This work was funded by the Creative Inquiry Program for Undergraduate Research and the Calhoun Honors College at Clemson University.

1. Allgemeine Trypanosom Haltung <ol><li> Wiegen Feststoffe zur Herstellung SDM79 Medien (Tabelle 1). </li><li> Lagerung bei 4 ° C in 50 ml konischen oder einem Plastikbeutel. HINWEIS: Die Reagenzien sind für mindestens 6 Monate stabil. </li><li> Auftau fötalem Rinderserum (FBS) in einem 37 ° C Wasserbad und periodisch mischen durch Umkehrung. HINWEIS: FBS wird vom Lieferanten als sterile Lösung erhalten. Filtersterilisieren FBS verringert seine Fähigkeit, das Wachstum des Parasiten zu unterstützen. </li><li> Sobald die gesamte Flasche aufgetaut, Hitze inaktiviert Serum für 30 min in einem 56 ° C Wasserbad, periodisch Mischen, um eine Ausfällung von Serumkomponenten zu minimieren. </li><li> Tauwetter Penicillin / Streptomycin-Lösung (Pen / Strep), Hämin (2 mg / ml in 50 mM NaOH) und Grundmedium Adler Vitamin-Lösung bei Raumtemperatur. </li><li> Um einen 1.000 ml-Messzylinder, fügen 20,2 g SDM79 Feststoffe (Tabelle 1) mit den flüssigen Komponenten (Tabelle 2) und gut mischen auf einer Rührplatte. </li><li> PH-Wert auf 7,35 und das Volumen auf 850 ml mit Wasser. </li><li> Filter sterilisieren Medien, indem ein Vakuumschlauch an der Unterseite des Filterflasche. Ziehe Vakuum bis die Lösung filtriert. </li><li> Filter entfernen oben in der biologischen Sicherheitsschrank und fügen Sie 150 ml hitzeinaktiviertem FBS. Kunststoffabdeckung entfernen aus sterilen Kappe und Dichtung Medien Flasche. </li><li> Vorbereitung SDM80 Medien in der gleichen Weise wie SDM79 mit folgenden Ausnahmen; nicht Glucose oder Glucosamin hinzufügen und MEM ohne Glutamin. Anstelle von 150 ml hitzeinaktiviertem FBS, fügen Sie 135 ml dialysiert, Hitze inaktiviert FBS und 15 ml hitzeinaktiviertem FBS. </li><li> Kultur PCF Parasiten in 25 cm 2-Kolben mit 10 ml geeigneten Medium bei 27 ° C und 5% CO 2. Hinweis: Zellen sollten täglich mit einer Zählkammer und mit einem Durchflusszytometer gezählt werden (siehe Abschnitt 6) und Kulturen sind bei Dichten zwischen 1 x 10 5 und 5 x 10 6 Zellen / ml gehalten werden. </li></ol> 2. Transfection von PCF Parasiten mit dem fluoreszierenden Reporterkonstrukt HINWEIS: Um glycosome Dynamik zu folgen, ein Reporterprotein, das die peroxisomale Targeting-Sequenz (PTS2) von Aldolase zu mehr gelb fluoreszierenden Protein fusioniert ist in den Parasiten ausgedrückt. Die Sequenz für das Fusionsprotein kodiert, in pXS2bla 12, die den procyclin Promotor und die Tubulin intergenen Regionen, die direkt homologe Rekombination in das Genom und die Blasticin Resistenzgen zur Selektion enthält, kloniert. Prozyklischen Zelllinien, die Gene beherbergen, die T7-Polymerase und Tetracyclin-Repressor (PF29-13) kodieren, sind mit dem Targeting-Konstrukt, pXS2 verwandelt: PTS2eYFP. <ol><li> Bereiten cytomix durch Mischen der in Tabelle 3 aufgeführten Komponenten. Filter sterilisieren und lagern bei RT. </li><li> Linearisieren von Plasmid-DNA mit MluI durch Pipettieren von 10 ul DNA (1 ug / ul), 5 ul Restriktionsenzym-Puffer, 33 ul Wasser und 2 μL MluI Enzyms in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Reinige den Restriktionsverdau durch Zugabe von 1 Volumen von Bindungspuffer zu dem Restriktionsenzym-Verdau. Mischen Bindungspuffer und verdauten DNA durch Verwirbelung. Kurz zentrifugieren, um die Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln. </li><li> Legen Sie eine DNA-bindende Säule in ein 2 ml-Sammelröhrchen, und Übertragung verdaute DNA / Bindungspufferlösung