<ol>
	<li>Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.+Nature+reviews.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature reviews.</a> Drug discovery. 12, 347-357 (2013).</li><li>Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisited+role+of+microparticles+in+arterial+and+venous+thrombosis.">Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis.</a> Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 24-35 (2013).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+as+mediators+of+intercellular+communication+in+cancer--the+emerging+science+of+cellular+'debris'.">Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer--the emerging science of cellular 'debris'.</a> Seminars in immunopathology. 33, 455-467 (2011).</li><li>Schorey, J. S., Bhatnagar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+function:+from+tumor+immunology+to+pathogen+biology.">Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology.</a> Traffic. 9, 871-881 (2008).</li><li>Bobrie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27a+supports+exosome-dependent+and+-independent+mechanisms+that+modify+the+tumor+microenvironment+and+can+promote+tumor+progression.">Rab27a supports exosome-dependent and -independent mechanisms that modify the tumor microenvironment and can promote tumor progression.</a> Cancer research. 72, 4920-4930 (2012).</li><li>Peinado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+exosomes+educate+bone+marrow+progenitor+cells+toward+a+pro-metastatic+phenotype+through+MET.">Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET.</a> Nature medicine. 18, 883-891 (2012).</li><li>Al-Nedawi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+transfer+of+the+oncogenic+receptor+EGFRvIII+by+microvesicles+derived+from+tumour+cells.">Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells.</a> Nature cell biology. 10, 619-624 (2008).</li><li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature cell biology. 10, 1470-1476 (2008).</li><li>Dommelen, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+and+exosomes:+opportunities+for+cell-derived+membrane+vesicles+in+drug+delivery.">Microvesicles and exosomes: opportunities for cell-derived membrane vesicles in drug delivery.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 161, 635-644 (2012).</li><li>Pol, E., Coumans, F., Varga, Z., Krumrey, M., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovation+in+detection+of+microparticles+and+exosomes.">Innovation in detection of microparticles and exosomes.</a> Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 36-45 (2013).</li><li>Vogel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+sizing+of+nano/microparticles+with+a+tunable+elastomeric+pore+sensor.">Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor.</a> Analytical chemistry. 83, 3499-3506 (2011).</li><li>Kozak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+size+and+zeta-potential+measurements+of+individual+nanoparticles+in+dispersion+using+size-tunable+pore+sensors.">Simultaneous size and zeta-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors.</a> ACS. 6, 6990-6997 (2012).</li><li>Willmott, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+tunable+nanopore+blockade+rates+to+investigate+colloidal+dispersions.">Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions.</a> Journal of physics. Condensed matter : an Institute of Physics journal. 22, 454116-4510 (2010).</li><li>Roberts, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+pores+for+measuring+concentrations+of+synthetic+and+biological+nanoparticle+dispersions.">Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions.</a> Biosensor. 31, 17-25 (2012).</li><li>Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variable+pressure+method+for+characterizing+nanoparticle+surface+charge+using+pore+sensors.">A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors.</a> Analytical chemistry. 84, 3125-3131 (2012).</li><li>Kozak, D., Anderson, W., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+Particle+Velocity+and+Measurement+Sensitivity+by+Changing+Pore+Sensor+Dimensions.">Tuning Particle Velocity and Measurement Sensitivity by Changing Pore Sensor Dimensions.</a> Chemistry Letters. 41, 1134-1136 (2012).</li><li>Vrij, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+nanosized+extracellular+membrane+vesicles+with+scanning+ion+occlusion+sensing.">Quantification of nanosized extracellular membrane vesicles with scanning ion occlusion sensing.</a> Nanomedicine. 8, 1443-1458 (2013).</li><li>Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> J. Vis. Exp. (3037), (2012).</li><li>Yang, L., Broom, M. F., Tucker, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+nanoparticulate+drug+delivery+system+using+scanning+ion+occlusion+sensing.">Characterization of a nanoparticulate drug delivery system using scanning ion occlusion sensing.</a> Pharmaceutical research. 29, 2578-2586 (2012).</li></ol>

הפיתוח של הפרוטוקול שתואר והכתיבה של כתב היד הזה כבר נתמך כלכלי, בחלקו, על ידי הקרן ההולנדית המוח, שומאכר קרמר קרן, וBohnenn קרן. הפקה של מאמר וידאו זה הייתה בsponsorted חלקית על ידי Izon.

