Name: using fluorescent proteins to monitor glycosome dynamics in the african trypanosome
Uploaded: 2014-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome at JoVE.com

This work was funded by the Creative Inquiry Program for Undergraduate Research and the Calhoun Honors College at Clemson University.

.1 כללי Trypanosome בעלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל מוצקים להכנת SDM79 תקשורת (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב 4 ° C. ב50 חרוטי מ&quot;ל או שקית ניילון אטומה. הערה: ריאגנטים יציבים במשך לפחות 6 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרום הפשרת שור עוברי (FBS) בwaterbath 37 מעלות צלזיוס, ומערבבים מעת לעת על ידי היפוך. הערה: FBS מתקבל מהספק כפתרון סטרילי. מסנן עיקור FBS מפחית את יכולתה לתמוך בצמיחה טפילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל הבקבוק מופשר, חום להשבית סרום ל30 דקות בwaterbath C 56 מעלות, ערבוב מעת לעת כדי למזער משקעים של רכיבים בסרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פניצילין הפשרה / פתרון סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס), hemin (2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב50 מ&quot;מ NaOH), ופתרון ויטמין נשר בינוני בסיסי בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל1,000 מ&quot;ל סיים גליל, להוסיף 20.2 גרם של מוצקי SDM79 (טבלה 1) לרכיבים נוזליים (טבלה 2) ומערבבים היטב על צלחת ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתאים את pH 7.35, ולהביא נפח ל850 מ&quot;ל עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן לעקר תקשורת על ידי הצמדת צינור ואקום לחלק התחתון של בקבוק מסנן. החל ואקום עד הפתרון מסונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עליון מסנן בקבינט הבטיחות הביולוגי ולהוסיף 150 מ&quot;ל של החום מומת FBS. מסיר את מכסה פלסטיק מכובע סטרילי ובקבוק תקשורת חותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת SDM80 באותו אופן כמו SDM79 עם החריגים הבאים; לא להוסיף סוכר באו גלוקוזאמין ולהשתמש MEM ללא גלוטמין. במקום של 150 מ&quot;ל של החום מומת FBS, להוסיף 135 מ&quot;ל של דיאליזה, חום מומת FBS, ו15 מ&quot;ל של חום מומת FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפילי PCF תרבות ב25 סנטימטר בקבוק 2 עם מדיום מתאים 10 מ&quot;ל ב27 ° C ו 5% CO 2. הערה: תאים צריכים להיות נספרים מדי יום באמצעות hemocytometer או cytometer זרימה (ראה סעיף 6) ויש לשמור תרבויות בצפיפויות בין 1 x 10 5 ו 5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li></ol> 2 Transfection של טפילי PCF עם Construct כתב הניאון הערה: כדי לעקוב glycosome דינמיקה, חלבון כתב המכיל את רצף peroxisomal המיקוד (PTS2) של aldolase התמזג חלבון פלואורסצנטי צהוב משופר בא לידי ביטוי בטפילים. הרצף מקודד את חלבון ההיתוך משובט לתוך 12 pXS2bla, המכיל את אמרגן procyclin ואזורים חוץ-טובולין, שרקומבינציה ישירה הומולוגית לתוך הגנום וגן התנגדות blasticidin לבחירה. שורות תאי Procyclic מחסה הגנים המקודדים המדכא פולימראז וטטרציקלין T7 (PF29-13) הופכות עם מבנה המיקוד, pXS2: PTS2eYFP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן cytomix ידי ערבוב הרכיבים המפורטים בטבלה 3. סנן לעקר ולאחסן ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize פלסמיד דנ&quot;א עם MluI ידי pipetting 10 μl של DNA (1 מיקרוגרם / μl), חיץ אנזים הגבלה 5 μl, מים 33 μl, ו2 μ; L של אנזים MluI לתוך צינור microcentrifuge. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את ההגבלה לעכל על ידי הוספת נפח של 1 חיץ מחייב לאנזים ההגבלה לעכל. מערבבים חיץ מחייב וDNA מתעכל על ידי vortexing. בקצרה צנטריפוגות לאסוף הדגימה בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס DNA מחייב עמודה לתוך צינור איסוף 2 מ&quot;ל, והעברה מתעכל DNA / מחייבת פתרון חיץ לעמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ל10,000 XG דקות 1. לאחר צנטריפוגה, להשליך תסנין מצינור איסוף ולהחזיר את הטור לצינור האיסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 700 μl של חיץ לשטוף SPW ו צנטריפוגות ב XG 10,000 דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תסנין בטל מצינור איסוף, להחזיר את הטור לצינור האיסוף וחזור SPW שלב לשטוף וצנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תסנין בטל, טור חזרה לצינור איסוף, ו צנטריפוגות העמודה הריקה במשך 3 דקות ב 10,000 XG כדי להסיר אתנול השיורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגי, לזרוק colצינור lection ועמודה מקום בצינור microcentrifuge סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לelute DNA, להוסיף 25 μl של מים סטריליים לעמודה ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 2 דקות. צנטריפוגה ב 10,000 XG דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף עוד 25 μl של מים סטריליים במכסת מנוע בטיחות ביולוגית לעמודה ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 10,000 מהירות XG דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבינט בטיחות ביולוגי להעביר נפח שלם של DNA לצינור microcentrifuge סטרילי חדש. הערה: פעולה זו מונעת זיהום מהמכסה הפתוחה במהלך צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את DNA סטרילי, המטוהר, היא לינארית (10 מיקרוגרם) ל400 μl של cytomix פילטר מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים כאמור בסעיף 6 ולקצור 5 7 -10 8 תאים x10 על ידי צנטריפוגה ב800 XG במשך 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 450 μl של DNA + cytomix באמצעות פיפטה סרולוגית 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תמיסה המכילה ce<html> LLS, DNA, וcytomix לקובט קובט הפער והמקום סטרילי 4 מ&quot;מ בתא electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;דעיכה מעריכית&quot; ולהזין באופן ידני את ההגדרות הבאות: מתח: 1.5 ק, קיבוליות: 25 MF, התנגדות: Ω, וקובט: 4 מ&quot;מ. דופק לחץ. ברגע שהדופק הוא מלא, להסיר את קובט מתא electroporation ולחזור לארון הבטיחות הביולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתוך בקבוק סטרילי חדש, פיפטה 10 מ&quot;ל של SDM79. להעביר את התאים הפכו לבקבוק עם 10 מ&quot;ל של SDM79. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ללא בחירת תרופה ל24 שעות ב27 ° C, 5% CO 2. לאחר 24 שעות, להוסיף G418 (15 מיקרוגרם / מ&quot;ל), hygromycin (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל), וblasticidin (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל). Pass 1 מ&quot;ל של תאים הפכו עם תרופה ל9 מ&quot;ל של SDM79 עם סמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח תאים יומיים כמפורט בסעיפים 6 ו -7 כאשר תאי ניאון, והגיע לצפיפות תאים של 1 x 10 7 / מ&quot;ל, להפוך stabilates לאחסון לטווח ארוך (3.1-3.3). </li></ol>ve_title &quot;&gt; 3. ביצוע Stabilates <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך הקפאת תקשורת, מוסיף נפח שווה של גליצרול 100% לcytomix ומסנן לעקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של תקשורת הקפאה ל800 μl של תאים (1 x 10 7) בcryovial, מערבב בעדינות על ידי היפוך ומקום בין שני מדפי קלקר ולהקפיא ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע קפוא (~ שעה 24), תאי העברה לחנקן נוזלי. הערה: חשוב לעבור תאים לתוך LN 2 לאחר 24 שעות, כאחסון ארוך יותר ב -80 ° C גורם לירידה בכדאיויות תא. </li></ol> .4 מניות הפשרה קפואה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בקבוקון קפוא מ-80 ° C והפשרה על RT כ 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 9 מ&quot;ל פיפטה של ​​SDM79 עם סמים לתוך בקבוק סטרילי חדש. הוספת תאים מופשרים לבקבוק הזה. עובר תאים 01:10 על ידי הוספת 1 ​​מ&quot;ל של תרבות זו עד 9 מ&quot;ל של SDM79 בבקבוק חדש (ריכוז סופי של 1 x 10 5 / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני התאים להגיע לצפיפות של 10 7 / מ&quot;ל, להתחיל להגדיר cytometerומבחני דילול. </li></ol> .5 הגדרת Cytometer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הזרימה cytometer ולפתוח תכנית CFlow פלוס. הערה: לפני הפעלת כל דגימות, יש backflushed fluidics ושטף על פי צעדים 5.2-5.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את הצינור של המים nanopure בי הלגימה מאוחסנת עם צינור ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בלחצן &quot;backflush&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שbackflush הוא מלא, להסיר צינור microcentrifuge מלגימה וזורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צינור microcentrifuge חדש המכיל 1 מ&quot;ל של המים nanopure חדשים בלגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר גם חדש בתכנית CFlow. תחת &quot;מגבלות הפעלה&quot; להגדיר זמן למשך 2 דקות. תחת &quot;fluidics&quot; בחר באפשרות &quot;מהיר&quot; ועל &quot;הפעל&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמגבלת הזמן 2 דק &#39;היא מלאה, לחץ על לחצן &quot;מחיקת נתונים לדוגמא&quot;. </li></ol> .6 ספירת תאים באמצעות Cytometer הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף מים עם את המדגם כדי לספור. הגדר &quot;גבולות לרוץ &quot;ל30 שניות,&quot; fluidics &quot;ל&quot; מהיר &quot;ולאחר מכן בחרו באפשרות&quot; הפעלה &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מגבלת זמן 30 שניות היא מלאה, CFlow בתוספת תספק את האירועים / μl תחת &quot;הפעלה האחרונה.&quot; ספירה חוזרת לכל תרבות ותרבות. הערה: לפני תאים להגיע 1 x 10 7 תאים / מ&quot;ל, להמשיך עם assay דילול. יש להפסיק את התאים לאחר assay דילול אחד הושלם. תאים בתרבית לתקופות ארוכות יותר לאבד את היכולת שלהם להגיב לתנאי סביבה. </li></ol> .7 הקרינה מדידה באמצעות Cytometer הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך הקרינה, להגדיר &quot;גבולות הפעלה&quot; ל10,000 אירועים, ו&quot; fluidics &quot;ל&quot; איטי&quot;. בחר באפשרות &quot;סף הגדר&quot;. תחת &quot;סף ראשוני&quot;, בחר &quot;לצמיתות לחסל אירועים ב&quot;,&quot; FSC-H &quot;(בתיבה נפתחת) והזן פחות מ 30,000. לחץ על &quot;החל&quot;, ואז &quot;קרוב&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר220; &quot;כפתור באחד חלונות העלילה החדשים ובחר באפשרות&quot; היסטוגרמה FSC-&quot;מרשימה הנפתחת, בחר&quot; FL1-&quot;. הערה: הקרינה אמצעי FL1-באורך גל 530 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;הפעלה&quot; וחזור על פעולה עבור כל התרבויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ניקוי פתרון דרך קו fluidics למשך 2 דקות ומים למשך 2 דקות. </li></ol> .8 מבחני דילול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובר תאים לצפיפות של 1 x 10 5 תאים / מ&quot;ל ב 3 מ&quot;ל של SDM79 בבקבוק 2 תרבות 25 סנטימטר ולמדוד בתפרחת מייד לאחר מעבר ולאחר מכן בשעה 3 ו24 שעות. </li></ol> ניתוח .9 נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;נתח&quot; לשונית בCFlow פלוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן &quot;היסטוגרמה&quot; תחת &quot;הפוך עלילה חדשה.&quot; בחר &quot;FSC-&quot; ורשימה נפתחת יופיע. ערוץ בחר &quot;FL1-.&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן גם לנתח. בחר כפתור &quot;שער&quot;, ולצייר שער באופן ידנילאוכלוסייה של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימת פלוס תספק &quot;רוזן&quot; תא בתוך השער הזה ו&quot;% ממגרש זה &quot;. </li></ol>

