המחברים מודים לFondazione Filarete לעזרתה ותמיכה בפרסום של מאמר זה. כמו כן, אנו רוצים להודות לCentro di Europeo Nanomedicina לשימוש במיקרוסקופ האלקטרונים הילוכים Tecnai G2.

1. פלסמיד, תרבית תאים, וtransfection עם חלבונים ניאון ER <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמיד המשמש במחקר זה מורכב מגרסה משופרת של ה-GFP התמזגו בC-הסופית שלה לאזור הזנב של איזופורם ER של b ציטוכרום חולדה (5) (מקוצר כאן ב (5)) באמצעות רצף מקשר. אזור הזנב מכיל את כל הרצף (Pro94-Asp134) שנשאר קרום הקשורים לאחר מחשוף טריפסין של b ילידים (5), ובכלל זה TMD 17 השאריות (תחום הטרנסממברני), מוקף ברצפי קוטב מעלה או במורד (UPS ו DPS) . מקשר מורכב מepitope myc אחריו [4 Ser (גלאי)] 3, וכל cDNA מוכנס לתוך אתרי Hind3-Xba1 של pCDNA3 וקטור ביטוי של היונקים. פרטי הבנייה של פלסמיד זה תוארו בפרסום קודם שבו הוא מכונה ה-GFP-ER 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול COS-7 תאים בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת פטה 10%סרום שור l, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, 1% פניצילין / סטרפטומיצין בחממה על 37 מעלות צלזיוס ו10% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfection. צלחת 3 x 10 5 תאים על coverslip זכוכית עגול בצלחת 6 היטב ו, ביום שלאחר מכן, transfect עם מערכת JetPEI כפי שתוארו על ידי היצרן. שים לב שיחס JetPEI / DNA האופטימלי נבדק על מנת לבסס את יעילות transfection המרבית בהתאם לפלסמיד והקו סלולרי בשימוש: במקרה שלנו, JetPEI: יחס ה-DNA של 2:1 מוביל ל70-80% יעילות transfection. </li></ol> 2. בשידור חי הקרינה סריקת מיקרוסקופיה confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Live-תא הדמיה. שים את coverslip על שתאי transfected היו זורעים לתוך תא תא תרבות פלדה ל24 coverslips מ&quot;מ מלא DMEM w / o פנול אדומה, בתוספת 10% FBS, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, 1% עט / סטרפטוקוקוס, 25 HEPES מ&quot;מ , 50 מיקרוגרם / מיליליטר cycloheximide ו1:100 OxyFluor כדי למנוע את הדגימות מphotobleaching. Microscop confocal SP5הדואר מצויד בחממה בטמפרטורה מבוקרת CO 2 (37 ° C ו 5% CO 2) משמש לניסויי הדמיה תא חי, עם GFP-ER ד שדמיין באמצעות לייזר 488 ננומטר ומסנן 525/50 פליטה לעבור להקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP). צייר אזור של עניין (ROI), המקביל למבנה Oser, ולהלבין אותו באמצעות 20 חזרות ושילוב של 488 ננומטר (של לייזר 30 mW ארגון 100%, המקביל ל 5.5-6 μW במדגם) ו405 ננומטר (60% לייזר דיודה 405 30 mW, המקביל ל 11.6 μW במדגם) לייזרים אשר, בניסיון שלנו, מוביל לphotobleaching יעיל והמהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את ההתאוששות של הקרינה בROIs המולבנת על ידי לקיחת מסגרת אחת כל 10 שניות ל10 דקות (זמן = פיקסל 1.61 μsec / px). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אובדן הקרינה photobleaching (פליפ). לצייר את ההחזר על ההשקעה המתאימה למבנה Oser, ואקונומיקה כמתואר לעיל. הלבנת חוזרת על עצמו כל 30 שניות,ותמונות שלאחר הלבנת-נרשמות כל 10 שניות ל30 דקות (זמן = פיקסל 1.61 μsec / px). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FRAP וניתוח FLIP. כל התמונות נותחו באמצעות תוכנת ImageJ <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">(http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html).</a> בניסויים FRAP, התאוששות הקרינה של ההחזר על ההשקעה המולבנת נמדדת לאורך זמן ומנורמל לקרינה הכוללת של תא מולבן, שתמיד בדקה כדי להיות קבוע לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניסויי FLIP, לצייר את ההחזר על ההשקעה מחוץ לOser מולבן ומכסה את כל התא. למדוד עוצמת הקרינה שלה לאורך זמן ולנרמל את רמות הקרינה של החזר על השקעה שצוירו על תא מולבן על מנת לתקן את כל ירידה בקרינה הנגרמת על ידי ההדמיה עצמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל הניסויים, מופחתים אות הרקע (שנקבעה באזור שמחוץ לתאים) מעוצמות הניאון של ROIs. לבסוף, תשרטט את התוצאות באמצעות Grתוכנת aphPad פריזמה. </li></ol> 3. Ultrastructural ניתוח באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים לאור רעילותם של רבים מהחומרים הכימיים, כל ההליכים צריכים להתבצע לובשים מעבדה מתאימה. מעיל וכפפות מתחת למכסת מנוע קטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת coverslip מצלחת פטרי, לתקן את התאים שנותרו גדלו על תחתית הצלחת כmonolayer באמצעות glutaraldehyde 2% מסוננים ב0.1 חיץ cacodylate מ &#39;, pH 7.4, ל10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד את התאים באמצעות מגרד טפלון ולהעביר אותם לתוך 1.5 צינורות מיליליטר Eppendorf. גלולה התאים באמצעות צנטריפוגה ב9,000 גרם ל10 דקות. הסר את supernatant, להוסיף מקבע טרי, ולהשאיר לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את כדורים עם החיץ, אז פוסט לתקן עם תמיסה של 1% tetroxide אוסמיום במאגר cacodylate במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים MilliQ, וחדר כתם גוש עם1% אצטט uranyl במים מזוקקים לבין 20-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים את הדגימות בסדרת אתנול (70%, 80%, 90%, 100%, ו10 דקות כל אחד 100%) הולך וגדל, ולשטוף בקצרה פעמיים בפרופילן אוקסיד (15 דקות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדור דגימות בתערובת של תחמוצת פרופילן + קומיטה (1:1) (משעה 2 ללילה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע בשרף אפוקסי קומיטה רפא ב60 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף גושי שרף הגזוז באופן ידני באמצעות ultramicrotome LEICA UC6 מצויד בסכין יהלום 45 ° להשיג חלקים בעובי של 60-70 ננומטר. לאסוף את החלקים ב300 רשתות נחושת רשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכתים את החלקים ברשת עם תמיסה רוויה של אצטט uranyl (20 דקות) ולהוביל ציטרט (7 דקות), לשטוף ביסודיות את הרשתות על ידי טבילתם במים מזוקקים דו מסוננים, ולאפשר להם להתייבש בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרשתות המוכתמות הם נצפו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים Tecnai G2, והתמונות שנתפסו באמצעות בוטמצלמת CCD רכוב אום בהגדלות שונות סופיות (נעות בדרך כלל בין 6,000-39,000 X). </li></ol>