הפרוטוקולים מתוארים במתודולוגיות הצעת כתב היד הזה לכימות ואפיון גודל של כלי רכב חשמליים באמצעות tRPS. יתרונותיו העיקריים של פלטפורמת tRPS הם גודל המדגם הקטן, משך מדידה קצר יחסית והיעדר המניפולציה מדגם הנדרש. תנאי מוקדם למדידת tRPS מדויקת הוא לשמור תנאים זהים בין מדידות כיול ומדגם. זה כולל את השימוש במאגרים זהים, כמו גם הגדרות מכשיר זהות, כגון גודל nanopore, מתח ולחץ מופעל. VPM המקורי חסר מנגנון להגדרה של הלחץ המופעל מדויקת, ובכך גורם להבדלים קלים בלחץ שימושי בין דגימות. כמו כן, אידוי של נוזל תחול בVPM יכול לגרום להבדלי לחץ קטין בעת ​​מדידה בנקודות זמן שונים וVPM ולכן צריך להיות לעתים קרובות מחדש דרוך. מגבלות אלה עלולות להיות כבר נפתרו על ידי הקדמה של VPM2, שיש קנה מידה המבוסס על לחץ ומבוסס לחץ אוויר. הפרוטוקול החלופי שתואר בכתב היד הזה הוא מתאים במיוחד למדידה של כלי רכב חשמלי בדגימות ביולוגיות שאינם מטוהרת 17. אנו מאמינים כי רכיבי חיץ, כגון סוכרים, שומנים, חלבונים וגדולים יותר פסולת אחרות, יכול במקרים מסוימים להשפיע על תנאי המדידה יותר מדי עבור הפרוטוקול הסטנדרטי להיות ישים. תוספת של חרוזים כיול למדגם ולא השוואה בין שתי מדידות נפרדות מציגה &#39;כיול בזמן אמת&#39;. שיטה זו מתאימה במיוחד כאשר משווה דגימות (למשל פלזמה של תורמי דם שונים) שיש לי תוכן רקע fluidic שונה ו / או לא ידוע. למרות שקיימים הבדלים בין כלי רכב חשמליים וחלקיקי פוליסטירן (צפיפות חלקיקים למשל ותשלום פני השטח), מודלים תיאורטיים, כמו גם נתוני ניסוי מדגיש את השימושיות של חרוזי פוליסטירן לכימות ואפיון גודל של כלי רכב חשמליים,תחת התנאי שהלחץ משמעותי מיושם 15,19. כדי למזער את השפעתם של כוחות electrokinetic, שימוש בNP150 / nanopore NP200 הגדול יחסית והלחץ חיובי משמעותי מומלץ. כלי רכב חשמליים וחרוזים כיול נבדלים ביניהם בגודל. כתוצאה מכך, nanopore יש נפתח על ידי יישום מתיחה, לקוטר שבו גילוי של שני כלי רכב חשמליים וחלקיקי כיול הגדולים יותר הוא ציין. מאז הפתיחה הנקבובית תקטן הרגישות כלפי חלקיקים קטנים יותר, רק EVS גדול יותר מגודל מסוים נרשמים (לעתים קרובות כלי רכב חשמלי&gt; 120 ננומטר בעת שימוש בחרוז כיול 335 ננומטר). גבול הגילוי המינימאלי לכלי רכב חשמליים יכול להיות ירידה של כ 90 ננומטר, באמצעות 203 חרוזים כיול ננומטר על nanopore NP150. עם זאת, תוכנית התקנה זו יכולה להיות unviable כאשר כלי רכב חשמליים גדולים יותר לגרום לסתימה תכופה של nanopore. הנוכחות של כלי רכב חשמליים החוסמים אלה עלולות לאלץ את הניצול של התקנה שבו אוכלוסייה של כלי רכב חשמליים, קטנה מדי למחשבהCH סף הגילוי, לא יזוהה. הקושי לפעול עליות המערכת כאשר מנסה למדוד חלקיקים קטנים יותר מאשר בגודל 100 ננומטר. במקרים כאלה, זיהוי ניתן לשפר על ידי הגדלת ריכוז מלח של אלקטרוליט. ריכוז יון מוגבר יגרום לסדרי גודל יחסית מוגברים מצור לחלקיקים קטנים (גדול יותר יחס אות לרעש). הכדאיות של טכניקה זו למדידות של כלי רכב חשמליים צריכה להיות מאומתת אם כי, כפי שריכוזי מלח מוגברים עשויים להשפיע על עוצמת הקול של כלי רכב חשמליים. לסיכום, פלטפורמת tRPS יכולה לשמש לכימות ישיר ואפיון גודל של כלי רכב חשמליים. מאז לא נדרש בידוד או המניפולציה EV (נוגדן תיוג מחייב או ניאון), הפלטפורמה מתאימה לכימות EV ישיר בנוזלים ביולוגיים. פרוטוקול חלופי ובלבד שיכול להיות מועיל עבור דגימות שבו רכיבי חיץ לגרום cloggin הנקבובית משמעותיאירועים גרם, מה שהופך את הניצול אמין של הפרוטוקול הסטנדרטי unviable.