<ol>
	<li>Stuart, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetoplastids:+related+protozoan+pathogens,+different+diseases.">Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases.</a> J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).</li><li>Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+glycosomes+during+life-cycle+differentiation+of+Trypanosoma+brucei.">Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei.</a> Autophagy. 4, 294-308 (2008).</li><li>Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+related+processes+in+trypanosomatids:+insights+from+genomic+and+bioinformatic+analyses.">Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses.</a> Autophagy. 2, 107-118 (2006).</li><li>Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+functions+of+glycosomes+in+trypanosomatids.">Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids.</a> Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).</li><li>Michels, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomes,+glyoxysomes+and+glycosomes+(review).">Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review).</a> Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).</li><li>Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+peroxisomes+and+glycosomes:+trypanosomatid+glycosome+assembly+is+a+promising+new+drug+target.">Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).</li><li>Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+function+of+peroxisomes+and+glycosomes.">Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes.</a> Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).</li><li>Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosomes:+parasites+and+the+divergence+of+peroxisomal+purpose.">Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose.</a> Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).</li><li>Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+aspects+of+glycosomes+in+trypanosomatidae+-+new+data+and+views.">Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views.</a> Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).</li><li>Michels, P. A., Hannaert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+kinetoplastid+glycosomes.">The evolution of kinetoplastid glycosomes.</a> J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).</li><li>Hannaert, V., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+function,+and+biogenesis+of+glycosomes+in+kinetoplastida.">Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida.</a> J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).</li><li>Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmentally+regulated+glycosome+protein+composition+in+the+african+trypanosome.">Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome.</a> Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).</li><li>Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomics+of+glycosomes+from+bloodstream+form+and+procyclic+culture+form+Trypanosoma+brucei+brucei.">Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei.</a> Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).</li><li>Opperdoes, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentation+of+carbohydrate+metabolism+in+trypanosomes.">Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes.</a> Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).</li><li>Kessler, P. S., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+role+of+compartmentation+of+glycolysis+in+procyclic+form+Trypanosoma+brucei:+RNA+interference+studies+of+PEX14,+hexokinase,+and+phosphofructokinase.">Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).</li><li>Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+trypanosomatids:+adaptation+to+available+carbon+sources.">Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources.</a> Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).</li><li>Coustou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-induced+remodeling+of+intermediary+and+energy+metabolism+in+procyclic+Trypanosoma+brucei.">Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei.</a> The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).</li><li>Lamour, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+metabolism+in+procyclic+Trypanosoma+brucei+is+down-regulated+in+the+presence+of+glucose.">Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).</li><li>Vertommen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+glycosomal+and+mitochondrial+proteins+in+the+two+major+life-cycle+stages+of+Trypanosoma+brucei.">Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei.</a> Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).</li><li>Vickerman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+cycles+and+biology+of+pathogenic+trypanosomes.">Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes.</a> British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).</li><li>Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongation+and+clustering+of+glycosomes+in+Trypanosoma+brucei+overexpressing+the+glycosomal+Pex11p.">Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p.</a> The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).</li><li>Saveria, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+PEX19-binding+motifs+required+for+protein+targeting+to+mammalian+peroxisomal+and+trypanosome+glycosomal+membranes.">Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes.</a> Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).</li><li>Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+trypanosomatid+PEX19:+functional+characterization+reveals+impact+on+cell+growth+and+glycosome+size+and+number.">Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number.</a> Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).</li><li>Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+Trypanosoma+cruzi's+glycosomal+adenylate+kinase+containing+a+peroxisomal+targeting+signal.">Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal.</a> Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).</li><li>Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+peroxisomal+compartment+in+living+mammalian+cells:+dynamic+behavior+and+association+with+microtubules.">Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules.</a> The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).</li><li>Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+maintenance+of+mammalian+peroxisomes+involves+a+de+novo+PEX16-dependent+pathway+from+the+ER.">The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER.</a> The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).</li><li>Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+endoplasmic+reticulum+to+peroxisome+formation.">Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation.</a> Cell. 122, 85-95 (2005).</li><li>Furuya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+is+toxic+to+glycosome-deficient+trypanosomes.">Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Glycosomes הם אברונים חיוניים, דינמיים, טפיל ספציפי. התהליכים המסדירים את קיום חיים, תחזוקה, השגשוג והשיפוץ של אברונים אלה צפויים לכלול יעדי תרופה שניתן לנצל למטרות טיפוליות. למרות פוטנציאל גבוה השפע של מטרות תרופה כזו, תחום glycosome biogenesis מפגר אחרי המחקר של תהליכים דומים באו...

