoltammogram לא נותן שום מידע ישיר על זהותו של הקו-הפקטור. titrations חיזור יותר מייגע לבצע ודורש כמויות מ&quot;ג של חלבון. עם זאת, הם מציעים מידע על פוטנציאל נקודת האמצע ואת זהותו של הקו-הפקטור. 5 כמו כן בטיטרציה אחד יכול להיות במעקב קו-פקטורים מרובים בחלבון. העיקרון של טיטרציה חיזור הוא שהחלבון הפעיל חיזור או האנזים מופחת או חמצון כימי. על מנת לוודא כי הקו-הפקטורים להגיב עם מתווכי חיזור reductant או חמצון משמשים. מתווכי חיזור אלה גם להגיב עם אלקטרודה, כך שהפוטנציאל של הפתרון ניתן למדוד. המתווכים לחצוץ חיזור ולאזן בין הקו-הפקטורים בחלבון ואת האלקטרודה. לאחר כימי poising הפוטנציאל לערך הרצוי, מדגם נמשך ובמהירות קפואה בחנקן נוזלי לAWAIT ניתוח נוסף עם טכניקות ספקטרוסקופיות. ספקטרוסקופיה EPR היא שימושית במיוחד בהקשר זה כפי שהוא יכול לשמש למדידת כמותית מרכזי מתכת פאראמגנטיים או רדיקלים אורגניים. טיטרציה חיזור יכולה להתבצע בשני כיוונים: מגבוה לנמוכה או גבוה מפוטנציאל של נקודת אמצע נמוך. הבחירה תלויה ביציבות של הקו-הפקטורים במחקר. לעתים קרובות זה חכם להתחיל בפוטנציאל נמוך ולהוסיף חמצון לשלבים להגדיל את הפוטנציאל. זה נקרא טיטרציה חמצוני, והוא מתואר כאן. כאן אנו מראים טיטרציה חיזור של אשכול ברזל-גופרית המכיל חלבון Nar1 מSaccharomyces cerevisiae. חלבון זה מעורב, ככל הנראה כחלבון פיגום, במכונות biosynthetic אשכול ברזל-גופרית cytosolic (מסלול CIA). 6,7

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reference electrode (Ag/AgCl)</td>
			<td style="width:101px;">Radiometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EPR spectrometer</td>
			<td style="width:101px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD) &#183;(HCl)2</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">637-01-4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">2,6-dichlorophenol indophenol (DCIP), sodium salt</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">620-45-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenazine ethosulfate (PES)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">10510-77-7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">122965-43-9</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resorufin, sodium salt</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">34994-50-8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Indigodisulfonate (indigo carmine)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">860-22-0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-hydroxy-1,4-naphtaquinone</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">83-72-7</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Anthraquinone-2-sulfonate Na+ H2O</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">153277-35-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenosafranin</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">81-93-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Safranin O</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">477-73-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neutral red</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">553-24-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzyl viologen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">1102-19-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methyl viologen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">1910-42-5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epr monitored redox titration of the cofactors of saccharomyces cerevisiae nar1

אלקטרונים פאראמגנטיים תהודה (EPR) במעקב titrations חיזור הוא שיטה רבת עוצמה כדי לקבוע את פוטנציאל נקודת האמצע של קו-פקטורים בחלבונים ולזהות ולכמת את הקו-הפקטורים במדינת חיזור לזיהוי. הטכניקה היא משלימה לאלקטרוכימיה הישירה (voltammetry) מתקרבת, כפי שהוא אינו מציע מידע על קצב העברת אלקטרון, אבל אין להקים את מדינת הזהות וחיזור של הקו-הפקטורים בחלבון הנחקר. הטכניקה היא נרחב החלים על כל חלבון המכיל קו-פקטור תהודה מגנטי אלקטרונית (EPR) לזיהוי. טיטרציה טיפוסית דורשת 2 מיליליטר חלבון עם ריכוז קו-פקטור בטווח של 1-100 מיקרומטר. החלבון הוא טיטרציה עם reductant כימי (dithionite נתרן) או חמצון (ferricyanide אשלגן) על מנת לשמור על שווי משקל המדגם בפוטנציאל מסוים. חוט פלטינה ואלקטרודה התייחסות Ag / AgCl מחוברים לוולטמטר כדי למדוד את הפוטנציאל של פתרון החלבון. סט של 13 מתווכי חיזור שונים משמש לאזן בין הקו-פקטורי חיזור של החלבון ואת האלקטרודות. מדגם הוצא בפוטנציאלים שונים וספקטרום אלקטרונים פאראמגנטיים תהודה, אופייניים לקו-פקטורי חיזור השונים בחלבון, נמדדים. העלילה של עוצמת האות לעומת פוטנציאל המדגם מנותחת באמצעות משוואת נרנסט על מנת לקבוע את פוטנציאל נקודת האמצע של הקו-הפקטור.

טיטרציה חיזור של אשכול ברזל-גופרית המכיל חלבון Nar1 מSaccharomyces cerevisiae גרמה לזיהויו של קו-פקטורים שונים שלוש: Nar1: אשכול [3Fe-4S], אשכול [4Fe-4S] ומרכז Fe mononuclear (איור 1) . אותות EPR מאופיינים על ידי g-הערכים שלהם: ל[ 3Fe-4S] + g z 2.01, 2.00 גר &#39;מוצלב (איור 1);</strong...

Watch this Scientific Journal Video about EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1 at JoVE.com

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR פיקוח חיזור טיטרציה של הקו-הפקטורים של<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

epr-monitored-redox-titration-cofactors-saccharomyces-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biology

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

13.4K Views.  Delft University of Technology. The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

Video: EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection של Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

ביטוי וטיהור של חלבון פיברוזיס פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור מוליכות ב Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

טיהור של חלבון הטרנסממברני מוליכות רגולטור סיסטיק פיברוזיס שבא לידי ביטוי ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

מדידת שיעורי ריקבון mRNA ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; שימוש ב<em&gt; Rpb1-1</em&gt; זנים

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.