עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות (074,696 NIGMS-) לKAM וחברה אמריקנית למיקרוביולוגיה מלגת רוברט ד &#39;ווטקינס סטודנט לתואר מחקר לJLA אנו מודים גם ג&#39;ון גלובר באוניברסיטת טורונטו למתן FFL מקור-GFP פלסמיד.

1. בנייה של זנים המכילים FFL-GFP פלסמיד במחקר זה, זן Saccharomyces cerevisiae BY4741 (MAT, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) שימש יחד עם מתח מחיקת HSP104 מאוסף נוקאאוט שמרים (הפתוח Biosystems / Thermo Scientific). המחיקה אושרה באמצעות נוגדן ספציפי לHsp104 ניתוח כתם מערבי. FFL-GFP בא לידי ביטוי מp426MET25-FFL-GFP, שנבנה ממקור פלסמיד מבוסס LEU2 התקבל מהמעבדה גלובר באוניברסיטת טורונטו 17 והשגה, על פי בקשה למחברים. הביטוי של חלבון היתוך פלסמיד FFL-GFP נשלט על ידי אמרגן מתיונין-repressible MET25. פלסמיד הפך לכל זן באמצעות פרוטוקול הותאם מGietz et. אל, 1995: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 25 מ&quot;ל O<html> f תאי שלב יומן בצינור חרוטי 50 מ&quot;ל ב 4,400 סל&quot;ד במשך 2 דקות, לשטוף עם 500 μl של מזוקק H הכפול 2 0 (DDH 2 O), וזורקים supernate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend ב 250 μl של TE / LiAc (טריס-HCl 10 מ&quot;מ, pH = 7.5, 1 mM EDTA, 0.1 אצטט ליתיום מ &#39;). לדגור על 30 מעלות צלזיוס, ללא ערבוב במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 50 μl של תאים מוסמכים לצינור חדש יחד עם 5 מ&quot;ל (50 מיקרוגרם) של ה-DNA ומנשא 5 μl (0.1-5 מיקרוגרם) של ה-DNA פלסמיד. הוסף 300 μl של PEG / TE / LiAc (אותו הדבר כמו פוליאתילן גליקול% TE / LiAc בתוספת 40) לתערובת זו, ותאים לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח 1/10 (V / V) DMSO (36 μl) לתערובת זו והלם חום על 42 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תערובת על 6,000 סל&quot;ד במשך 30 שניות ולהסיר supernate. Resuspend תאים ב100 μl של 2 0 תאים בצלחת DDH סטריליות על גבי מדיה שלמה סינטטי חסרות אורציל (SC-אורה). </li></ol> 2. אינדוקציה של FFL-GFP NT &quot;&gt; FFL-GFP הוא מושרה ברגע תאים נמצאים בשלב יומן כך שרוב החלבון לפני חום ההלם הוא עשה זה עתה, כדי למנוע חלבונים שהסתכמו סופני לאורך זמן עקב ליקויים הקשורים להזדקנות הסלולר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1: תאי דגירה ב5 מ&quot;ל של SC-URA ב 30 מעלות צלזיוס מסתובב O / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2: מדוד OD 600 ותרבויות טריות בלחסן 5 מ&quot;ל של SC-URA OD 600 ~ 0.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תרבויות עם סיבוב על 30 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים יומן השלב OD 600 ~ 0.8-1.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים ב15 צינורות חרוטי מ&quot;ל ב 4,400 סל&quot;ד במשך 3 דקות, למזוג supernate ו resuspend תא גלולה ב 500 μl של DDH 2 0; פתרון טרנספר לצינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב -6,000 סל&quot;ד וזורקים supernate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 5 מ&quot;ל של SC-URA-נפגש. תאים צריכים להיות מודגרות מסתובב באת המדיה עבור שעת 1 ב 30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגות וחזור על לשטוף בDDH 2 0 וזורקים supernate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspeתאי nd ב5 מ&quot;ל תקשורת SC-URA המכיל 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של cycloheximide לעכב ביטוי חלבון, ופנה מייד לשלב 3. </li></ol> 3. Assay שחזור FFL-GFP האנזימטית assay זה הוא גישה כמותית כדי לקבוע את רמות האנזים פעיל באוכלוסייה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה לassay זה: <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד OD 600 עבור כל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הסכום דרוש של D-luciferin צורך בהתבסס על מספר הדגימות ומספר החזרות בתוספת כ -1,200 μl לצינורות רצוי. ריכוז סופי של D-luciferin הוא ~ 23 מיקרוגרם לכל 100 μl של תאים. תחילה הוא מומס במים בריכוז פתרון מניות של 7.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ובדילול ל455 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בSC לפני הניסוי. באיור 2, שלוש משכפל עבור כל דגימה נבדקו וכתוצאה מכך הסכום כולל של 2.4 מ&quot;ל של D-luciferin בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכנית צלחת קורא לבזק לומיassay nescence (עיבוד &quot;Assay הארת פלאש עם הזרקה&quot; BioTek Gen5; למכשירים אחרים פעלו בהתאם להוראות יצרן) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר טמפרטורה עד 30 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר קורא צלחת להוסיף D-luciferin, לנער, ולקרוא היטב כל אחד בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא את הארה (נקודת סיום קריאה, 5 שניות זמן אינטגרציה, רמת רגישות 180) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור assay ההתאוששות בין כל קריאה לנער במשך 5 דקות, 20 דקות עיכוב, ולנער את 5 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 50 μl של D-luciferin ממזרק. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הארה מחממים ההלם נמדדה מייד לאחר הוספת תאים לתקשורת המכיל cycloheximide לעצור סינתזת חלבון. <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μl של תאים עבור כל דגימה עם מספר רצוי של משכפל לתוך צלחת 96 היטב מוצקה לבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרה צריכה לכלול ריק מים ותאים המכילים וקטור ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל לקרוא עם SPEcifications מפורט לעיל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפגל מחצית FFL של FFL-GFP, דגירה תרבות 5 מ&quot;ל בצינור זכוכית תרבות על 42 מעלות צלזיוס רעד במשך 25 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריאות הארה assay שחזור להתחיל מייד לאחר תאים יוסרו מן החממה, שהוא אפס נקודת זמן. מידת הארה זהה למתואר לעיל לנקודת הזמן הראשונה וכל 30 דקות במשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את הדגימות לערכי הארה-הלם מחממים שהותאמו על בסיס OD 600 (לחלק את הערכים מחממים-הלם על ידי OD 600). </li></ol> 4. מיקרוסקופ פלואורסצנטי assay זה הוא שיטה חצי כמותית כדי לקבוע solubilization של אגרגטים לאורך הזמן באוכלוסייה של תאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אינדוקציה היא אותו כפי שתואר בסעיף 2, שלבי 1-8 של פרוטוקולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אותן נקודות הזמן נלקחות כמתואר לעיל (סעיף 3, שלב 4), אבל למיקרופוןroscopy לאסוף 1 מ&quot;ל של תאים במחממים בהלם וכל נקודת זמן החלמה, ודגימות דגירה מסתובבות ב 30 מעלות