שלפוחית ​​ממוצא סלולארי הן נרחבת ביותר בנוזלי גוף 1. שלפוחית ​​אלה שנקראים תאי (EVS) (50 - 1,000 ננומטר בגודל) נוצרות על ידי שני ההיתוך של גופים רב לפוחי עם קרום התא או על ידי ניצנים החוצה ישירים של קרום התא. בשנים האחרונות, עניין מדעי בכלי רכב החשמלי גדל מאוד, וכתוצאה מכך שפע של פרסומים ממוקדים EV, שבו פונקציות ומאפיינים של כלי רכב חשמליים חדשות מתוארים 1. כלי רכב חשמליים נמצאים כעת האמינו להיות מעורב במגוון רחב של תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים כגון העברת אותות, רגולציה חיסונית, וקרישת דם 1-4. בסרטן, כלי רכב חשמליים נראים לשחק תפקיד בהיווצרות של נישות premetastatic 5,6, העברת פרו סרטני תוכן 7,8 וגירוי של אנגיוגנזה 8. חוץ מזה, כלי רכב חשמליים נחקרים כסוכני משלוח של סוכנים טיפוליים 9. למרות דה אלהvelopments, כימות אמין של כלי רכב חשמלי נותר מאתגר. באופן מסורתי, שיטות כימות עקיפות משמשות, אשר מסתמכות על כימות של תכולת חלבון כוללת או חלבונים ספציפיים. למרות שימוש נרחב, הטכניקות הללו אינן מסבירות הבדלי חלבון לכל EV, ואינה מבחינות בין זיהום אגרגטים חלבון וחלבונים בכלי רכב חשמלי. יתר על כן, טכניקות אלה דורשות בידוד של כלי רכב חשמליים, אשר במקרים רבים הופך את ההשוואה של ריכוזי EV בדגימות ביולוגיות בלתי אפשרית. לכן, מאמצים נעשים כדי לפתח שיטות חדשניות המאפשרות לEV יותר המדויק וישיר מדידה 10. דו&quot;ח זה מתאר את השימוש בחישה מתכונן דופק התנגדות (tRPS) לכימות אמין ואפיון גודל של כלי רכב חשמליים. נכון לעכשיו, qNano מכשיר (איור 1 א) היא הפלטפורמה היחידה זמינה מסחרי עבור tRPS. בtRPS, קרום אלסטי שאינו מוליך מנוקד wiה נקבובית בגודל ננו הוא מפריד בין שני תאי נוזל. אחד מתאי נוזל מלא במדגם של עניין, ואילו התאים האחרים מלאים באלקטרוליט ללא חלקיקים. באמצעות הפעלת זרם, זרימה / זרם חשמלי יוני היא הוקם, אשר שינתה עם העברת החלקיקים דרך הנקבובית (איור 1b). סדר הגודל של מצור הנוכחי (&quot;דופק התנגדות&quot;) הוא פרופורציונאלי להיקף 11 (איור 1 ג) החלקיקים. משך המצור ניתן להשתמש כדי להעריך את zeta-הפוטנציאל של חלקיקים, אשר מסתמך על מאפייני חלקיקים כגון תשלום או לעצב 12. פרופיל גודל של חלקיקים ידועים יכול להתבצע על ידי השוואת פולסים ההתנגדות נגרמים על ידי חלקיקים לא ידועים עם פולסים ההתנגדות נגרמים על ידי חלקיקי כיול בקוטר ידוע. חוץ מזה סדר הגודל של אירוע מצור, ששיעורה אלה מתרחשים נמדד. רלי קצב ספירה זוes בריכוז החלקיקים. מאז הריכוז ושיעור החסימות הם באופן ליניארי יחסיים 13, באמצעות מדגם כיול יחיד עם חלקיקים של ריכוז ידוע וגודל חלקיקים מאפשר למדידת הריכוז 14 והתפלגות גודל 11 של מדגם לא ידוע. התנועה של חלקיקים דרך nanopore נקבעה על ידי אלקטרו kinetic- כוחות (electrophoretic ואלקטרו האוסמוטי) וfluidic 15. על ידי שימוש במודול הלחץ משתנה (VPM) הבדל בלחץ בין תאי הנוזל יכול להיגרם ככוח נוסף. הפעלת לחץ חיובי מגדילה את קצב הזרימה של חלקיקים, אשר עשוי להועיל כאשר ריכוז החלקיקים הוא נמוך. כמו כן, יכול להיות מיושם בלחץ כדי להפחית את ההשפעה של כוחות אלקטרו קינטית. זה חשוב במיוחד בעת השימוש בnanopores עם נקבוביות בקוטר קטן יחסית (NP100, NP150 ואולי NP200) לעתים קרובות משמש לזיהוי של כלי רכב חשמלי.לnanopores אלה, גם כאשר הפעלת לחץ משמעותי, כוחות אלקטרו הקינטית יכולים, בהתאם למטען משטח חלקיקים, להישאר nonnegligible 16. על ידי מדידת שיעור החלקיקים בלחצים מרובים, אלקטרו kinetically מתוקן, ולכן יותר מדויק, ניתן לחשב ריכוז EV. הנה, פרוטוקולים מפורטים מסופקים כדי לקבוע את התפלגות הגודל וריכוז של כלי רכב חשמליים. בסמוך לפרוטוקול הפעולה הרגיל, גישה חלופית מתוארת בי דגימות ממוסמרות עם חרוזי פוליסטירן בגודל ידוע וריכוז 17. טכניקת כיול בזמן אמת זה יכול לשמש כדי להתגבר על כמה מהאתגרים הטכניים נתקלו במדידת כלי רכב חשמלי באופן ישיר בנוזלים ביולוגיים, דוגמת שתן, פלזמה וsupernatant תרבית תאים, או כאשר יציבות של nanopore על פני תקופה של זמן מדידה ארוכה לא יכולה להיות הבטיח.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/trps-with-qnano/">qNano instrument</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/vpm/">Variable pressure module</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/nanopores/">Nanopore</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>NP100, NP200</td>
			<td>Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibration Particles</td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>CPC100, CPC200, CPC400</td>
			<td>Calibration particles are available in different sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td>Basic sonication bath is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Mini) vortexer</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lift-free tissues</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows based computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Izon Control Suite 2.2</td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet Software</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification and size-profiling of extracellular vesicles using tunable resistive pulse sensing