Trypanosoma brucei גורם מחלה אפריקה שינה בבני אדם ומחלה ממארת, nagana, בבקר. תרופות המשמשות לטיפול במחלות אלה הן מיושנות ורעילים ביותר, חיסונים אינם זמינים, ואת הפוטנציאל לפיתוח עמידות לתרופה מחייב חיפוש אחר מטרות תרופה חדשות 1. במהלך מחזור החיים שלה, ט brucei, מתחלף בין וקטור חרקים ומארח של יונקים; שני צבאות המציגים סביבות שונות מאוד שבו הטפיל חייב לשרוד. מספר השינויים מטבוליים ומורפולוגיים להתרחש כטפיל חשוף לתנאים סביבתיים שונים. חלק מהשינויים הדרמטיים ביותר שנצפו בmicrobodies הספציפי טפיל חד-מתוחם קרום, מכונה glycosomes 13. רמות הגלוקוז גבוהות יחסית (~ 5 מ&quot;מ) בזרם הדם וטפילי דם (BSF) לייצר ATP באופן בלעדי דרך ש&quot;ש גליקוליזהחילוף חומרים במיטוכונדריה ile מודחק 14. בניגוד לאאוקריוטים אחרים בי הגליקוליזה מתרחשת בציטופלסמה, ט brucei ממדר את רוב אנזימי glycolytic בglycosomes 14,15. הטפילים נתפסים על ידי זבוב tsetse במהלך bloodmeal וחווים ירידה ברמת סוכר, שנופלת לרמות בלתי ניתנות לגילוי בתוך 15 דקות מנטילה על ידי הזבוב. חילוף החומרים של חרק, צורת procyclic (PCF), טפילים הוא גמישה יותר וגלוקוז, וכן חומצות אמינו כגון פרולין, ניתן להשתמש בסינתזה של ATP 16-18. מחקרי proteomic השוואתיים לגלות שינויי מחזור חיים תלויים בglycosomal וחלבוני המיטוכונדריה עם חלבוני glycolytic גדלו בטפילי דם וחלבוני המיטוכונדריה מעורבים במחזור TCA ושרשרת הנשימה 13,19. בעוד שמחקרים רבים התמקדו בהבדלים בין BSF וglycosomes PCF, מעט מאוד ידוע על השינויים בglycosomes PCF המתרחשים בתגובה לenvשינויי ironmental. במעי האחורי של הזבוב, רמות הגלוקוז נמוכות עם עליות חולפות במהלך האכלה 20. ברוב בניסויים במבחנה, טפילי PCF גדלים בתקשורת המכילה גלוקוז. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי שינויי חילוף חומרים PCF באופן משמעותי בתגובה לגלוקוז זמינות 17. בהעדר של גלוקוז, ספיגת פרולין וגידול פעילות dehydrogenase פרולין 18. שינוי בחילוף החומרים במיטוכונדריה זה סביר מלווה בשינוי בהרכב glycosome ומורפולוגיה, עם זאת, זה לא העריך באופן ישיר. אלקטרונים ומיקרוסקופ פלואורסצנטי הם טכניקות נפוצות בשימוש ללמוד דינמיקת glycosome בט brucei 2,21-24. פרוטוקולים אלה הם זמן ועבודה אינטנסיבית, יקרה, וקשה להסתגל ללימודים בזמן אמת ופרוטוקולי תפוקה גבוהה. כדי להתגבר על מגבלה זו, מערכת כתב ניאון-אברון uSED ללמוד האברונים במערכות יונקים ושמרים כבר שונה לשימוש בט brucei 12. מערכות כתב הניאון-אברון נעשו שימוש נרחב באאוקריוטים גבוהים יותר כמו שמרים, צמח, ותאי יונקים 25-27. במערכות כאלה, חלבון פלואורסצנטי הוא התמזגו לרצף חומצות אמינו שמכוון את החלבון לאברונים ספציפיים. השפלה או הסינתזה של החלבונים הממוקדים נמדדה באמצעות הקרינה ושינויים בהרכב אברון באים לידי ביטוי בשינויים בקרינה סלולארי. כאשר מסגרת הקריאה הפתוחה של חלבון משופר צהוב ניאון (EYFP) הוא התמזגה לרצף מיקוד peroxisomal הסוג II (PTS2) 12, חלבון PTS2eYFP מיובא לglycosomes בוגר, יבוא ומוסמך וקרינה יכולה להיות במעקב באמצעות cytometry זרימה. וריאציות בglycosome הרכב באות לידי ביטוי בשינויים בקרינה סלולרית. מערכת זו יכולה לסייע בResolוינג המנגנונים המווסתים את השינויים הנגרמים לסביבה בglycosome הרכב. כתב יד זה מתאר את הדור של מערכת כתב glycosome בטפילי PCF בשיתוף עם cytometry הזרימה לעקוב אחר דינמיקת glycosome בזמן אמת בטפילים בשידור חיים ומספק דוגמא לאופן שנעשה בו שימוש כדי לעקוב אחר שינויים בglycosome הרכב בתגובה לסביבות שונות. לסיכום, glycosome הרכב מושפע מריכוזי גלוקוז תאיים והמעבר של תרבויות log-שלב לתקשורת טרי מעוררת שינויים בglycosome הרכב. מערכת זו יכולה להיות שונה כדי ללמוד את ההתנהגות הדינמית של אברונים אחרים בtrypanosomes וטפילים אחרים.

