עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה והמחלות מדבקות גרנט R01AI079253 (לBHS), ועל ידי המכון הלאומי לסרטן סרטן מרכז תמיכת גרנט CA016056 לRoswell Park Cancer Institute.

כל ההליכים שבוצעו בבעלי חיים במחקר זה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים והשימוש בRoswell Park Cancer Institute ועמדו בכל המדינה, הפדרלית, והמכון הלאומי לתקנות בריאות. 1. בvivo Macrophage תיוג הערה: PHK26 הוא צבע lipophilic שיינקט על ידי תאי phagocytic גם במחזור וברקמות, כאשר בהזרקה לווריד (IV). PKH26 שימש לסימון in vivo כדי למזער את הכמות של מניפולציה לאחר הקטיף של מקרופאג. יש PKH-26 היתרון של יציבות צבירה במקרופאגים מכתשיים לאורך תקופות ממושכות. מחכה 10 ימים לאחר מתן מאפשר סליקה של כל התאים שכותרתו ממחזור ומשאירים רק מכתשיים מקרופאג שכותרתו ביציבות עם PKH26 8, 9. PKH26 הוא fluorochrome אדום שיש עירור (551 ננומטר) ופליטת מאפיינים (567 ננומטר) תואמיםעם מערכות rhodamine או זיהוי phycoerythrin. כל הליך תיוג יכול להציג את החפץ, לרבות אובדן יכולת הקיום. עם זאת, מאחר שאנו משתמשים באותה הגישה לתיוג של מקרופאגים בגנוטיפים עכבר שונים (למשל, WT לעומת NADPH אוקסידאז לקוי), את ההשפעות של חפצים אלה יהיו אחידות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל פתרון מניות של PKH26 (1 x 10 -3 M באתנול) 1:05 ב-C diluent המסופק על ידי יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> של PKH26 דילול עומס 100 μl לתוך מזרק 1/2 מיליליטר אינסולין (29 G x 1/2 &quot;) לכל עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל לעכברים בהזרקת IV (או וריד זנב או מסלולית רטרו) 10 ימים לפחות לפני הקציר. </li></ol> 2. קציר מכתשיים המקרופאגים על ידי שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL) מספר העכברים לשימוש עבור ניסוי יכול להשתנות. תשואה אופיינית מעכבר unstimulated היא בטווח של 3-5 x 10 5 מקרופאגים מכתשיים, אולם מספר זה יכול להשתנות במידה רבה BASאד בגורמים כגון גודל של העכבר, החוויה של האדם שבצע את שטיפה, ומספר instillations של נוזל שטיפה והנפח נסוג מריאות. בפרוטוקול זה שטיפת ריאות מתבצעת עם חלל בית החזה סגור אשר יחד עם lavages 1 מיליליטר חוזר ונשנה עוזר להגדיל את תשואת תא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את עכבר על ידי מתן מנה קטלנית של חומר ההרדמה Avertin (12.5 מ&quot;ג) intraperitoneally (IP) באמצעות תנאים אספטיים כדי לשמור על התמיסה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספריי עכבר ביסודיות עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העור מקצה הגולגולת של בעלי חיים וחושפים את בית החזה (איור 1 א). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן בעור ממש מתחת לסרעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את האצבע לתוך החתך ולמשוך את עור מקצה הגולגולת של (איור 1 א) לבעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף את מעט על הראש, המשתרע בצד הגחוני של הצוואר (איור 1 א). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חור קטן שדרך כלוב הצלעותלצד הימני של בית החזה כדי להוציא את האוויר לריאות וגם לאפשר הדמיה של ריאות במהלך השלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את קנה הנשימה, ובזהירות לנתח משם רקמה שמסביב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בלוטות רוק, שרירי sternohyoid וגרון, וכו &#39;עם מלקחיים מעוקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להרים עם מלקחיים מעוקלים ולחתוך עם מספריים הרקמה דקה המכסה את קנה הנשימה (adventitia) לחשוף את מבנה סחוס טבעתי שבבסיס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קטטר לתוך קנה הנשימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים מעוקלים, הנח תפר מאחור (גב ל) קנה הנשימה ולשלוף אורך 10 סנטימטר דרך הפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מעל cricoid (הטבעת המעובה של סחוס) ינחה בזהירות קטטר G 22 המורד קנה הנשימה לעצור בו את קנה הנשימה נעלמת מאחורי עצם החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוקף לקשור תפר סביב קנה הנשימה וקטטר להתאמה הדוקה. הסר את המחט מקטטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב ברזלים 4 כיוונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלאאחד 6 מיליליטר המזרק עם DPBS, FBS 1% ולצרף לברזלי 4 כיוונים כפי שמצוין באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מזרק מיליליטר ריק 6 במיקום מצויינים על ברזלים 4-way (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף נמל