שלפוחית ​​תאית (EVS), הכוללים &#39;microvesicles&#39; ו &#39;exosomes&#39;, נמצא בשפע רב בנוזלי גוף. בשנים האחרונות חלו גידול עצום בעניין בכלי רכב חשמלי. כלי רכב חשמליים הוכחו לשחק תפקידים חשובים בתהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים שונים, כוללים קרישה, תגובות חיסוניות, וסרטן. בנוסף, כלי רכב חשמליים יש פוטנציאל כסוכנים טיפוליים, למשל ככלי רכב משלוח סמים או כרפואת רגנרטיבית. בגלל הגודל הקטן שלהם (50 ל1,000 ננומטר) כימות מדויק ואפיון גודל של כלי רכב חשמלי הוא מאתגר מבחינה טכנית. פרוטוקול זה מתאר טכנולוגיה איך מתכונן חישת דופק התנגדות (tRPS), שימוש במערכת qNano, ניתן להשתמש בם כדי לקבוע את הריכוז וגודל של כלי רכב חשמליים. השיטה, הנשענת על זיהוי של כלי רכב חשמליים עם ההעברה שלהם דרך נקבובית בגודל ננו, היא מהירה יחסית, די בשימוש באמצעי אחסון מדגם קטן ואינה דורשת PURification וריכוז של כלי רכב חשמליים. הדגימות הבאה לפרוטוקול פעולה הרגיל גישה חלופית היא באמצעות תיארה ממוסמרות עם חרוזי פוליסטירן בגודל ידוע וריכוז. בזמן אמת זה טכניקת כיול יכול לשמש כדי להתגבר על מכשולים טכניים נתקל במדידת כלי רכב חשמלי באופן ישיר בנוזלים ביולוגיים.