Spalte. </li><li> Zentrifuge für 10.000 g für 1 min. Nach der Zentrifugation verworfen Filtrat von Sammelröhrchen und gibt die Spalte an die Sammelröhrchen. </li><li> Fügen Sie 700 ul Waschpuffer SPW und Zentrifuge bei 10.000 g für 1 min. </li><li> Verwerfen Filtrat von Sammelröhrchen, kehren die Spalte an die Sammelröhrchen und wiederholen SPW Waschschritt und Zentrifugieren. </li><li> Verwerfen Filtrat, Rück Spalte Sammelröhrchen und Zentrifuge leere Spalte für 3 min bei 10.000 × g Rest Ethanol zu entfernen. </li><li> In einer biologischen Sicherheitsschrank, wegwerfen colwahl Rohr und Ort Spalte in einem sterilen Reaktionsgefäß. </li><li> Zur Elution der DNA, fügen Sie 25 ul sterilem Wasser auf Spalte und bei Raumtemperatur für 2 min. Zentrifugieren bei 10000 × g für 1 min. </li><li> Fügen Sie weitere 25 ul sterilem Wasser in biologischen Sicherheit Haube Spalte und bei Raumtemperatur für 2 min. </li><li> Zentrifugieren bei 10.000 × g für 1 min. </li><li> In einer biologischen Sicherheitsschrank übertragen gesamte Volumen der DNA auf eine neue sterile Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Dieser Schritt verhindert die Kontamination von der offenen Deckel während der Zentrifugation. </li><li> Hinzufügen des sterilen, gereinigt linearisierte DNA (10 ug) in 400 ul sterilfiltriert cytomix. </li><li> Zählen von Zellen, wie in Abschnitt 6 durch Zentrifugation bei 800 g für 15 min bei RT beschrieben und ernten 5 x10 7 -10 8 Zellen. </li><li> Überstand abgießen und Zellpellet in 450 ul DNA + cytomix mit einer 1 ml serologische Pipette. </li><li> Transfer-Lösung enthält ce<html> lls, DNA und cytomix in ein steriles Abstand von 4 mm Küvette und Ort in der Küvette Elektroporationskammer. </li><li> Wählen Sie &quot;exponentiellen Abfall&quot; und geben Sie manuell die folgenden Einstellungen: Spannung: 1,5 kV, Kapazität: 25 mF, Widerstand: Ω und Küvette: 4 mm. Drücken Puls. Sobald der Impuls beendet ist, entfernen Küvette aus dem Elektroporationskammer und zum Biosicherheitswerkbank. </li><li> In eine neue sterile Flasche, Pipette 10 ml SDM79. Übertragen der transformierten Zellen in den Kolben mit 10 ml SDM79. </li><li> Inkubieren ohne Arzneimittel Selektion für 24 h bei 27 ° C, 5% CO 2. Nach 24 Stunden hinzu G418 (15 ug / ml), Hygromycin (50 ug / ml) und Blasticidin (10 ug / ml). Pass 1 ml transformierten Zellen mit Drogen in 9 ml SDM79 mit Drogen. </li><li> Analysieren Sie die Zellen täglich, wie in Abschnitt 6 und 7. Wenn Zellen fluoreszierende sind beschrieben und haben eine Zelldichte von 1 x 10 7 / ml erreicht, stellen stabilates für die Langzeitspeicherung (3.1-3.3). </li></ol>ve_title &quot;&gt; 3. Erstellen Stabilates <ol><li> Um das Einfrieren Medien, ein gleiches Volumen von 100% Glycerin zu cytomix und Filter sterilisieren. </li><li> Geben Sie 200 ul des Einfrierens Medien bis 800 ul von Zellen (1 x 10 7) in einem Kryoröhrchen, vorsichtig mischen und Inversion zwischen zwei Styropor-Racks und frieren bei -80 ° C. </li><li> Einmal gefroren (~ 24 h), Transfer Zellen in flüssigen Stickstoff. HINWEIS: Es ist wichtig, Zellen in LN 2 nach 24 h bei -80 bewegen, wie eine längere Lagerung ° C führt zu einer Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen. </li></ol> 4. Auftauen Aktien <ol><li> Entfernen gefrorenen Ampulle von -80 ° C und Auftauen bei Raumtemperatur für etwa 10 min. </li><li> Pipette 9 ml SDM79 mit Drogen in eine neue sterile Flasche. Fügen Sie aufgetauten Zellen zu diesen Kolben. Geben Zellen 1:10 Zugabe von 1 ml dieser Kultur in 9 ml SDM79 in