יציבות האחסון של ורי סלולר נוספים היא פרמטר חשוב לשימוש הטיפולי הפוטנציאלי שלהם. הפרוטוקול שלנו מספק כלי ישים להערכת אופן האחסון של הווסיקים. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא כי על ידי החדרת glucuronidase כמו סמן אקסוגני, וקסים חוץ תאיים הנגזרים מתאים אב שונים ניתן להשוות בקלות לגבי החסידות שלהם.
שבר זרימה של שדה זרימה אסימטרי, או AF4, הוא חלופה קלה לטיהור כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל עבור תרכובות רגישות מאוד. כי התרכובות נתקלות בפחות לחץ בערוץ. כמו glucuronidase הוא אנזים רגיש, איכות השוכנים נהנה תכנון יסודי וביצוע השלבים לטיהור וניתוח גב אל גב.
לאחר culturing את קו התא של עניין על פי התנאים הסטנדרטיים עבור תאים אלה, להחליף את supernatant עם סרום חינם או תוספת ורירית הסלולר מרוקן בינוני ולהחזיר את התאים החממה תרבות התא במשך 24 עד 72 שעות נוספות. בסוף הדגירה, לאסוף את natant סופר מכל בקבוק צנטריפוגה את הדגימות כדי להכביד על התאים. בזהירות לאסוף את התא מותנה בינוני מבלי להפריע גלולה.
וצנטריפוגה המדיום שוב כדי להסיר פסולת תא אגרגטים גדולים. לאחר מכן מעבירים בזהירות את העל-טבעיים לצינורות אולטרה-מרכזיים. אם אתה משתמש ברוטור זווית קבועה, סמן את כיוון הצינורות בצנטריפוגה כדי להקל על אחזור גלולת הווסקולרית החוץ-תאית לאחר הצנטריפוגה.
בסוף האולטרה-צנטריפוגה, השתמשו בפיפטה סרולוגית כדי להשליך בזהירות את העל-טבעי מבלי להפריע לכדור הדם החוץ-תאי. ב-200 מיקרוליטרים של נקבובית מיקרומטר 0.2 סיננו את PBS לשאריות העל-טבעיות של צינור האולטרה-מרכזי הראשון. לאחר שימוש חוזר את גלולה, להעביר את ההשעיה חוץ תאית וכתוצאה מכך לצינור הבא עבור התדלוק של גלולה הבאה עד כל כדורי חוץ חוץ תאיים כבר resuspended.
הוסף בטא glucuronidase לפתרון גלולה resuspended הסופי לריכוז הסופי של 1.5 מיליגרם למיליליטר. וספונין לריכוז סופי של 0.1 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן מערבבים היטב על ידי מערבולת במשך שלוש שניות ומ מניחים את התגובה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות עם הבהוב עדין לסירוגין.
לאחר glucuronidase כבר עכוף, הקפד לבצע את כל השלבים הבאים הערכה תקן טיהור באותו יום כדי להשיג תוצאות יציבות אחסון משוחדת. יש עמודת כרומטוגרפיה אי-הכללה בגודל שמצויידת בלפחות שני כרכים של עמודות של PBS המוכנים לטהר את גלולת הכדור מיד לאחר הדגירה של סאפונין. כדי לטהר, להוסיף עד 400 microliters של השעיה חוץ תאית חוץ תאית לעמודה.
ואז לאסוף שבר אחד מיליליטר של eluate. כדי להתאים את ההפרדה של וקסיקים חוץ תאיים מן החלבונים המזהמים glucuronidase חינם, למדוד את ריכוז החלבון על ידי אסאי חומצה ביצינצ'ונית על פי הוראות היצרנים. באמצעות פרמטרים המותאמים עבור המכשיר וסוג הווסקל המתאים, השתמש במכשיר ניתוח מעקב חלקיקי ננו כדי למדוד את גודל וריכוז ולררית החוץ-תאית.
כדי למדוד את פעילות glucuronidase, להוסיף 25 microliters של פלואורצין די בטא-D-Glucuronide מוכן טרי ל 125 microliters של ורידים חוץ תאיים מטוהרים ולהוסיף את המדגם לגם אחד של צלחת שחורה 96 היטב. למדוד את הזמן אפס ייצור פלואורצין על קורא צלחת ב 480 ננומטר העירור ו 516 פליטת ננומטר. מכסים את הצלחת בחוזקה בנייר כסף שקוף כדי להפחית את האידוי.
ואז לה הדגירה את הצלחת מוגנת מפני אור במשך 18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. למדוד את ייצור פלואורצין 18 שעות על קורא הלוח כפי שהוכח רק. עבור ליופיפיליזציה חוץ-תאית של דם, יש להוסיף ארבעה מיליגרם למיליליטר טרהלוז לווסיקלים המטוהרים.
ולהקפיא את הווסיקים במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות. כדי lyophilize את הדגימות, להגדיר את טמפרטורת המדף של lyophilizer ל 15 מעלות צלזיוס ואת הלחץ ל 0.180 מיליבארים. יבש את הווסיקים בתנאים אלה במשך 46 שעות.