פתוח בברזלים 4-דרך קטטר (איור 1). היזהר שלא לסלק קטטר מקנה הנשימה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף שטיפת נוזלים מריאות. הערה: חוקרים יכולים לבחור להשתמש בכמויות נמוכות יותר של נוזל שטיפה כדי למזער את האפשרות של נזק לרקמות. זה חשוב כי באותה הגישה יש ליישם באופן עקבי בכל קבוצות העכבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הידית על ברזלים כך המזרק הריק סגור ולאט להזריק DPBS ~ 1 מיליליטר, 1% FBS לנפח את הריאות. שים לב לאינפלצית ריאה דרך החור בשלב 2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היזהר שלא overinflate הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הידית על ברזלים, כך שהמזרק המלא סגור, ולסגת בזהירות השפעת<html> id מהריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לריאות להוציא את האוויר דרך החור בשלב 1.4. קטטר ייתכן שיצטרך להזיז מעט אחורה או אחורה כדי לקבל הגרלה טובה. לנקוט אמצעי זהירות מיוחדת כדי לשמור את הקטטר בתוך קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.8.1-2.8.4 5-6x עד שכל DPBS, 1% FBS כבר הזריק ונסוג מהריאות. הערה: התאוששות של ריאות נוזל לא תהיה של נוזל מוזרק 100%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק ריק עם נוזל שטיפה לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. לשמור על תאים בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים על ידי צנטריפוגה XG 300 5 דקות בטמפרטורת חדר ויוצקים את supernatant. זו ניתן לשמור לניתוח ציטוקינים אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים ב1-5 מיליליטר RPMI 1640 עם FBS 10% ולסמוך על hemocytometer. בעכבר unstimulated,&gt; 95% מתאים שנקטפו על ידי BAL צפויים להיות מקרופאגים, אשר יכול להיות מאושר על ידי ציטולוגיה. </li></ol> 3. Culturing וקציר פטרייה &quot;&gt; Fumigatus Aspergillus שימוש בפרוטוקול זה מבטא GFP בכל שלבי מחזור החיים שלו:. נבגים, germlings ועובש פטרייתי זן זה הניתן על ידי ד&quot;ר מרגו מור, אוניברסיטת סיימון פרייזר, Burnaby, BC, קנדה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נבגי צלחת של מתח fumigatus Aspergillus להביע GFP בעירוי לב מוח Sabouraud (BHI) אגר שיפועים עם Chloramphenicol (0.05 גר &#39;/ ל&#39;) וגנטמיצין (0.5 גר &#39;/ ל&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בחושך כתרים באופן רופף ל7-10 ימים בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר נבגים על ידי אלכסון כביסה עם 10 מיליליטר של 0.01% Tween 20 בDPBS. קל לגרד את הפטרייה עם stripette כדי לשחרר. יש לשטוף את השיפוע מספר פעמים כדי להגדיל את התשואה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובר השעיה נבגים דרך מסננת תא 100 מיקרומטר ל50 מיליליטר חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה נבגים על ידי צנטריפוגה ב XG 400 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נבגי resuspend ב 50 DPBS מיליליטר ולספור באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף פעמיים עם DPBS ולדלל את ריכוזים רצוייםטיפול במשפחה. </li></ol> 4. פטרייתיים אתגר ומיקרוסקופיה confocal כדי לחקור את התפקיד של מונואמין NADPH מקרופאג בהגנת מארחת, את היכולת של מקרופאגים מכתשיים מבודדים מעכברים של שלושה גנוטיפים לשלוט על הצמיחה של נבגי אספרגילוס phagocytosed הוערכה. גנוטיפים השתמשו במחקר זה כוללים; 1) wild-type עכברים, 2) Ncf1 * / * Mn-עכברים עם מוטציה Ncf1 טבעית (Ncf1 מקודד לphox p47, רכיב הנדרש של מונואמין NADPH תא בלען) ומשאיר אותם חסר מונואמין NADPH, ו3) Ncf1 * / * Mn + עכברים הטרנסגניים (MN מציין transgene מחסה wildtype Ncf1 תחת השליטה של אמרגן CD68 אדם) שבו פעילות מונואמין NADPH כבר מחדש באוכלוסיית מונוציטים / מקרופאג 10, 11. מיקרוסקופיה confocal היא מתאימה ביותר עבור assay זה בשל נוכחותםוצמיחה של נבגים שאינם phagocytosed בשקופיות. מיקרוסקופ confocal יאפשר להדמיה של מטוסים בודדים בתוך ציר ה-Z, ולאפשר הבחנה בין הפטרייה גדלה בסביבה ולא בתוך מקרופאג. כל תמונות confocal נרכשות באמצעות עדשת טבילת שמן 63X. Z-ערימות נרכשות עם גורם הזום אלקטרוני של 2.5. העובי של Z-מחסנית נקבע באמצעות DAPI ותמונות שדה בהירים כדי לאתר את החלק העליון ותחתון של השדה. Z-ערימות נעו 14-24 מיקרומטר עם פרוסות בודדות ~ 1 מיקרומטר עבה. לכימות של מקרופאגים, סריקות יחידה של זום האלקטרוני 1X בוצעו על 10 שדות לכל גנוטיפ. מקרופאגים ללא פגע זוהו מבוסס על PKH26 ומכתים DAPI של הקרום וגרעין בהתאמה. נבגים זוהו מבוסס על ביטוי FITC ותמונת שדה בהיר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את