einen neuen Kolben (Endkonzentration von 1 x 10 5 / ml). </li><li> Bevor die Zellen eine Dichte von 10 7 / ml erreichen, beginnen Durchflusszytometer eingestelltund Verdünnungsanalysen. </li></ol> 5. Durchflusszytometer-Setup <ol><li> Schalten Sie das Durchflusszytometer und CFlow Plus-Programm zu öffnen. HINWEIS: Bevor Sie irgendwelche Proben sollten die Fluidik gemäß den Schritten 5,2-5,7 rückgespült und ausgespült werden. </li><li> Ersetzen Sie den Schlauch von Nanopure Wasser, in dem die SIP ist mit einem Leerrohr gespeichert. </li><li> Wählen Sie die &quot;Rückspülung&quot;-Taste. </li><li> Nach Rückspülung abgeschlossen ist, entfernen Mikrozentrifugenröhrchen von Schluck und entsorgen. </li><li> Legen Sie eine neue Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml neuen nanoreinem Wasser auf dem Schluck. </li><li> Wählen Sie einen neuen Brunnen in CFlow Programm. Unter &quot;Ausführen Limits&quot; eingestellte Zeit für 2 min. Unter &quot;Fluidtechnik&quot; wählen Sie &quot;schnell&quot; und &quot;Ausführen&quot;. </li><li> Sobald die 2 min Frist abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Löschen Beispieldaten&quot;. </li></ol> 6. Zellzählung mit dem Durchflusszytometer <ol><li> Wasser zu ersetzen mit der Probe, die gezählt werden. Set &quot;Führen Limits &quot;bis 30 Sekunden&quot;, Fluidik &quot;auf&quot; schnell &quot;und wählen Sie dann&quot; Ausführen &quot;. </li><li> Nach Ablauf der 30 Sekunden Frist abgeschlossen ist, CFlow Plus wird die Ereignisse / ul unter &quot;Last Run&quot;. Zahl für jede Kultur Wiederholen bieten. HINWEIS: Bevor Zellen erreichen 1 x 10 7 Zellen / ml, fahren Sie mit Verdünnungsanalyse. Zellen sollten nicht fort nach einer Verdünnungsanalyse abgeschlossen ist. Zellen für längere Zeiträume kultiviert verlieren ihre Fähigkeit, sich an Umweltbedingungen zu reagieren. </li></ol> 7. Messung der Fluoreszenz mit dem Durchflusszytometer <ol><li> , Um die Fluoreszenz zu beurteilen, setzen Sie &quot;Run Limits&quot; zu 10.000 Ereignisse und &quot;Fluidtechnik&quot; auf &quot;langsam&quot;. Wählen Sie &quot;Schwelle&quot;. Unter &quot;Primary Threshold&quot;, wählen Sie &quot;dauerhaft zu beseitigen Veranstaltungen&quot;, &quot;FSC-H&quot; (in Drop-Down-Box) und geben Sie weniger als 30.000. Klicken Sie auf &quot;Übernehmen&quot; und dann auf &quot;Schließen&quot;. </li><li> Wählen Sie die220; Histogramm &quot;-Taste in einem der neuen Plot-Fenster und wählen Sie&quot; FSC-A &quot;aus der Dropdown-Liste, wählen Sie&quot; FL1-A &quot;. HINWEIS: FL1-A Maßnahmen Fluoreszenz in der 530 nm Wellenlänge. </li><li> Wählen Sie &quot;Ausführen&quot; und wiederholen Sie für alle Kulturen. </li><li> Führen Sie die Reinigungslösung durch die Fluidik Linie für 2 Minuten und Wasser für 2 min. </li></ol> 8. Verdünnungsanalysen <ol><li> Geben Zellen auf eine Dichte von 1 x 10 5 Zellen / ml in 3 ml SDM79 in einer 25 cm 2 Kulturflasche und Messen Fluoreszenz unmittelbar nach Durchgang und dann 3 Stunden und 24 Stunden. </li></ol> 9. Datenanalyse <ol><li> Wählen Sie &quot;Analysieren&quot; Vorsprung auf CFlow Plus an. </li><li> Klicken Sie wird &quot;Histogramm&quot; unter &quot;Machen Sie eine neue Handlung.&quot; Wählen einer Dropdown-Liste &quot;FSC-A&quot; und erscheinen. Wählen Sie den Kanal &quot;FL1-A.&quot; </li><li> Markieren Sie eine gut zu analysieren. Wählen Sie &quot;Gate&quot;-Taste und manuell zeichnen eine Gate-für die Bevölkerung von Interesse. </li><li> Flow Plus liefert Zelle &quot;Count&quot; in diesem Tor und &quot;% dieser Plot&quot;. </li></ol>