צלזיוס בצינור התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ויזואליזציה: <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 1 מ&quot;ל של תאים ב 6000 סל&quot;ד במשך 30 שניות ולהסיר supernate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה ב2 μl של DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 2 μl של תאים בתוספת 2 μl של 2% הנמוך להמיס agarose בשקופית ולהוסיף להחליק את המכסה. על מנת לקבל מישור אחד של תאים לחצו קל את האצבע כלפי מטה במרכז להחליק את המכסה ולסובב עד להחליק את המכסה קשה לזוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הם דמיינו באמצעות אובייקטיבי שמן 100X במיקרוסקופ פלואורסצנטי; להשתמש דסק&quot;ש לדמיין תאים ומסנן FITC לדמיין הקרינה ה-GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התמונות מרובות עבור כל זן בכל נקודת זמן כדי לכמת. שדות עבור תמונות צריכים להכיל 15-30 ~ תאים לניתוח שלאחר הניסוי כמותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את אחוז התאים המכילים אגרגטים, לספור 50תאי -100 הכוללים ולחלק את מספר התאים המכילים אגרגטים. </li></ol></li></ol> 5. מיקרוסקופית תא בודד שיטה זו משמשת למעקב solubilization של אגרגטים בודדים בתא בודד לאורך זמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום ביטוי FFL-GFP כפי שתואר בסעיף 2, שלבי 1-8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הלם חום, תאי צנטריפוגות בצינור חרוטי 15 מ&quot;ל ב 4,400 סל&quot;ד במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם 500 μl מים וresuspend ב 20 μl של DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל זן, לחתוך את קטע של 5x5 מ&quot;מ צלחת אגר SC-URA ושימוש במשטח שהיה במגע עם צלחת פטרי, פיפטה μl 4 תאים והתפשטו ברחבי פני השטח של אגר עם קצה פיפטה. לתת לעמוד במשך דקות ~ 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בפינצטה למקום סעיף קובייה אגר עם פנים כלפי מטה על ~ 0 צלחת תחתית זכוכית 55 מ&quot;מ מס ולחץ כלפי מטה בקלילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ויזואליזציה: <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראה I-III בכתיון 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר קואורדינטות עבור 2-4 מוקדים לכל זן בהתאם לצפיפות של התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המצלמה כדי לצלם תמונות עם Z-מחסנית עם הטווח מתאים (- / + 15 מיקרומטר עם עובי פרוס מיקרומטר 0.5-1.0) כל 5 דקות לתקופה 90 דקות. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adapting+proteostasis+for+disease+intervention.">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li><li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104.">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).</li><li>Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+diffraction+studies+of+firefly+luciferase+from+Photinus+pyralis.">Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li><li>Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp104,+Hsp70,+and+Hsp40:+a+novel+chaperone+system+that+rescues+previously+aggregated+proteins.">Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins.</a> Cell. 94, 73-82 (1998).</li><li>Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+folding.">Mechanisms of protein folding.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 70-82 (2001).</li><li>Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+in+vivo+of+a+newly+translated+yeast+cytosolic+enzyme+is+mediated+by+the+SSA+class+of+cytosolic+yeast+Hsp70+proteins.">Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).</li><li>Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+binding+in+the+axial+channel+of+Hsp104.+Insights+into+the+mechanism+of+protein+unfolding.">Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding.</a> J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).</li><li>Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+bioluminescence:+a+mechanistic+approach+of+luciferase+catalyzed+reactions.">Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions.</a> IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+systems+biology+of+proteotoxic+stress+in+aging+and+disease.">The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).</li><li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence.">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li><li>Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+functions+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hsp90+chaperone.">In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).</li><li>Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+disaggregation+mediated+by+heat-shock+protein+Hsp104.">Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104.</a> Nature. 372, 475-478 (1994).</li><li>Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+stability+of+recombinant+green+fluorescent+protein+(GFPuv)+at+various+pH+values.">Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).</li><li>Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spectral+Distribution+of+Firefly+Light.">The Spectral Distribution of Firefly Light.</a> J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).</li><li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+disaggregase+machinery:+Hsp110+synergizes+with+Hsp70+and+Hsp40+to+catalyze+protein+disaggregation+and+reactivation+in+a+cell-free+system.">The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system.</a> PLoS One. 6, e26319 (2011).</li><li>Tkach, J. M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocytoplasmic+trafficking+of+the+molecular+chaperone+Hsp104+in+unstressed+and+heat-shocked+cells.">Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells.</a> Traffic. 9, 39-56 (2008).</li><li>Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Hsp70+subfamily,+Ssa,+in+protein+folding+in+yeast+cells,+seen+in+luciferase-transformed+ssa+mutants.">Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants.</a> Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).</li><li>Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+heat+shock+response+and+protein+chaperones:+budding+yeast+(Saccharomyces+cerevisiae)+as+a+model+system.">Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