<table><tbody><tr><td>Adenosine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A10781</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A15804</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>CalBiochem</td><td>1820</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>p-Aminobenzoic acid</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102569</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x)</td><td>Sigma</td><td>B6891</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Fisher</td><td>BP232-1</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>VWR</td><td>BDH0224</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-100</td><td>Cytomix ingredient</td></tr><tr><td>EZNA Gel Extraction kit</td><td>Omega Biotek</td><td>D2500-01</td><td>DNA purifiation</td></tr><tr><td>Research grade Serum</td><td>Fisher</td><td>03-600-511</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Folic acid</td><td>ICN Biomedicals</td><td>101725</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Glucosamine HCl</td><td>ICN Biomedicals</td><td>194671</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>GIBCO</td><td>15023-021</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>CalBiochem</td><td>3520</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Acros Organics</td><td>Ac15892-0010</td><td>Freezing media</td></tr><tr><td>Graces insect cell media powder</td><td>GIBCO</td><td>11300-043</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Hemin</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Guanosine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A11328</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td>Cytomix ingredient</td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Fisher</td><td>BP388-100</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>MEM Amino Acids (50x)</td><td>Cellgro</td><td>25-030-CI</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>NEAA Mixture (100x)</td><td>Lonza</td><td>13-114E</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>10-010-CM</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Sodium biocarbonate</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin Solution</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Phenylalanine</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102623</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>Cytomix ingredient</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td><td>Fisheer</td><td>P290-212</td><td>Cytomix ingredient</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Fisher</td><td>BP392-100</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Acros Organics</td><td>56-45-1</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Pyruvic acid, sodium salt</td><td>Acros Organics</td><td>113-24-6</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Taurine</td><td>TCI America</td><td>A0295</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Acros Organics</td><td>72-19-5</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>ICN Biomedicals</td><td>103183</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Cycle Pure kit</td><td>Omega Biotek</td><td>D6492-02</td><td>DNA purification</td></tr><tr><td>Binding buffer</td><td>Omega Biotek</td><td>PDR041</td><td>DNA purification</td></tr><tr><td>SPW wash buffer</td><td>Omega Biotek</td><td>PDR045</td><td>DNA purification</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell</td><td>Biorad</td><td>165-2660</td><td>Trypanosome transformation</td></tr><tr><td>4 mm Electroporation cuvettes</td><td>VWR</td><td></td><td>Trypanosome transformation</td></tr></tbody></table>