<ol>
	<li>Stuart, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetoplastids:+related+protozoan+pathogens,+different+diseases.">Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases.</a> J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).</li><li>Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+glycosomes+during+life-cycle+differentiation+of+Trypanosoma+brucei.">Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei.</a> Autophagy. 4, 294-308 (2008).</li><li>Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+related+processes+in+trypanosomatids:+insights+from+genomic+and+bioinformatic+analyses.">Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses.</a> Autophagy. 2, 107-118 (2006).</li><li>Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+functions+of+glycosomes+in+trypanosomatids.">Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids.</a> Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).</li><li>Michels, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomes,+glyoxysomes+and+glycosomes+(review).">Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review).</a> Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).</li><li>Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+peroxisomes+and+glycosomes:+trypanosomatid+glycosome+assembly+is+a+promising+new+drug+target.">Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).</li><li>Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+function+of+peroxisomes+and+glycosomes.">Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes.</a> Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).</li><li>Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosomes:+parasites+and+the+divergence+of+peroxisomal+purpose.">Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose.</a> Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).</li><li>Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+aspects+of+glycosomes+in+trypanosomatidae+-+new+data+and+views.">Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views.</a> Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).</li><li>Michels, P. A., Hannaert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+kinetoplastid+glycosomes.">The evolution of kinetoplastid glycosomes.</a> J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).</li><li>Hannaert, V., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+function,+and+biogenesis+of+glycosomes+in+kinetoplastida.">Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida.</a> J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).</li><li>Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmentally+regulated+glycosome+protein+composition+in+the+african+trypanosome.">Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome.</a> Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).</li><li>Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomics+of+glycosomes+from+bloodstream+form+and+procyclic+culture+form+Trypanosoma+brucei+brucei.">Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei.</a> Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).</li><li>Opperdoes, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentation+of+carbohydrate+metabolism+in+trypanosomes.">Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes.</a> Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).</li><li>Kessler, P. S., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+role+of+compartmentation+of+glycolysis+in+procyclic+form+Trypanosoma+brucei:+RNA+interference+studies+of+PEX14,+hexokinase,+and+phosphofructokinase.">Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).</li><li>Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+trypanosomatids:+adaptation+to+available+carbon+sources.">Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources.</a> Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).</li><li>Coustou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-induced+remodeling+of+intermediary+and+energy+metabolism+in+procyclic+Trypanosoma+brucei.">Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei.</a> The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).</li><li>Lamour, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+metabolism+in+procyclic+Trypanosoma+brucei+is+down-regulated+in+the+presence+of+glucose.">Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).</li><li>Vertommen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+glycosomal+and+mitochondrial+proteins+in+the+two+major+life-cycle+stages+of+Trypanosoma+brucei.">Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei.</a> Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).</li><li>Vickerman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+cycles+and+biology+of+pathogenic+trypanosomes.">Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes.</a> British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).</li><li>Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongation+and+clustering+of+glycosomes+in+Trypanosoma+brucei+overexpressing+the+glycosomal+Pex11p.">Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p.</a> The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).</li><li>Saveria, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+PEX19-binding+motifs+required+for+protein+targeting+to+mammalian+peroxisomal+and+trypanosome+glycosomal+membranes.">Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes.</a> Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).</li><li>Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+trypanosomatid+PEX19:+functional+characterization+reveals+impact+on+cell+growth+and+glycosome+size+and+number.">Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number.</a> Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).</li><li>Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+Trypanosoma+cruzi's+glycosomal+adenylate+kinase+containing+a+peroxisomal+targeting+signal.">Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal.</a> Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).</li><li>Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+peroxisomal+compartment+in+living+mammalian+cells:+dynamic+behavior+and+association+with+microtubules.">Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules.</a> The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).</li><li>Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+maintenance+of+mammalian+peroxisomes+involves+a+de+novo+PEX16-dependent+pathway+from+the+ER.">The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER.</a> The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).</li><li>Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+endoplasmic+reticulum+to+peroxisome+formation.">Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation.</a> Cell. 122, 85-95 (2005).</li><li>Furuya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+is+toxic+to+glycosome-deficient+trypanosomes.">Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Glykosomen sind unerlässlich, dynamisch, Parasiten-spezifische Organellen. Die Prozesse, die die Biogenese, Wartung, Proliferation und Umbau dieser Organellen regulieren wahrscheinlich auch Wirkstoff-Targets, die für therapeutische Zwecke genutzt werden könnten. Trotz der möglichen hohen Fülle solcher Arzneimitteltargets wurde der Bereich der glycosome Biogenese hinter der Studie von ähnlichen Prozessen in anderen Organismen, hauptsächlich aufgrund des Fehlens eines handhabbaren, Hochdurchsatz-System, mit dem ein...