במאמר זה מודל חלבון FFL-GFP שימש כדי להראות שdisaggregase השמרים, Hsp104 תורם לחלבון מחדש solubilization ותיקון. את מבחני וכן במיקרוסקופ אנזימטיות נחקרו באופן דיפרנציאלי את המצב של אותו חלבון המצע כדי לקבוע את היעילות ותשואת refolding. תוצאות של מבחני ההתאוששות אנזימטית עולה כי לא רק שההתאוששות המקסימלי בזן מוטנטי hsp104D לא יעיל, אבל בסדר הגודל הראשוני של לחץ התגלגלות היה גדול יותר בזן המוטציה (איור 2). הניתוח גם מראה כי בעוד שתאי hsp104D נראה היה שניסו לתקן, הם לא היו מסוגלים לקפל את החלבון במהירות תאי WT. שיטה זו אפשרה ניתוח רגיש וכמותי של פעילות FFL-GFP חושף את התפקיד החיוני של Hsp104 בתיקון של חלבון זה. תוצאות מיקרוסקופיה מציעות כי הסיבה לתיקון לא יעיל של אנזים FFL מפוגל בשל tחלבון o לכידה בתוך אגרגטים. הניתוח הראה כי באוכלוסיית התאים חסרי Hsp104, תאים לא יכולים לנקות את כל המצרפים לחלוטין ב -90 דקות (איור 3). בנוסף, ניתוחי התא בודדים גילו כי אגרגטים פתיל לאורך זמן, דבר המצביעים איחוד זה של אגרגטים קטנים יותר למבנים גדולים יותר עשויים לסייע לתהליך התיקון וrefolding (איור 4). אמנם תוצאה זו אינה מובנת מאליה מתמונות סטילס, סרטי זמן לשגות נאפשר אחד ללכת בעקבות ההתנהגות הדינמית של אגרגטים עצמאיים. תצפית של אגרגטים במהלך הזמן נחשף ירד היתוך המצרפי בזן hsp104Δ, מצביע על כך שתאים אלה אינם מהווים את המבנים הגדולים יותר בצורה יעילה וטוענים כי Hsp104 נדרש להיבט זה של שליטת חלבון איכותית. ספקולציות נוספות היא שתאים עשויים solubilize חלבון במהירות רבה יותר מאגרגטים גדולים אלה, אשר עשויים להכיל בנוסף disaggregation ותיקון מ &#39;achinery. מיקרוסקופיה מהתא בודד יכולה לשמש גם כדי לקבוע אם מלווים אחרים ועמיתים למלווים נמצאים במצרפים הגדולים לעומת קטנים, ואם דפוס התושבות זה משתנה לאורך זמן. יחד שיטות אלה יאפשרו ניתוח ביולוגי והן ביוכימי תא של refolding חלבון ותיקון בתאים חיים. שילוב של התוצאות משלוש השיטות שתוארו מקנה תובנות רב ממדיות לקינטיקה והיעילות של התאוששות סלולרית לאחר חום הלם proteotoxic. אוטומציה של חלק או את כל השלבים בפרוטוקול מאפשרת גם לגודל מדגם גדול יותר וביולוגי משכפל בניסוי נתון, להגביר את החוסן והביטחון אולטימטיבי בתוצאה. בנוסף, שיטות אלה באופן תיאורטי ניתן להרחיב את השימוש בתאים אנושיים ולא רק לניתוח גנטי, אלא גם לחקור את הכימיקלים שמשנים proteostasis.