<html> כדי להשתמש במכשיר tRPS, nanopore אינו מוליך צריך להיות ממוקם על 4 זרועות של המכונה (איור 1 א) ומתח (איור 1b) יש ליישם. ברגע נוכחי בסיס חשמלי שהוקמה, קטניות התנגדות נגרמות על ידי חלקיקים עוברים דרך הנקבובית תזוהה כפי שמודגמות באיור 1 ג. כלי רכב החשמליים היו מטוהרים מן supernatant תרבית תאים של U87-MG / EGFRvIII שורת תאי גליובלסטומה ידי ultracentrifugation. שיעור עלילת חלקיקים יציב הוא ציין בעת מדידת כלי הרכב החשמלי המבודדים (איור 2 א) על nanopore NP100. שיעור עלילת חלקיקים יציב זה נדרש למדידת ריכוז EV אמינה. לאחר התאמת הקלטת EV-המדגם להקלטה של חרוזים 115 ננומטר כיול קלקר, התפלגות גודל (איור 2b) ואומדן ריכוז של EV-המדגם ניתן להשיג (מידע לא מוצג). =&gt; כלי רכב חשמליים &quot;jove_content&quot; גם היו לכמת באופן ישיר בsupernatant תרבית תאי גליובלסטומה. כאשר מודדים כלי רכב חשמליים בדגימות ביולוגיות, סתימת nanopore לעתים קרובות תוצאות הפרעות ו / או תנודות בחלקות שיעור חלקיקים (3 א Figrue). התוצאה היא הערכות ריכוז EV לא מדויקות. על ידי מחבלים במדגם עם חרוזי פוליסטירן של ריכוז וגודל ידועים, ניתן לקבוע יחס EV-to-חרוז. איור 3 ממחיש את התוצאות שהתקבלו לאחר spiking supernatant תרבית תאים עם חרוזי פוליסטירן של 335 ננומטר בגודל. שתי אוכלוסיות ברורות הם נצפו. חלקיקי גרימת מצור של פחות מ 0.46 Na הם כלי רכב חשמליים נחושים, החלקיקים הגדולים יותר נקבעים חרוזי פוליסטירן. היחס של כלי רכב חשמליים לחרוזי פוליסטירן משמש לחישוב ריכוז הגלם של כלי רכב חשמליים (טבלה 1). איור 3 ג ממחיש את הערכת הגודל של שתי האוכלוסיות המבוססות על חרוזי פוליסטירן ממוסמר. מחדש התקנת nanopore משמשsulted בזיהוי של כלי הרכב החשמלי&gt; 140 ננומטר בגודל. זה יכול להיות הוריד על ידי הקטנת פתיחת nanopore, אולם זה יהיה גם לגרום לאירועי סתימה יותר. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" width="600" /> איור 1: מכשיר qNano ובדרך הפעולה. צילום () של המכשיר. Nanopore ממוקם על המכשיר, הפרדת תא נוזל נמוך יותר מתא עליון נוזל. תאי הנוזל מוגנים מפני הפרעות חשמליות סביבתיות על ידי כובע המיגון. איור (ב) מתווים חישה מתכונן דופק התנגדות (tRPS). Nanopore אלסטי שאינו מוליך הוא מפריד בין שני תאי נוזל. באמצעות הפעלת זרם זרם חשמלי שהוקם הדרך הנקבובית ניקב בnanopore. כשלפוחית ​​תאית לעבור nanopore, הזרימה יונית משתנה וזוהתה כדופק resistive. בtRPS גודל הפתיחה של nanopore יכול להיות מכוון (מופחת או מוגבר) על ידי מתיחת nanopore על ידי הגדלת המרחק בין זרועות היריבה של המכשיר, או צמצום המרחק הזה. דוגמא להמחשה של פולסים resistive (C). סדר הגודל של דופק התנגדות יחיד הוא פרופורציונאלי להיקף החלקיק:. קטניות גדולות יותר מצביעות על חלקיקים גדולים יותר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" width="600" /> איור 2: חלקיקים לספור עלילה וגודל החלוקה מתקבלת ממדידת כלי רכב חשמלי מבודדים מU87-MG / supernatant תרבית תאי EGFRvIII () חלקיקים לספור עלילה המצביעה על גילוי חלקיקים קבוע כולל.. הפחתה קצרה של particזיהוי le נצפה בין 80 ו100 שניות של הקלטה. לאחר השהיית ההקלטה והקשה על כובע המיגון, שיעור החלקיקים התייצב לאחר שההקלטה התחדשה. (ב) התפלגות הגודל של כלי רכב חשמליים מבודדים היא להתוות לאחר כיול המדגם לא ידוע (EVS) לחרוזי כיול קלקר 115 ננומטר. (5 ננומטר גודל סל). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" width="600" /> איור 3: כימות tRPS של כלי רכב חשמליים בsupernatant תרבית תאים באמצעות הפרוטוקול החלופי. חלקות () אופייניות של חלקיקים בריבית המתקבלות במדידת כלי רכב חשמלי באופן ישיר בנוזל ביולוגי. סתימה נקבובית גורמת להפרעות ותנודות קצרות בשיעור של גילוי חלקיקים. כלעלילה מייצגת מדידה לשכפל של המדגם זהה. גרפים (ב &#39;) בגודל הפצה שלוש לשכפל מתקבלים לאחר spiking supernatant תרבית תאים עם חרוזים כיול קלקר 335 ננומטר. כל חלקיקי גרימת דופק התנגדות של פחות מ 0.46 Na נבחרו ככלי רכב חשמליים. חרוזי פוליסטירן ממוסמר (C) ניתן להשתמש כדי להשיג גודל החלוקה של המדגם. (5 ננומטר גודל סל). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מדידה </td><td> כיול רק # 1 </td><td> כיול רק # 2 </td><td> Supernatant 1 # </td><td> Supernatant 2 # </td><td> Supernatant 3 # </td></tr><tr><td> הנוכחי ממוצע (NA) </td><td> 117 </td><td> 120 </td> &lt;td&gt; 116 </td><td> 118 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> שיעור חלקיקים </td><td> 172 </td><td> 194 </td><td> 250 </td><td> 246 </td><td> 196 </td></tr><tr><td> הפסקת שימוש (NA) </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td></tr><tr><td> סה&quot;כ חלקיקים </td><td> 303 </td><td> 317 </td><td> 489 </td><td> 488 </td><td> 454 </td></tr><tr><td> שלפוחית ​​תאית </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 213 </td><td> 215 </td><td> 213 </td></tr><tr><td> חרוזים כיול ממוסמר </td><td> 300 </td><td> 316 </td><td> 276 </td><td> 273 </td><td> 241 </td></tr><tr><td> כלי רכב חשמליים / חרוזים כיול </td><td> 0.01 </td><td> 0.003 </td><td> 0.772 </td><td> .788 </td><td> .884 </td></tr><tr><td> לדוגמא - רקע </td><td></td><td></td><td> 0.765 </td><td> 0.781 </td><td> .877 </td></tr><tr><td> שלפוחית ​​Extracelullar (10 7) / מ&quot;ל </td><td></td><td></td><td> 7.14 </td><td> 7.29 </td><td> 8.18 </td></tr><tr><td> 2.5x המדגם מדולל </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> כלי רכב חשמליים ריכוז גלם (10 7) / מ&quot;ל </td><td></td><td></td><td> 17.85 </td><td> 18.22 </td><td> 20.46 </td></tr></tbody></table> טבלת 1:. חישוב דוגמא לריכוז EV באמצעות הפרוטוקול החלופי ערך חתך הוא נחוש בדעתו להבחין כלי רכב חשמליים מחרוזי כיול. בהמשך לכך, במספר הכולל של כלי רכב חשמליים וחרוזים יכול להאסף. לכל מדידת יחס EV-to-חרוז מחושב. הסכום של חלקיקי רקע באלקטרוליט (לדוגמא אגרגטים חלבון) מחושב על ידי מיצוע יחס EV-to-חרוז למדידות בודדות של המדגם &#39;חרוזים כיול רק&#39;. עבור כל דגימת יחס הרקע יורד מהיחס שהתקבל. adjuste זהיחס ד מוכפל בריכוז של חרוזים הכיול במדגם (בדוגמא זו: 9.33e7 / מ&quot;ל). כדי לקבוע את ריכוז הגלם של כלי רכב חשמליים, הריכוז המתקבל מוכפל בגורם לדילול כלי רכב חשמלי הכולל (בדוגמא זו: 2.5).