Trypanosoma brucei führt die afrikanische Schlafkrankheit bei Menschen und ein Wasting Disease, nagana, bei Rindern. Medikamente in der Behandlung dieser Krankheiten verwendet werden, sind veraltet und extrem giftig, Impfstoffe nicht verfügbar sind, und das Potenzial für die Entwicklung von Resistenzen die Suche nach neuer Zielmoleküle 1 erfordert. Während seines gesamten Lebenszyklus, T. brucei, wechselt zwischen einem Insektenvektor und Säugerwirt; zwei Hosts, die sehr unterschiedlichen Umgebungen, in denen der Parasit muss überleben zu präsentieren. Eine Anzahl von metabolischen und morphologischen Veränderungen auftreten, wie der Parasit an verschiedene Umweltbedingungen ausgesetzt. Einige der dramatischsten Veränderungen sind in Single-Membran-Parasiten begrenzt spezifischen Mikrokörper beobachtet, genannt Glykosomen 13. Zuckerspiegel relativ hoch sind (~ 5 mm) in den Blutkreislauf und Blutkreislauf Parasiten (BSF) erzeugen ATP ausschließlich über Glykolyse while mitochondrialen Stoffwechsels unterdrückt wird 14. Im Gegensatz zu anderen Eukaryoten, in der Glykolyse im Zytoplasma, T. auftritt brucei compartmentalizes meisten der glykolytischen Enzyme in Glykosomen 14,15. Die Parasiten werden von der Tsetse-Fliege während einer Blutmahlzeit aufgenommen und erleben Sie einen Tropfen in Glukose, die die Nachweisgrenze innerhalb von 15 Minuten, von der Fliege aufgenommen fällt. Der Metabolismus von Insekten ist procyclischen Form (PCF) Parasiten flexibler und Glucose, sowie Aminosäuren, wie Prolin, kann bei der Synthese von ATP 16-18 verwendet werden. Vergleichsproteomische Studien zeigen, Lebenszyklus abhängigen Veränderungen glycosomalen und mitochondrialer Proteine ​​mit glykolytischen Proteine ​​in Blutkreislauf erhöht und Parasiten mitochondrialen Proteine ​​im TCA-Zyklus und Atmungskette 13,19 beteiligt. Viele Studien haben sich auf die Unterschiede zwischen BSF und PCF Glykosomen konzentriert, ist wenig über die Veränderungen in PCF Glykosomen, die in Antwort auf env kommen bekannteironmental Veränderungen. Im Enddarm der Fliege, Zuckerwerte sind während einer Fütterung mit 20 niedrig vorübergehenden Anstieg. In den meisten in-vitro-Studien werden PCF Parasiten in Medien Glukose gezüchtet. Allerdings haben jüngste Studien gezeigt, dass PCF Stoffwechsel verändert sich signifikant in Reaktion auf Verfügbarkeit 17 Glucose. In Abwesenheit von Glucose, Prolin und Prolin-Aufnahme-Dehydrogenase-Aktivität um 18. Diese Änderung in der mitochondrialen Stoffwechsel wird wahrscheinlich durch eine Änderung der Zusammensetzung und Morphologie glycosome begleitet, hat sich dies jedoch nicht direkt beurteilt. Elektron und Fluoreszenzmikroskopie sind gängige Techniken verwendet werden, um glycosome Dynamik in T. studieren brucei 2,21-24. Diese Protokolle sind Zeit und arbeitsintensiv, teuer und schwierig, um Echtzeit-Studien und Hochdurchsatz-Protokolle anzupassen. Um diese Einschränkung zu überwinden, eine Leuchtstoff-Organellen-Reportersystem uSED Organellen in Säugern und Hefen Systemen Studie zur Verwendung in T. modifiziert worden ist brucei 12. Fluoreszierenden Organellen Reportersysteme sind ausführlich in höheren Eukaryoten, wie Hefe, Pflanzen und Säugerzellen 25-27 verwendet. In solchen Systemen wird ein fluoreszierendes Protein mit einer Aminosäuresequenz, die das Protein zu spezifischen Organellen richtet fusioniert. Der Abbau oder die Synthese der Zielproteine ​​wird durch Fluoreszenz gemessen und Veränderungen in der Organelle Zusammensetzung werden durch Änderungen in der Fluoreszenzzelle reflektiert. Wenn der offene Leserahmen von verbesserten gelb fluoreszierende Protein (eYFP) zu einer Typ-II-peroxisomale Targeting-Sequenz (PTS2) 12 verschmolzen ist, wird die PTS2eYFP Protein zu reifen, Import-und Fluoreszenz zuständigen Glykosomen importiert über Durchflusszytometrie überwacht werden. Variationen in glycosome Zusammensetzung werden durch Veränderungen der zellulären Fluoreszenz wider. Dieses System kann in Resol helfenVing die Mechanismen, die umweltbedingte Veränderungen in glycosome Zusammensetzung regulieren. Diese Handschrift beschreibt die Erzeugung eines glycosome Reportersystem in PCF Parasiten in Verbindung mit Durchflusszytometrie, um Echtzeit glycosome Dynamik in lebenden Parasiten zu überwachen und stellt ein Beispiel, wie es verwendet wurde, um Änderungen in glycosome Zusammensetzung in Abhängigkeit von verschiedenen Umgebungen zu folgen. Zusammenfassend wird glycosome Zusammensetzung durch extrazelluläre Glukosekonzentrationen und der Durchgang von Log-Phase Kulturen beeinflusst in frischem Medium löst Veränderungen im glycosome Zusammensetzung. Das System kann modifiziert werden, um das dynamische Verhalten des anderen Organellen in Trypanosomen und andere Parasiten untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1257">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">Adenosine</td>
			<td style="width:425px;">Avocado Research Chemicals Ltd</td>
			<td style="width:180px;">A10781</td>
			<td style="width:256px;">SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Alanine</td>
			<td>Avocado Research Chemicals Ltd</td>
			<td>A15804</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-arginine</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>1820</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-aminobenzoic acid</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td>102569</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6891</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP232-1</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH0224</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S311-100</td>
			<td>Cytomix ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZNA Gel Extraction kit</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>D2500-01</td>
			<td>DNA purifiation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Research grade Serum</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-600-511</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Folic acid</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td>101725</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucosamine HCl</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td>194671</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15023-021</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>3520</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>Ac15892-0010</td>
			<td>Freezing media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Graces insect cell media powder</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11300-043</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194025</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanosine</td>
			<td>Avocado Research Chemicals Ltd</td>
			<td>A11328</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194025</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td>Cytomix ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-methionine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP388-100</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Amino Acids (50X)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-030-CI</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEAA Mixture (100X)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>13-114E</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimal Essential Medium (1X) with L-glutamine</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-010-CM</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOPS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Biocarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-phenylalanine</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td>102623</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Cytomix ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisheer</td>
			<td>P290-212</td>
			<td>Cytomix ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-proline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP392-100</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-serine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>56-45-1</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyruvic acid, sodium salt</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>113-24-6</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-taurine</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>A0295</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-threonine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>72-19-5</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-tyrosine</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td>103183</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E.Z.N.A.Cycle Pure kit</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>D6492-02</td>
			<td>DNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binding buffer</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>PDR041</td>
			<td>DNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPW wash buffer&#160;</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>PDR045</td>
			<td>DNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gene Pulser Xcell&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>165-2660</td>
			<td>Trypanosome transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 mm electroporation cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Trypanosome transformation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using fluorescent proteins to monitor glycosome dynamics in the african trypanosome