אצל בני אדם הפרעות ניווניות לרבות המחלות של הנטינגטון אלצהיימר, פרקינסון, ונקשרו לחלבון misfolding וצבירה 10. תאים להעסיק מלווים מולקולריים כדי למנוע השמנה הקינטית של חלבונים תאיים לתוך מבני 6 misfolded לא פעילים. מלווים להשתתף ברשתות אינטראקציה מורכבות בתוך התא, אך הוא לא הבין לגמרי איך הסכום של אינטראקציות אלה תורם לproteostasis האורגניזם. אחד מהמלווים העיקריים האחראים למרבית קיפול חלבוני cytosolic הוא חלבון 70 KD חום ההלם (Hsp70) המשפחה 19. הוכח כי באובדן שמרים של ירידות HSP70 היכולת לקפל FFL heterologously הביע המתהווה וכדי לקפל את חלבון אנדוגני, ornithine transcarbamoylase, ב18 vivo, 7. היכולת לנתח מתקפל עם רזולוציה קרובה זמן אמת יקל להבין כיצד גורמים נוספים המשך הסלולריribute לתהליך Hsp70 תלוי זה. בנוסף, קיפול / refolding תגובות לא יכול להיות תלוי לחלוטין בחלבונים התורמים אלה, ולכן מבחני חייבים להיות רגישים מספיק כדי לזהות את שני שינויים גדולים וקטנים בקינטיקה ויעילות. Disaggregase תא השמרים, Hsp104, ממלא תפקיד חיוני בתיקון חלבוני misfolded מצטברים. למרות Hsp104 homologs זוהה בפטריות וצמחים, משפחה זו מופיעה להיעדר בmetazoans. זה הוצע כי מלווים אחרים, כגון אלו של משפחת Hsp110 לבצע חלק מפעילויות Hsp104 הידועות ביונקים 16. Hsp104 הוא +, חלבון מורכב hexameric AAA שמתפקד בשמרים לאגרגטים חלבון לשפץ, שתרם לrefolding ותיקון 13. Hsp104, יחד עם שמרי Hsp70, Ssa1, ושמרי Hsp40, Ydj1, נדרש להתאוששות של FFL מפוגל בשמרי תאים 5, 8. החלבון הקטן חום ההלם, Hsp26, גם הוכח להיות requiאדום לdisaggregation Hsp104 בתיווך של FFL 2. FFL הוא חלבון שני תחום שנקשר luciferin המצע באתר הפעיל ובעקבות שינוי קונפורמציה שדורש ATP וחמצן, decarboxylates מצע שחרור oxyluciferin, פחמן דו חמצני (CO 2), monophosphate אדנוזין (AMP), ו -11 קלות, 9, 3. המצע זמין מסחרי FFL, D-luciferin, התוצאות בפליטת אור בין 550-570 ננומטר שניתן לאתר באמצעות luminometer 15. FFL הוא רגיש להפליא denaturation מטיפולים כימיים או חום ואגרגטים במהירות על התגלגלות. בעת חשיפה לטמפרטורות שבין 39-45 מעלות צלזיוס FFL הוא פרש הפיך ו12 מומתים. לעומת זאת, ה-GFP ונגזרותיו הם עמידים מאוד לחלבון התגלגלות לחצים 14. לכן שילוב של שני החלבונים האלה מאפשר FFL לתפקד כמחצית ניסוי יציבה מסוגלת מיקוד G הפונקציונליFP לתאי פיקדונות שניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהוא על האוכלוסייה ורמות תא בודדות. יישום של assay אנזימטי בקורא צלחת multimode חצי אוטומטית בשילוב עם מיקרוסקופ האוטומטי מאפשר הערכה בו זמנית חסרת תקדים של קינטיקה תשואה של refolding תגובות. בנוסף, הגנטיקה המולקולרית הקלילה של cerevisiae Saccharomyces eukaryote המודל מאפשרת גם מניפולציה מדויקת של רשת בקרת איכות החלבון ואת ההזדמנות לגילוי המבוססים על גישות חדשניים כדי לזהות שחקנים שתרמו לתגובת לחץ התאי וproteostasis. במחקר זה, זני הבר מסוג (WT) וHSP104 מחיקה להביע FFL-GFP כפופים להלם חום denaturing חלבון. refolding FFL-GFP הוא פיקוח באמצעות שניהם assay אנזימטי ומיקרוסקופיה כreadout proxy עבור תיקון של proteome בא לידי ביטוי לאורך כמובן זמן התאוששות. בהשוואה לתאי WT, אנו מראים הזן מחיקת Hsp104 דואר הוא ~ 60% פחות יעיל בrefolding FFL-GFP, התומכים בממצאים קודמים הקמת תפקיד לHsp104 בהפעלה מחדש של מפוגל FFL 2.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Synergy MX Microplate Reader</td>
 <td>BioTek</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope</td>
 <td>Olympus, Tokyo Japan</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lumitrac 200 white 96-well plates</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SlideBook 5.0 digital microscopy software</td>
 <td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP152-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(LiAc) Lithium Acetate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L6883</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG (polyethelene glycol)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP233-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP120-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Malinckrodt</td>
 <td>4948</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1300-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC-URA</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1306-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cycloheximide</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>357420050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-luciferin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L9504</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>low melt agarose</td>
 <td>NuSieve</td>
 <td>50082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>immersion oil</td>
 <td>Cargille</td>
 <td>16484</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