<ol>
	<li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum.">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li><li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+architecture:+structures+in+flux.">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li><li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum.">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).</li><li>Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-directional+protein+transport+between+the+ER+and.">Bi-directional protein transport between the ER and.</a> 20, 87-123 (2004).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).</li><li>Papiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restructured+endoplasmic+reticulum+generated+by+mutant+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+VAPB+is+cleared+by+the+proteasome.">Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome.</a> J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).</li><li>Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubic+membranes:+a+legend+beyond+the+Flatland*+of+cell+membrane+organization.">Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization.</a> J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).</li><li>Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+ER:+experimental+approaches+and+current+questions.">The dynamic ER: experimental approaches and current questions.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).</li><li>Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+1,4,5-trisphosphate+receptor+causes+formation+of+ER+cisternal+stacks+in+transfected+fibroblasts+and+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 12, 327-342 (1994).</li><li>Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+study+of+rat+liver+and+liver+neoplasms+after+long-term+treatment+with+phenobarbital.">Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital.</a> Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).</li><li>Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+reversible+restructuring+of+the+endoplasmic+reticulum+induced+by+PDMP+in+cultured+cells.">Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells.</a> J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13, 643-649 (2012).</li><li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres.">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease.">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li><li>Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+faces+of+protein+misfolding:+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases.">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li><li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways.">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP,+photoactivation,+photoconversion,+and+FLIP.">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li><li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats.">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הפרוטוקולים וגישות הדמיה מתוארות במאמר זה נעשו שימוש כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון ת&quot;א transfected תושב בחדר המיון של תאי חיים. יש לנו גם ניתחתי את ההשפעה של ביטוי יתר של חלבונים אלה על הארכיטקטורה של תא subcellular זאת באמצעות ניתוחי ultrastructural. <p class="jove_content" style="...

גילוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וריאנטים הרפאים שלה, ופיתוח המקביל של מיקרוסקופ פלואורסצנטי של, נפתח אפיקים חדשים לחלוטין לחקירה של חלבון התנהגות בתאים. טכניקות כגון התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) וירידה בקרינה בphotobleaching (פליפ), שהם אפשריים בגלל היכולת הפנימית של fluorophores לכבות הקרינה שלהם תחת תאורה אינטנסיבית, מבוססות על הדמיה לחיות תאי confocal והשימוש בtransfected חלבוני היתוך ניאון 1-3. הם נמצאים בשימוש נרחב כדי להעריך לא רק את הלוקליזציה של חלבונים, אלא גם הניידות שלהם והובלת ועי, אשר יכול לחשוף רמזים חשובים הנוגעים לתפקודם 4. התכונה הייחודית של תאי אוקריוטים היא נוכחותם של תאים תאיים שיש לי קומפוזיציות שומנים וחלבונים ספציפיות. למרות האברונים הם בידוד ע פיזיאד, הם צריכים לתקשר אחד עם השני ולשתף את המרכיבים מולקולריים על מנת לשמור על הומאוסטזיס הסלולר. מסלול ההפרשה מבטיח שהחלבונים והשומנים מסונתזים בחדר המיון להגיע ליעד הסופי הנכון שבו הם מפעילים את תפקידם. יכולים גם להיות מחוברים אברונים תאיים על ידי אתרים ליצירת קשר דינמיים המאפשרים למולקולות (שומנים) שתוחלפנה ישירות בין תאים. יתר על כן, חלבונים רבים להתאספו במתחמי heteromeric גדולים או הקשורים למיני שומנים מסוימים (רפסודות שומנים בדם / microdomains) בכדי להפוך לפונקציונלי פעיל או להיות מועבר ליעדן הסופי. כל היבטים ביולוגיים אלה משפיעים באופן משמעותי את מאפייני הקינטית של חלבונים, ולכן ניתן לחקור כראוי באמצעות הטכניקות מתוארות להלן. הקבוצה שלנו בשימוש נרחב FRAP ולהעיף בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים כדי ללמוד את הארכיטקטורה של חדר המיון ותת השונים שלהתחומים. חדר המיון הוא התחנה הראשונה של מסלול ההפרשה וממלא תפקיד מרכזי בחלבון ושומני מיון 5. זהו אברון דינמי מאוד משנה שברורה לשקף את תפקידיה הרבים ושונים (כלומר חלבון וביוסינתזה שומנים וסחר, קיפול חלבונים, Ca 2 + אחסון ולשחרר, וחילוף חומרי xenobiotic). עם זאת, למרות שהם מורפולוגית, מרחבית, ותפקודיים שונים, תחומים אלה הם רציפים אחד עם השני, והשפע היחסי שלהם יכול להיות שונה בתאים בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. ידוע ביותר ותחומים בדרך כלל במרחב נפרד מחדר המיון הם מעטפת הגרעין, וER החלק ומחוספס, עם זאת, אנחנו ואחרים הראינו כי יש מבני ER עם ארכיטקטורה משוכללת יותר וארגון תלת ממדים בסוגי תאים שונים ו רקמות בתנאים פיסיולוגיים שיכול גם להיגרם על ידי אמצעים של גירויים מלחיצים כגון היפוקסיה, סמיםממשל, או על הביטוי של חלבוני ER-תושב הטרנסממברני 2,6 (והפניות בו). יש לנו גם לאחרונה הפגין את נוכחותם של מבנים כאלה במודלים של תא של מחלות אנושיות 1,7. מקורם cisternae המוערמות של ER חלק, הם קבלו את השם הקולקטיבי של reticulum המאורגן החלק endoplasmic (Oser) ב2003 6, למרות שהם ידועים גם בשם karmellae, lamellae, וER גבישן על בסיס הארכיטקטורה שלהם, אשר, כמוהם גודל, יכול להשתנות. אחרי התאים transfected עם GFP התמזגו לאזור cytosolic של חלבונים (ת&quot;א) ER-תושב (ד EGFP-ER) מעוגני זנב, הנטייה החלשה dimerizing של ה-GFP בטרנס באופן דרמטי משנה את הארגון ומבנה של חדר המיון. FRAP והניסויים FLIP הראו כי EGFP-ER ד הוא בחינם כדי לפזר בתוך OSERs, והעובדה שהוא נע מחדר מיון רשתי לOser ולהיפך &lt;/ Em&gt; מצביע על כך שהמצרפים הם רציפים עם ER הרשתית שמסביב. ניתוח Ultrastructural אפשר לנו לתאם את נתוני הקרינה עם תיאור מפורט של אדריכלות Oser וארגון ברמת ננו: OSERs תמיד בנוי מערמות של cisternae לזווג של ER החלק אבל ייתכן שיש לי צורות שונות של ארגון המרחבי, כגון מסודר באופן קבוע סינוסי מערכים או מערבולות, או מערכים צינורי משושה &quot;גבישן&quot;. שחלופים אלה להוביל למורפולוגיות מעוקב 8 אשר, כפי שהם כבר נמצאים בתאים בתנאים פיסיולוגיים 9 ולחצים כגון היפוקסיה 10, טיפול תרופתי 11, וסרטן 9 הבאים, ייתכן שיש פוטנציאל משמעותי כסמני ultrastructural. לאחר הפגנה ראשונה זה באמצעות חלבוני GFP היתוך, השתמשנו ניסויי הדמיה כדי לנתח את ההתפשטות של תחומים ER בתגובה לטיפולים תרופתיים 12, assess הנטייה של חלבוני ניאון לoligomerise בתאי 13, וכדי לחקור את התפקיד של מוטציה, חלבון ת&quot;א ALS צמוד להיווצרות של אגרגטים תאיים ממוצא ER שעשויה להיות רלוונטי ל1,8 פתוגניות שלה. היה מי שהציע כי היווצרות של אגרגטים תאיים (אשר מתרחשת במחלות ניווניות רבות 14) עשויה להיות מנגנון הגנה שנועד למנוע האינטראקציות בין חלבוני מוטציה רעילים ומרכיבי התא המקיפים 15. להלן תיאור של שילוב של שיטות מיקרוסקופית אופטיות ואלקטרונים לחקירת מבנים בטרמינל C-שתחומים הידרופובי מוכנסים לתוך הקרום של ER, וניתוח של ההתנהגות הדינמית שלהם ואת ההשפעות של יתר הביטוי שלהם בתחום ER אדריכלות בתאים בתרבית (ראה תרשים 1 לתרשים זרימה של פרוטוקול הניסוי).