Trypanosoma brucei ist ein Parasit, der Kinetoplastiden afrikanische Trypanosomiasis (HAT) oder Schlafkrankheit, und eine Wasting Disease, nagana verursacht, bei Rindern 1. Der Parasit wechselt zwischen den Blutstrom des Säugerwirt und die Tsetse-Fliege Vektor. Die Zusammensetzung vieler zellulärer Organellen sich in Reaktion auf diese verschiedenen extrazellulären Bedingungen 2-5. Glykosomen sind hochspezialisierte Peroxisomen in denen viele der Enzyme der Glykolyse beteiligt Abteile sind. Glycosome Zusammensetzung Änderungen in einer Entwicklungs-und umwelt geregelt 4-11. Gegenwärtig sind die am häufigsten verwendeten Techniken zum glycosome Dynamikstudie Elektronen und Fluoreszenzmikroskopie; Techniken, die teuer, zeit und arbeitsaufwendig und nicht leicht angepasst, um mit hohem Durchsatz untersucht werden. Um diese Einschränkungen zu, ein fluoreszierendes Reportersystem-glycosome in überwindendie gelb fluoreszierendes Protein (eYFP) verstärkt wird, um eine Peroxisomen-Zielsequenz (PTS2), die das Fusionsprotein an Glykosomen 12 leitet fusioniert, wurde hergestellt. Beim Importieren der PTS2eYFP Fusionsprotein, Glykosomen geworden fluoreszierend. Organell Abbau und Recycling zu einem Verlust der Fluoreszenz, die durch Durchflusszytometrie gemessen werden kann. Eine große Zahl von Zellen (5000 Zellen / sec) in Echtzeit ohne umfangreiche Probenpräparation, wie die Fixierung und Befestigung analysiert werden. Dieses Verfahren bietet einen schnellen Weg, Veränderungen in Organellen Zusammensetzung in Abhängigkeit von schwankenden Umgebungsbedingungen.