coupled assays for monitoring protein refolding in saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, שהוגדר כתהליכים המשולבים של קיפול חלבונים / biogenesis, refolding / תיקון, והשפלה, הוא איזון עדין סלולרי שחייבים להישמר, כדי למנוע השלכות מזיקות 1. גורמים חיצוניים או פנימיים המשבשים את האיזון הזה יכולים להוביל להצטברות חלבון, רעיל ומוות של תאים. אצל בני אדם זה הוא גורם מרכזי תורם לסימפטומים הקשורים בהפרעות ניווניות כגון הנטינגטון 10, פרקינסון, והמחלות אלצהיימר. לכן זה חיוני שהחלבונים המעורבים בתחזוקה של proteostasis להיות מזוהים על מנת לפתח טיפולים למחלות המתישות האלה. מאמר זה מתאר שיטות לניטור בקיפול חלבוני vivo ברזולוציה זמן כמעט אמיתית באמצעות לוציפראז גחלילית חלבון המודל התמזג חלבון פלואורסצנטי ירוק (FFL-GFP). FFL-GFP הוא חלבון chimeric מודל ייחודי כמחצית FFL היא רגישה מאוד ללחץ-Induced מ &#39;isfolding וצבירה, אשר מנטרלת את האנזים 12. פעילות לוציפראז היא פיקוח באמצעות assay אנזימטי, ומחצית GFP מספקת שיטה של ​​הדמיה FFL המסיס או מצטבר באמצעות מיקרוסקופ האוטומטי. שיטות אלה בשילוב לשלב את שתי מקבילות ועצמאיים מבחינה טכנית גישות לניתוח והן refolding מחדש תפקודי של אנזים אחרי מתח. התאוששות פעילות יכולה להיות בקורלציה ישירה עם קינטיקה של disaggregation מחדש solubilization כדי להבין טוב יותר כיצד גורמי בקרת איכות חלבון כגון מלווים חלבון לשתף פעולה כדי לבצע פעולות אלה. בנוסף, ניתן להשתמש בו מחיקות או מוטציות גנטיות כדי לבדוק את תרומתם של חלבונים ספציפיים או יחידות משנת חלבון לתהליך זה. במאמר זה אנו בוחנים את תרומתם של חלבון disaggregase 13 Hsp104, ידוע לשותף עם גורם חילופי Hsp40/70/nucleotide (NEF) refolding מערכת 5, לrefolding חלבון כדי לאמת את הגישה הזאת.