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM) w/o phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31053028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>jetPEI</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>PP10110</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OxyFluor</td>
			<td>Oxyrase Inc.</td>
			<td>OF-0005</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde Grade I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Osmium Tetroxide 4% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Uranyl Acetate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>73943</td>
			<td>slightly radioactive</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propylene Oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82320</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EPON embedding medium kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45359-1EA-F</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lead Citrate </td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>17800</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bench top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectral Confocal Microscope </td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CO2 Microscope Cage Incubation System </td>
			<td>OkoLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ultramicrotome </td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Diamond knife </td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 45 &deg;</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Transmission Electron Microscope </td>
			<td>FEI</td>
			<td>Tecnai G2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad Software, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>steel culture cell chamber for 24 mm coverslip</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>CSC-25</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Electron Microscopy grids</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>G300Cu</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

visualization of endoplasmic reticulum subdomains in cultured cells

השומנים והחלבונים בתאי אוקריוטים הם החליפו ברציפות בין תאי תאים, אם כי אלה לשמור על ההרכב הייחודי שלהם ופונקציות למרות תנועת interorganelle המולקולרית האינטנסיבית. הטכניקות מתוארות במאמר זה הן אמצעי רב עוצמה של לימוד חלבון וניידות שומנים בדם וסחר in vivo ו בסביבה הפיזיולוגית שלהם. התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) וירידה בקרינה בphotobleaching (פליפ) נמצאת בשימוש נרחב בטכניקות הדמיה לחיות תאים ללימוד סחר תאיים באמצעות מסלול Exo-endocytic,, לוקליזציה היווצרות של קומפלקסי חלבונים, והחלבונים ההמשכיות בין האברונים או subcompartments בmicrodomains שומנים בדם, אשר כולם יכולים להיות שנצפו בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. המגבלות של גישות אלו הן בעיקר כתוצאה מהשימוש בחלבוני היתוך ניאון, והחסרונות הפוטנציאליים שלהם כוללים artifactual מעל מפורשיון בתאים ואת האפשרות של הבדלים בקיפול והלוקליזציה של חלבונים מתויגים וילידים. לבסוף, כגבול של רזולוציה של מיקרוסקופיה אופטית (כ 200 ננומטר) אינו מאפשר חקירה של המבנה העדין של ER או subcompartments הספציפי שיכול לנבוע בתאים תחת לחץ (כלומר חוסר חמצן, מתן תרופה, ביטוי יתר של הטרנסממברני חלבוני תושב ER) או תחת מצבים פתולוגיים, אנו משלבים הדמיה לחיות תאים של תאי transfected תרבותיים עם ultrastructural ניתוחים הבוסס על מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

איור 2 מראה מחקר FRAP דוגמא לניידות חלבון. ניידות חלבון EGFP-ER ד של מודגמת על ידי התאוששות הקרינה המהירה לאחר photobleaching בOSERs המולבן. לניתוח כמוני, חצי מהזמן והחלק נייד נגזרו מנתונים שנמדדו באופן ניסיוני על ידי התאמת משוואת monoexponential הבאה: <p class="jove_content" style=";text-al...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells at JoVE.com

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

אנו מתארים את גישות ההדמיה אנו משתמשים כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון transfected תושב בreticulum endoplasmic (ER) באמצעות confocal ההדמיה של תאי חיים. אנחנו גם ultrastructurally לנתח את ההשפעה של הביטוי שלהם על הארכיטקטורה של תא subcellular זה.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

visualization-of-endoplasmic-reticulum-subdomains-in-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Biology

12.9K Views.  Fondazione Filarete.  אנו מתארים את גישות ההדמיה אנו משתמשים כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון transfected תושב בreticulum endoplasmic (ER) באמצעות confocal ההדמיה של תאי חיים. אנחנו גם ultrastructurally לנתח את ההשפעה של הביטוי שלהם על הארכיטקטורה של תא subcellular זה. 

Video: Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

ספירת ועל קביעת הכדאיות של תאים בתרבית

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

ויזואליזציה של תאים ביניים של רשת (ICC) קחאל ב עכברים

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

הכנת כרומוזום מתאים בתרבית

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

אברון תחבורה בתרבית<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאים: תא קו S2 ויסודי נוירונים.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

ויזואליזציה של מתח G3BP גרגרי Dynamics בראשי תאים בשידור חי

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

מבחני כתב מקבילים מסיבי בתאי יונקים בתרבית

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the large size of the human BRCA2 protein (approximately 390 kDa). We report modifications of standard siRNA transfection and immunoblotting protocols to silence human BRCA2 and detect endogenous BRCA2 protein, respectively, in human epithelial cell lines. Key steps include a high siRNA to transfection reagent ratio and two subsequent rounds of siRNA transfection within the same experiment. Using these and other modifications to the standard protocol we consistently achieve more than 70% silencing of the human BRCA2 gene as judged by immunoblotting analysis with anti-BRCA2 antibodies. In addition, denaturation of the cell lysates at 55 &#176;C instead of the conventional 70-100 &#176;C and other technical optimizations of the immunoblotting procedure allow detection of intact BRCA2 protein even when very low amounts of starting material are available or when BRCA2 protein expression levels are very low. Efficient silencing of BRCA2 in human cells offers a valuable strategy to disrupt BRCA2 function in cells with intact BRCA2, including tumor cells, to examine new molecular pathways and cellular functions that may be affected by pathogenic BRCA2 mutations in tumors. Adaptation of this protocol for efficient silencing and analysis of other &#39;large&#39; proteins like BRCA2 should be readily achievable.

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

השתקת<em&gt; BRCA2</em&gt; לזיהוי פונקציות ביולוגיות-מוסדר BRCA2 רומן בתאי אדם בתרבית

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

ניטור הומאוסטזה סידן endoplasmic reticulum שימוש<em&gt; Gaussia</em&gt; לוציפראז SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...