using fluorescent proteins to monitor glycosome dynamics in the african trypanosome

Trypanosoma brucei הוא טפיל kinetoplastid שגורם trypanosomiasis אדם אפריקאי (HAT), או מחלת שינה, ומחלה ממארת, nagana, בבקר 1. חלופות הטפיל בין זרם הדם של המארח של היונקים ווקטור זבוב tsetse. הרכב רב אברונים תאיים משתנה בתגובה לתנאים תאיים השונים אלה 2-5. Glycosomes הוא peroxisomes מאוד מיוחד שבו רב של האנזימים המעורבים בגליקוליזה הם ממודרים. Glycosome שינויי הרכב באופן התפתחותי ומוסדר לסביבה 4-11. נכון לעכשיו, את הטכניקות הנפוצות ביותר בשימוש ללמוד glycosome דינמיקה הן מיקרוסקופ אלקטרונים וקרינה; טכניקות שאינן יקר, זמן והעבודה אינטנסיבית, ולא בקלות הסתגל לתפוקה גבוהה מנתח. כדי להתגבר על מגבלות אלה, מערכת כתב ניאון-glycosome בשהגדל חלבון צהוב ניאון (EYFP) הוא התמזגה לרצף peroxisome מיקוד (PTS2), המכוון את חלבון ההיתוך לglycosomes 12, כבר נקבע. על היבוא של חלבון היתוך PTS2eYFP, glycosomes הפך ניאון. השפלה אברון ותוצאות מחזור בהפסד של הקרינה שניתן למדוד על ידי cytometry זרימה. מספר גדול של תאים (5,000 תאים / sec) ניתן לנתח בזמן אמת ללא הכנת מדגם נרחבת כגון קיבעון והרכבה. שיטה זו מציעה דרך מהירה לזיהוי שינויים בהרכב אברון בתגובה לתנודות בתנאים סביבתיים.