השמרים תלויים בdisaggregase, Hsp104 לקפל חלבוני חום מפוגלים ביעילות. הפעילות של FFL-GFP הייתה פיקוח אחרי 25 דקות הלם חום, באמצעות assay הבזק הארה איור 1. את התוצאות של assay האוטומטי זו שמוצגת באיור 2 נחשפו עלייה הדרגתית בפעילות מעל 90 דקות שסופו של דבר הובילו להתאוששות&gt; 80% בתאי WT. זן hsp104Δ התאושש 19% מהפעילות המקורית על אותה מסגרת הזמן. יתר על כן, במידה של איון הראשוני הייתה גבוהה הרבה יותר בזן מוטנטי המלווה (26% פעילות בWT ו -11% בhsp104Δ) המצביע על כך Hsp104 ניתן משרת תפקיד מגן טרום מתח, או במהירות עם מקורבי denaturing FFL-GFP במהלך צעד איון תרמית כדי לצמצם את אובדן פעילות אנזים. מיקרוסקופיה האוכלוסייה אימתה assay הפעילות האנזימטית. כמעט כל התאים בhsp104D המוטציה Straבנשמר המצרפי FFL-GFP אחד לפחות בהשוואה למספר של אגרגטים בזן WT, שירד ב 62% תוך 90 דקות לאחר הלם חום (איור 3). בעוד מספר לא מבוטל של אגרגטים שנוצרו מייד לאחר הלם חום בשני הזנים, מספר התאים המכילים אגרגטים WT ירד במהירות תוך תאי hsp104Δ לא הצליחו לנקות את puncta הנצפה. נתונים אלו מחזקים את assay הפעילות, אשר הראה התאוששות 52% מפעילות בWT לעומת 8% התאוששות מינימאלית במתח hsp104Δ. מיקרוסקופיה אוטומטי תא הבודד גילתה כי בתאי WT לעומת זן hsp104Δ, FFL-GFP היה solubilized בשיעור גבוה יותר (נציג תמונות סטילס מוצגות באיור 4; לראות סרטים נוספים לסדרת זמן לשגות של FFL-GFP מחדש solubilization). בנוסף, על הדינמיקה של אגרגטים החלבון היו שונות מאוד; בתאי WT אגרגטים נטו להיות הפתיל<html> לפני שsolubilized, וזו לא נצפתה במתח hsp104Δ. assay זו תומך לא רק את התוצאות משתי השיטות האחרות, אבל גם מגלה תובנה מנגנון אפשרי לאופן שבו החלבון מצטבר הוא solubilized וקפל. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50432/50432fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50432/50432fig1.jpg" /> איור 1. סכמטי של assay התאוששות חום הלם FFL-GFP. ביטוי FFL-GFP הוא מושרה בשלב יומן בתאים שכבר מודגרות בSC-URA. כדי לגרום לתאי דגירה בSC-URA-MET במשך שעה 1. תאי צנטריפוגות ו resuspend ב SC-URA המכיל 100 מיקרוגרם / מיליליטר cycloheximide (CHX). לחום הלם, דגירה תאים ב 42 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות. לאפשר לתאים להתאושש על ידי דוגרים על 30 ° C. לאסוף דגימות לקורס זמן 90 דקות. עבור מבחני אנזימטיות D-luciferin הוא הוסיף לפני כל קריאה.ref = היעד &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/50432/50432fig1large.jpg&quot; = &quot;_blank&quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. <img alt="איור 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50432/50432fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50432/50432fig2.jpg" /> איור 2. דוגמאות אנזימטיות refolding / assay ההתאוששות. FFL-GFP של WT ותאי hsp104Δ (100 μl) נאספו לפני הלם חום ומייד לאחר הלם חום עבור כל נקודת זמן (0, 30, 60, ו -90 דקות). שלוש משכפל של כל דגימה היה aliquoted לתוך בארות של צלחת 96 גם לבנה עבור כל נקודת זמן. לקריאה, קורא הצלחת הוקם כדי למדוד הארה כל 30 דקות עבור 90 דקות ב 30 ° C. <img alt="איור 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50432/50432fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50432/50432fig3.jpg" /> &lt;br /&gt; איור 3. מיקרוסקופיה refolding FFL-GFP. 1 מ&quot;ל של תאים בכל נקודת זמן (טרום HS, 0, 30, 60, ו -90 דקות) נאסף וcentrifuged. Supernate היה aspirated ותאים היו resuspended ב2 μl של מים. תאים הוכנו על ידי ערבוב עם 2 μl של נמוך להמיס agarose. תאים היו דמיינו באמצעות אובייקטיבי שמן 100X. נציג תמונות של כל נקודת זמן מוצגות. Quantitation נעשה על ידי ספירת תאים בשדות וחישוב 4-5 אחוזים ממצבורים המכילים תאים (n ~ 100). <img alt="איור 4" fo:content-width="3.4in" fo:src="/files/ftp_upload/50432/50432fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50432/50432fig4.jpg" /> איור 4. תא בודד refolding כמובן זמן מיקרוסקופית של FFL-GFP. הודעה הלם חום 5 מ&quot;ל של תאים נאספו, centrifuged, וresuspended ב20 μl של DDH 2 O. 4 μl של תאים הונחו על 5 מ&quot;מ 2 </sup&gt; הקטע של אגר SC-URA, ודמיין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי על פני תקופה 90 דקות. התמונות הן מתחזיות Z-מחסנית נלקחה במהלך הזמן.