In diesem System wurde eine glucoseabhängige Änderung glycosome Zusammensetzung beobachtet. Wenn Zellen in Glucose enthaltenden Medien gezüchtet werden zwei Populationen beobachtet; eine helle und eine dim (Abbildung 2a). Dim Zellen beherbergen unreifen Glykosomen, die nicht importiert haben die PTS2eYFP während helle Zellen beherbergen eine Mischung aus reifen und unreifen Glykosomen 12. Wenn Glukose in den Medien vorhanden ist, ist Fehllokalisation von Proteinen tödliche glycosome <sup...

Watch this Scientific Journal Video about Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome at JoVE.com

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Mit fluoreszierenden Proteinen zu Glycosome Dynamics in der afrikanischen Trypanosomen auf Monitor

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

using-fluorescent-proteins-to-monitor-glycosome-dynamics-african

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.9K Aufrufe.  Clemson University Eukaryotic Pathogens Innovation Center. Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Serie: Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3. CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. Thus, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny are endowed with half the number of carboxyfluorescein-tagged molecules and thus each cell division can be assessed by measuring the corresponding decrease in cell fluorescence via Flow cytometry. The capacity of CFSE to label lymphocyte populations with a high fluorescent intensity of exceptionally low variance, coupled with its low cell toxicity, make it an ideal dye to measure cell division. Since it is a fluorescein-based dye it is also compatible with a broad range of other fluorochromes making it applicable to multi-color flow cytometry. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes for the purpose of monitoring up to 8 cell divisions. These labeled cells can be used both for in vitro and in vivo studies.

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. As such, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny have half the amount of fluorescence, which can thereby be used to assess cell division. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes with CFSE.

Die Verwendung von Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFSE) auf Lymphozyten-Proliferation-Monitor

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3.  CFSE covalently labels long-lived ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

Ein Visual Assay zur T6SS-vermittelte bakterielle Wettbewerb überwachen

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal infection, the virus can infect and replicate in the developing brain, which may induce severe neurological damage, including deafness and mental retardation. Despite the potential severity of the symptoms, the therapeutic options are limited by the unavailability of a vaccine and the absence of a specific antiviral therapy. Furthermore, a precise description of the molecular events occurring during infection of the central nervous system (CNS) is still lacking since observations mostly derive from the autopsy of infected children. Several animal models, such as rhesus macaque CMV, have been developed and provided important insights into CMV pathogenesis in the CNS. However, despite its evolutionary proximity with humans, this model was limited by the intracranial inoculation procedure used to infect the animals and consistently induce CNS infection. Furthermore, ethical considerations have promoted the development of alternative models, among which neonatal infection of newborn mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) has recently led to significant advances. For instance, it was reported that intraperitoneal injection of MCMV to Balb/c neonates leads to infection of neurons and glial cells in specific areas of the brain. These findings suggested that experimental inoculation of mice might recapitulate the deficits induced by HCMV infection in children. Nevertheless, a dynamic analysis of MCMV infection of neonates is difficult to perform because classical methodology requires the sacrifice of a significant number of animals at different time points to analyze the viral burden and/or immune-related parameters. To circumvent this bottleneck and to enable future investigations of rare mutant animals, we applied in vivo imaging technology to perform a time-course analysis of the viral dissemination in the brain upon peripheral injection of a recombinant MCMV expressing luciferase to C57Bl/6 neonates.