במערכת זו, שינוי גלוקוז תלוי בglycosome הרכב נצפה. כאשר תאים גדלים בתקשורת המכילה גלוקוז, שתי אוכלוסיות הם נצפו; בהיר אחד ועמום אחד (איור 2 א). תאים עמומים נמל glycosomes לא בוגר, אשר אינו מיובאים PTS2eYFP תוך תאים בהירים נמל תערובת של glycosomes הבוגר והבשל 12. כאשר גלוקוז נ?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome at JoVE.com

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

שימוש בחלבוני ניאון כדי לפקח Dynamics Glycosome בTrypanosome האפריקאי

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

using-fluorescent-proteins-to-monitor-glycosome-dynamics-african

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.9K Views.  Clemson University Eukaryotic Pathogens Innovation Center. Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Video: Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3. CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. Thus, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny are endowed with half the number of carboxyfluorescein-tagged molecules and thus each cell division can be assessed by measuring the corresponding decrease in cell fluorescence via Flow cytometry. The capacity of CFSE to label lymphocyte populations with a high fluorescent intensity of exceptionally low variance, coupled with its low cell toxicity, make it an ideal dye to measure cell division. Since it is a fluorescein-based dye it is also compatible with a broad range of other fluorochromes making it applicable to multi-color flow cytometry. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes for the purpose of monitoring up to 8 cell divisions. These labeled cells can be used both for in vitro and in vivo studies.

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. As such, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny have half the amount of fluorescence, which can thereby be used to assess cell division. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes with CFSE.

השימוש Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl אסתר (CFSE) לפקח הפצת הלימפוציטים

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3.  CFSE covalently labels long-lived ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

Assay חזותי לפקח תחרות קטריאלי T6SS בתיווך

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal infection, the virus can infect and replicate in the developing brain, which may induce severe neurological damage, including deafness and mental retardation. Despite the potential severity of the symptoms, the therapeutic options are limited by the unavailability of a vaccine and the absence of a specific antiviral therapy. Furthermore, a precise description of the molecular events occurring during infection of the central nervous system (CNS) is still lacking since observations mostly derive from the autopsy of infected children. Several animal models, such as rhesus macaque CMV, have been developed and provided important insights into CMV pathogenesis in the CNS. However, despite its evolutionary proximity with humans, this model was limited by the intracranial inoculation procedure used to infect the animals and consistently induce CNS infection. Furthermore, ethical considerations have promoted the development of alternative models, among which neonatal infection of newborn mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) has recently led to significant advances. For instance, it was reported that intraperitoneal injection of MCMV to Balb/c neonates leads to infection of neurons and glial cells in specific areas of the brain. These findings suggested that experimental inoculation of mice might recapitulate the deficits induced by HCMV infection in children. Nevertheless, a dynamic analysis of MCMV infection of neonates is difficult to perform because classical methodology requires the sacrifice of a significant number of animals at different time points to analyze the viral burden and/or immune-related parameters. To circumvent this bottleneck and to enable future investigations of rare mutant animals, we applied in vivo imaging technology to perform a time-course analysis of the viral dissemination in the brain upon peripheral injection of a recombinant MCMV expressing luciferase to C57Bl/6 neonates.

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV) infection of neonates represents an important cause of mental retardation, yet the molecular events leading to virus-induced pathogenesis are still poorly understood. To investigate the dynamics of brain infection, we adapted whole-animal in vivo imaging to perform time-course analysis of neonates infected with a luciferase-recombinant virus.

שימוש<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה למעקב אחר ההתקדמות של זיהום ציטומגלווירוס עכבר ניסיוני בילודים

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

הדמיה פליטת אור כדי לזהות זיהום בשלב מאוחר של מחלת השינה

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

תפוקה גבוהה ג&#39;ין תיוג ב<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. Maintenance of proteasome activity was implicated in many key cellular processes, like cell's stress response 3, cell cycle regulation and cellular differentiation 4 or in immune system response 5. The dysfunction of the ubiquitin-proteasome system has been related to the development of tumors and neurodegenerative diseases 4, 6. Additionally, a decrease in proteasome activity was found as a feature of cellular senescence and organismal aging 7, 8, 9, 10. Here, we present a method to measure ubiquitin-proteasome activity in living cells using a GFP-dgn fusion protein. To be able to monitor ubiquitin-proteasome activity in living primary cells, complementary DNA constructs coding for a green fluorescent protein (GFP)&#x2013;dgn fusion protein (GFP&#x2013;dgn, unstable) and a variant carrying a frameshift mutation (GFP&#x2013;dgnFS, stable 11) are inserted in lentiviral expression vectors. We prefer this technique over traditional transfection techniques because it guarantees a very high transfection efficiency independent of the cell type or the age of the donor. The difference between fluorescence displayed by the GFP&#x2013;dgnFS (stable) protein and the destabilized protein (GFP-dgn) in the absence or presence of proteasome inhibitor can be used to estimate ubiquitin-proteasome activity in each particular cell strain. These differences can be monitored by epifluorescence microscopy or can be measured by flow cytometry.