Watch this Scientific Journal Video about Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

מאמר זה מתאר את השימוש בחלבון היתוך לוציפראז-GFP גחלילית לחקור<em&gt; In vivo</em&gt; קיפול חלבונים ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em&gt;. שימוש מגיב זה, refolding של חלבון בחום מפוגל מודל יכול להיות במעקב בו זמנית על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי וassay אנזימטי לחקור את התפקידים של רכיבי רשת proteostasis בבקרת איכות חלבון.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

coupled-assays-for-monitoring-protein-refolding-saccharomyces

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

10.2K Views.  University of Texas Medical School. מאמר זה מתאר את השימוש בחלבון היתוך לוציפראז-GFP גחלילית לחקור In vivo קיפול חלבונים ב Cerevisiae Saccharomyces. שימוש מגיב זה, refolding של חלבון בחום מפוגל מודל יכול להיות במעקב בו זמנית על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי וassay אנזימטי לחקור את התפקידים של רכיבי רשת proteostas...

Video: Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection של Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

ביטוי וטיהור של חלבון פיברוזיס פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור מוליכות ב Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

טיהור של חלבון הטרנסממברני מוליכות רגולטור סיסטיק פיברוזיס שבא לידי ביטוי ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

מדידת שיעורי ריקבון mRNA ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; שימוש ב<em&gt; Rpb1-1</em&gt; זנים

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).