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV) infection of neonates represents an important cause of mental retardation, yet the molecular events leading to virus-induced pathogenesis are still poorly understood. To investigate the dynamics of brain infection, we adapted whole-animal in vivo imaging to perform time-course analysis of neonates infected with a luciferase-recombinant virus.

Verwenden Sie von<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging zur Überwachung der Progression of Experimental Maus Cytomegalovirus-Infektion bei Neugeborenen

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

Überwachen von Änderungen in Membran-Polarity, Membrane Integrity und intrazelluläre Ionenkonzentrationen in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Verwenden von Fluoreszenzfarbstoffen

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine via a series of lymphatic vessels and nodes that converge at the superior mesenteric lymph duct. Cannulation of the mesenteric lymph duct thus enables the collection of mesenteric lymph flowing from the intestine. Mesenteric lymph consists of a cellular fraction of immune cells (99% lymphocytes), aqueous fraction (fluid, peptides and proteins such as cytokines and gut hormones) and lipoprotein fraction (lipids, lipophilic molecules and apo-proteins). The mesenteric lymph duct cannulation model can therefore be used to measure the concentration and rate of transport of a range of factors from the intestine via the lymphatic system. Changes to these factors in response to different challenges (e.g., diets, antigens, drugs) and in disease (e.g., inflammatory bowel disease, HIV, diabetes) can also be determined. An area of expanding interest is the role of lymphatic transport in the absorption of orally administered lipophilic drugs and prodrugs that associate with intestinal lipid absorption pathways. Here we describe, in detail, a mesenteric lymph duct cannulated rat model which enables evaluation of the rate and extent of lipid and drug transport via the lymphatic system for several hours following intestinal delivery. The method is easily adaptable to the measurement of other parameters in lymph. We provide detailed descriptions of the difficulties that may be encountered when establishing this complex surgical method, as well as representative data from failed and successful experiments to provide instruction on how to confirm experimental success and interpret the data obtained.

Here we describe a technique to cannulate the mesenteric lymph duct in rats which enables quantification of lipid and drug transport via the lymphatic system following intestinal delivery. The technique can be adapted to assess mesenteric lymph concentrations and/or transport of fluid, immune cells, peptides, proteins and lipophilic molecules.

Die Mesenteriallymphknoten Duct Cannulated Rattenmodell: Anwendung auf die Bewertung der Darm Lymphatische Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Immunfluoreszenz, um die zelluläre Aufnahme von menschlichem Lactoferrin und die damit verbundenen antivirale Aktivität gegen das Hepatitis C Virus-Monitor

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Biolumineszenz-Bildgebung zur Erkennung von Late Stage-Infektion der afrikanischen Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

&quot;Phagosomen Closure Assay&quot; zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

Entwicklung eines Systems Hepatitis-B-Virus Reporter den frühen Stadien des Replikationszyklus zu überwachen

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Mit fluoreszierenden Proteinen zu Glycosome Dynamics in der afrikanischen Trypanosomen auf Monitor

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Die Verwendung von Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFSE) auf Lymphozyten-Proliferation-Monitor

Ein Visual Assay zur T6SS-vermittelte bakterielle Wettbewerb überwachen

Verwenden Sie von

Überwachen von Änderungen in Membran-Polarity, Membrane Integrity und intrazelluläre Ionenkonzentrationen in

Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren

Die Mesenteriallymphknoten Duct Cannulated Rattenmodell: Anwendung auf die Bewertung der Darm Lymphatische Drug Transport

Immunfluoreszenz, um die zelluläre Aufnahme von menschlichem Lactoferrin und die damit verbundenen antivirale Aktivität gegen das Hepatitis C Virus-Monitor

Biolumineszenz-Bildgebung zur Erkennung von Late Stage-Infektion der afrikanischen Trypanosomiasis

"Phagosomen Closure Assay" zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

Entwicklung eines Systems Hepatitis-B-Virus Reporter den frühen Stadien des Replikationszyklus zu überwachen