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

A method to monitor ubiquitin-proteasome activity in living cells is described. A degron-destabilized GFP- (GFP-dgn) and a stable GFP-dgnFS fusion protein are generated and transduced into the cell using a lentiviral expression vector. This technique allows to generate a stable GFP-dgn/GFP-dgnFS expressing cell line in which ubiquitin-proteasome activity can be easily assessed using epifluorescence or flow cytometry.

ניטור של פעילות יוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים באמצעות ערער-חלבון Degron (DGN) ירוק פלורסנט חלבון (GFP)-מבוסס כתב

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Biology

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

פיתוח חיישן מבוסס pHluorin2 עבור pH גליקוזומלי ב Trypanosoma brucei

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. Little is known about the cellular responses generated when environmental glucose levels change. In both bloodstream and procyclic form (insect stage) parasites, glycosomes house most of glycolysis. These organelles are rapidly acidified in response to glucose deprivation, which likely results in the allosteric regulation of glycolytic enzymes such as hexokinase. In previous work, localizing the chemical probe used to make pH measurements was challenging, limiting its utility in other applications.
This paper describes the development and use of parasites that express glycosomally localized pHluorin2, a heritable protein pH biosensor. pHluorin2 is a ratiometric pHluorin variant that displays a pH (acid)-dependent decrease in excitation at 395 nm while simultaneously yielding an increase in excitation at 475 nm. Transgenic parasites were generated by cloning the pHluorin2 open reading frame into the trypanosome expression vector pLEW100v5, enabling inducible protein expression in either lifecycle stage. Immunofluorescence was used to confirm the glycosomal localization of the pHluorin2 biosensor, comparing the localization of the biosensor to the glycosomal resident protein aldolase. The sensor responsiveness was calibrated at differing pH levels by incubating cells in a series of buffers that ranged in pH from 4 to 8, an approach we have previously used to calibrate a fluorescein-based pH sensor. We then measured pHluorin2 fluorescence at 405 nm and 488 nm using flow cytometry to determine glycosomal pH. We validated the performance of the live transgenic pHluorin2-expressing parasites, monitoring pH over time in response to glucose deprivation, a known trigger of glycosomal acidification in PF parasites. This tool has a range of potential applications, including potentially being used in high-throughput drug screening. Beyond glycosomal pH, the sensor could be adapted to other organelles or used in other trypanosomatids to understand pH dynamics&#160;in the live cell setting.

מחבר זרקור: התקדמות בניטור pH גליקוזומלי ב Trypanosoma brucei באמצעות pHluorin2 Biosensor

We describe a method to study how pH responds to environmental cues in the glycosomes of the bloodstream form of African trypanosomes. This approach involves a pH-sensitive heritable protein sensor in combination with flow cytometry to measure pH dynamics, both as a time-course assay and in a high-throughput screen format.

מדידת שינויי pH גליקוזומליים דינמיים בטריפנוזומה ברוסי חי

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

שימוש בחלבוני ניאון כדי לפקח Dynamics Glycosome בTrypanosome האפריקאי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

השימוש Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl אסתר (CFSE) לפקח הפצת הלימפוציטים

Assay חזותי לפקח תחרות קטריאלי T6SS בתיווך

שימוש

הדמיה פליטת אור כדי לזהות זיהום בשלב מאוחר של מחלת השינה

תפוקה גבוהה ג'ין תיוג ב

ניטור של פעילות יוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים באמצעות ערער-חלבון Degron (DGN) ירוק פלורסנט חלבון (GFP)-מבוסס כתב

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

מדידת שינויי pH גליקוזומליים דינמיים בטריפנוזומה ברוסי חי

מדידת שינויי pH גליקוזומליים דינמיים בטריפנוזומה ברוסי חי

מדידת שינויי pH גליקוזומליים דינמיים בטריפנוזומה ברוסי חי