בסוף שלב הייבוש העיקרי, הגדר את טמפרטורת המדף ל -25 מעלות צלזיוס ואת הלחץ ל 0035 מיליבארים ולייבש את הדגימות במשך שעתיים בתנאים אלה. ואז לאחסן את דגימות ליופילים בארבע מעלות צלזיוס. כדי rehydrate את הדגימות לאחר האחסון, להוסיף נפח מים שווה לנפח של ההשעיה חוץ תאית לפני lyophilization.
כדי להעריך את פעילות האנזים לאחר האחסון, לטעון מכשיר AF4 עם PBS מסונן 0.1 מיקרומטר מוכן טרי לשלב הנייד ולהכניס קרום מסנן מיקרומטר 0.1 לתוך מסנן הכניסה שיא לאחר המשאבה כדי להפחית את רעש החלקיק מן הממס. לאחר פירוק, לנקות את התעלה הקטנה עבור AF4 עם מי millEq. לחות קרום תאית חדש מחדש עם משקל מולקולרי לחתוך של 30 קילודאלטון ולהציב את הממברנה על גבי fret עם הצד המבריק למעלה.
מניחים רווח רחב של 350 מיקרומטר מתחת לחצי העליון של הערוץ ומרכיבים את חלקי הערוץ. באמצעות מברג נוי, הדק את הברגים תחילה למומנט של חמישה מטרים של ניוטון, ולאחר מכן לממנט של שבעה מטרים של ניוטון. הידוק הברגים סביב הבלוק בתבנית שתי וערב.
חבר את יציאת הערוצים, השקע והזרימה הצולבת לליקוי החמה. ואז מלפחות שלוש דגימות ישנות כדי לצייד את הממברנה. תוכנית שבר לרוץ עם זרימת גלאי וזרימת מיקוד מוגדר מיליליטר אחד לדקה וזרימת הזרקה של 0.2 מיליליטר לדקה.
לאחר צעד אחד לפני המיקוד, להזריק את המדגם על פני תקופה של 10 דקות בפוקוס ולהזריק צעד, לפני הפחתת זרימת הצלב משני מיליליטר לדקה ל 0.1 מיליליטר לדקה במהלך שמונה דקות. לסיים את השבר לרוץ עם צעד אלוטיון ללא זרימה צולבת במשך 10 דקות ולהוסיף שלב כביסה של אלוטיון והזרקה, ואחריו אלוטיון. לאחר מכן לצייד את הערוץ להפעלה הבאה עם זרימה צולבת ראשונית של שני מיליליטר לדקה ולהגדיר את גלאי UV ל 280 ננומטר.
כאשר כל התוכניות נקבעו, להזריק 300 microliters של המדגם ולהקליט את אותות פיזור UV ואור בתוכנת ASTRA. לאחר 12 וחצי דקות, להתחיל לאסוף שבר אחד מיליליטר עד 27 דקות לאחר הזרקת. לאחר מכן לבצע בדיקה glucuronidase וניתוח מעקב חלקיקים ננו כפי שהוכח.
כאן, התאוששות החלקיקים ואת הגודל של וקסיקים חוץ תאיים מבודדים תאים אנדותל כלי דם אנושיים לאחר שבעה ימים של אחסון בתנאים שונים מוצגים בהשוואה לדגימה טרייה. וקסקלים היו נתונים לאחר מכן לטיהור AF4 ופעילות הגלוקורונידה לכל חלקיק נמדדה. הן כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל והן AF4 מצליחות להפריד בין ורידים חוץ-תאיים לבין גלוקוקורונידס חופשי.
בשל דרגת ההפרדה הגבוהה יותר עבור AF4 בין חלקיקים ואנזים חופשי, זיהום של שברים המכילים ווסיקים הוא פחות סביר. טיהור AF4 לאחר אחסון מסיר אנזים חינם מן הדגימות ובכך מוריד את כמות פעילות האנזים התאושש לכל חלקיק. אפקט זה בולט ביותר לאחר אחסון בארבע מעלות צלזיוס, שעבורו נצפתה הפחתה של 2/3.
השמטת שלב טיהור נוסף זה עלולה להוביל להנחה שגויה לגבי יציבות האנזים. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור אינו חושף הבדלים גדולים בצורה עבור סטרוקולרים חוץ תאיים lyophilized ללא cryoprotectant. סריקת הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים, לעומת זאת, מגלה את נוכחותם של אגרגטים בתוך דגימות ליופילים שלא נמצאו בדגימות מאוחסנות מינוס 80 מעלות.
זה חיוני כי אנזים חינם מוסר מן הווסיקים לפני מוצף glucuronidase. לכן, הטכניקה המשמשת לטיהור וויסקל צריך להיות מוערך ביסודיות. ניתן גם לבדוק את החלקיקים המטוהרים במונחים של מטען פני השטח שלהם כדי לגלות אם האחסון שינה את ההרכב הטבעי של חלבוני הממברנה או הסוכרים.
עם הטכניקה שלנו, ניתן לקבל אינדיקציה ראשונה על יציבות אחסון חוץ חוץ תאי, גם כאשר אין סמנים ספציפיים ידועים או תן עבור הפעילות הזמינה.