Watch this Scientific Journal Video about Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing at JoVE.com

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

שלפוחית ​​תאית לשחק תפקידים חשובים בתהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים, כוללים קרישה, תגובות חיסוניות, וסרטן או סוכנים טיפוליים פוטנציאליים כמו במשלוח סמים או רפואת רגנרטיבית. פרוטוקול זה מציג שיטות לאפיון כימות וגודל של שלפוחית ​​תאית מבודדת ולא מבודדת בנוזלים שונים תוך שימוש בחישת דופק resistive מתכונן.

כימות וגודל-פרופיל של תאית שלפוחית ​​באמצעות Pulse חישה מתכוונן התנגדותי

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

quantification-size-profiling-extracellular-vesicles-using-tunable

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.2K Views.  University Medical Center Utrecht.  שלפוחית ​​תאית לשחק תפקידים חשובים בתהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים, כוללים קרישה, תגובות חיסוניות, וסרטן או סוכנים טיפוליים פוטנציאליים כמו במשלוח סמים או רפואת רגנרטיבית. פרוטוקול זה מציג שיטות לאפיון כימות וגודל של שלפוחית ​​תאית מב...

Video: Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

חיישן הולו Microneedle מבוסס על מרובב דרך העור אלקטרוכימי חישה

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the passage of necessary ions and molecules. A breach in this barrier can be caused by a reduction in the extracellular calcium concentration. This reduction in calcium concentration causes a conformational change in proteins involved in the sealing of the barrier, leading to an increase of the paracellular flux. To mimic this effect the calcium chelator ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetra acetic acid (EGTA) was used on a monolayer of cells known to be representative of the gastrointestinal tract. Different methods to detect the disruption of the barrier tissue already exist, such as immunofluorescence and&#160;permeability assays. However, these methods are time-consuming and costly and not suited to dynamic or high-throughput measurements. Electronic methods for measuring barrier tissue integrity also exist for measurement of the transepithelial resistance (TER), however these are often costly and complex. The development of rapid, cheap, and sensitive methods is urgently needed as the integrity of barrier tissue is a key parameter in drug discovery and pathogen/toxin diagnostics. The organic electrochemical transistor (OECT) integrated with barrier tissue forming cells has been shown as a new device capable of dynamically monitoring barrier tissue integrity. The device is able to measure minute variations in ionic flux with unprecedented temporal resolution and sensitivity, in real time, as an indicator of barrier tissue integrity. This new method is based on a simple device that can be compatible with high throughput screening applications and fabricated at low cost.

The Organic Electrochemical Transistor is integrated with live cells and used to monitor ion flux across the gastrointestinal epithelial barrier. In this study, an increase in ion flux, related to disruption of tight junctions, induced by the presence of the calcium chelator EGTA (ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetra acetic acid), is measured.

חישה של שיבוש טישו גדר עם טרנזיסטור אלקטרוכימי אורגני

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. To this end, cells are grown in special culture chambers on top of opposing, circular gold electrodes. A constant small alternating current is applied between the electrodes and the potential across is measured. The insulating properties of the cell membrane create a resistance towards the electrical current flow resulting in an increased electrical potential between the electrodes. Measuring cellular impedance in this manner allows the automated study of cell attachment, growth, morphology, function, and motility. Although the ECIS measurement itself is straightforward and easy to learn, the underlying theory is complex and selection of the right settings and correct analysis and interpretation of the data is not self-evident. Yet, a clear protocol describing the individual steps from the experimental design to preparation, realization, and analysis of the experiment is not available. In this article the basic measurement principle as well as possible applications, experimental considerations, advantages and limitations of the ECIS system are discussed. A guide is provided for the study of cell attachment, spreading and proliferation; quantification of cell behavior in a confluent layer, with regard to barrier function, cell motility, quality of cell-cell and cell-substrate adhesions; and quantification of wound healing and cellular responses to vasoactive stimuli. Representative results are discussed based on human microvascular (MVEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), but are applicable to all adherent growing cells.

This protocol reviews Electric Cell-substrate Impedance Sensing, a method to record and analyze the impedance spectrum of adherent cells for the quantification of cell attachment, proliferation, motility, and cellular responses to pharmacological and toxic stimuli. Detection of endothelial permeability and assessment of cell-cell and cell-substrate contacts are emphasized.

חשמל Cell-מצע עכבת חישה לכימות של האנדותל למניעת הפצת נשק, תפקוד מחסום, ותנועתיות

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain nucleic acid and protein cargo and are increasingly recognized as a means of intercellular communication utilized by both eukaryote and prokaryote cells. However, due to their small size, current protocols for isolation of EVs are often time consuming, cumbersome, and require large sample volumes and expensive equipment, such as an ultracentrifuge. To address these limitations, we developed a paper-based immunoaffinity platform for separating subgroups of EVs that is easy, efficient, and requires sample volumes as low as 10 &#956;l. Biological samples can be pipetted directly onto paper test zones that have been chemically modified with capture molecules that have high affinity to specific EV surface markers. We validate the assay by using scanning electron microscopy (SEM), paper-based enzyme-linked immunosorbent assays (P-ELISA), and transcriptome analysis. These paper-based devices will enable the study of EVs in the clinic and the research setting to help advance our understanding of EV functions in health and disease.

This protocol details a method to isolate extracellular vesicles (EVs), small membranous particles released from cells, from as little as 10 &#956;l serum samples. This approach circumvents the need for ultracentrifugation, requires only a few minutes of assay time, and enables the isolation of EVs from samples of limited volumes.

מכשירים מבוססי נייר לבידוד ואפיון של תאית שלפוחית

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

המצאה של מכאני מתכוונן ויו מתכת פיגומים עבור יישומים ביו

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Determination of Zeta Potential via Nanoparticle Translocation Velocities through a Tunable Nanopore: Using DNA-modified Particles as an Example

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and nanoparticles. Tunable resistive pulse sensing (TRPS) is a relatively recent adaptation to RPS that incorporates a tunable pore that can be altered in real time. Here, we use TRPS to monitor the translocation times of DNA-modified nanoparticles as they traverse the tunable pore membrane as a function of DNA concentration and structure (i.e., single-stranded to double-stranded DNA).
TRPS is based on two Ag/AgCl electrodes, separated by an elastomeric pore membrane that establishes a stable ionic current upon an applied electric field. Unlike various optical-based particle characterization technologies, TRPS can characterize individual particles amongst a sample population, allowing for multimodal samples to be analyzed with ease. Here, we demonstrate zeta potential measurements via particle translocation velocities of known standards and apply these to sample analyte translocation times, thus resulting in measuring the zeta potential of those analytes.
As well as acquiring mean zeta potential values, the samples are all measured using a particle-by-particle perspective exhibiting more information on a given sample through sample population distributions, for example. Of such, this method demonstrates potential within sensing applications for both medical and environmental fields.

Here we use a polyurethane tunable nanopore integrated into a resistive pulse sensing technique to characterize nanoparticles surface chemistry via the measurement of particle translocation velocities, which can be used to determine the zeta potential of individual nanoparticles.

קביעת פוטנציאל זטה באמצעות Nanoparticle טרנסלוקציה מהירויות באמצעות nanopore מתכוונן: באמצעות חלקיקים שונה-DNA כמשל

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical development, not only their pharmaceutical activity is important but also their production needs to be evaluated. In this context, research focuses on the isolation of EVs, their characterization, and their storage. The present manuscript aims at providing a facile procedure for the assessment of the effect of different storage conditions on EVs, without genetic manipulation or specific functional assays. This makes it possible to quickly get a first impression of the stability of EVs under a given storage condition, and EVs derived from different cell sources can be compared easily. The stability measurement is based on the physicochemical parameters of the EVs (size, particle concentration, and morphology) and the preservation of the activity of their cargo. The latter is assessed by the saponin-mediated encapsulation of the enzyme beta-glucuronidase into the EVs. Glucuronidase acts as a surrogate and allows for an easy quantification via the cleavage of a fluorescent reporter molecule. The present protocol could be a tool for researchers in the search for storage conditions that optimally retain EV properties to advance EV research toward clinical application.

Here we present a readily applicable protocol to assess the storage stability of extracellular vesicles, a group of naturally occurring nanoparticles produced by cells. The vesicles are loaded with glucuronidase as a model enzyme and stored under different conditions. After storage, their physicochemical parameters and the activity of the encapsulated enzyme are evaluated.

הערכת יציבות האחסון של שלפוחיות ומסחטות

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

הכנת למימדי מיקרותאי מטריצה מטריצות להערכת Schwann מפרט Cell

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

כימות וגודל-פרופיל של תאית שלפוחית ​​באמצעות Pulse חישה מתכוונן התנגדותי

כימות וגודל-פרופיל של תאית שלפוחית באמצעות Pulse חישה מתכוונן התנגדותי