coverslips וצלחות סטרילי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת ארון בטיחות ביולוגית, לספוג 22 x 22 coverslips זכוכית מ&quot;מ בethano 70%l ל5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף coverslips ב PBS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים סטרילית, מניח בעדינות coverslip יחיד בתחתית היטב בכל צלחת 6 היטב ארוזה בנפרד סטרילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע ~ 1 x 10 6 נקטף PKH26 כותרת מקרופאגים מכתשיים מושעים ב300 μl RPMI 1640, FBS 10% על כל coverslip. המספר המדויק עשוי להשתנות תלוי בתשואת הקציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר מקרופאג לדבוק ידי דוגרים על 37 ° C עם 5% CO 2 בלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, להוסיף ~ 1 x 10 7 א-GFP-לבטא נבגי fumigatus מושעים ב100 μl RPMI 1640, 10% FBS (37 מעלות צלזיוס) מחומם מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את צלחת לאינקובטור 37 ° C עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צריכים להיות קבועים למשך התקופה מינימאלית של 2 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C. בבית 3, 7, ו14 תאים לתקן את שעה על ידי הוספת נפח שווה של פורמלדהיד 2% לכל טוב (ריכוז סופי פורמלדהיד 1%). צלחות מקוםנקודות זמן המוקדם ב 4 ° C למשך הלילה. לנקודת הזמן הסופית (14 hr), לתקן את התאים בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, בעדינות להסיר coverslips באמצעות מלקחיים ולשטוף בDPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את הנוזלים עודפים על ידי הצבת קצה coverslip על Kimwipe מקופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 6 הרכבה בינונית הקרינה μl עם DAPI לשקופית הזכוכית מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קצה אחד של coverslip בשקופית ובעדינות שחרר עם צד תא למטה להרכבה בינונית. הרכבה בינונית תתפשט ויוצר שכבה אחידה מתחת coverslip. אין צורך ללחוץ על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום קצוות של coverslip עם לק ברור ולאפשר לאוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות שקופיות מוכנה בקופסא שקופיות (המוגנת מפני אור) בטמפרטורת חדר עד מוכן לנתח על ידי מיקרוסקופיה confocal. </li></ol>

<ol>
	<li>Reeves, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+activity+of+neutrophils+is+mediated+through+activation+of+proteases+by+K++flux.">Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux.</a> Nature. 416, 291-297 (2002).</li><li>Bianchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis.">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2622 (2009).</li><li>Vethanayagam, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+NADPH+oxidase+versus+neutrophil+proteases+in+antimicrobial+host+defense.">Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Grimm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-+and+Macrophage-Targeted+NADPH+Oxidase+Mediates+Antifungal+Host+Defense+and+Regulation+of+Acute+Inflammation+in+Mice.">Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice.</a> The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).</li><li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+protection+against+conidia+by+mononuclear+and+against+mycelia+by+polymorphonuclear+phagocytes+in+resistance+to+Aspergillus.+Observations+on+these+two+lines+of+defense+in+vivo+and+in+vitro+with+human+and+mouse+phagocytes.">Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).</li><li>Philippe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+Aspergillus+fumigatus+by+alveolar+macrophages+is+mediated+by+reactive+oxidant+intermediates.">Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates.</a> Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).</li><li>Cornish, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+nicotinamide+adenine+dinucleotide+phosphate+oxidase-independent+resistance+to+Aspergillus+fumigatus+in+alveolar+macrophages.">Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages.</a> J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).</li><li>Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+recruited+to+the+lungs+of+mice+during+immune+inflammation+ingest+apoptotic+cells+poorly.">Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).</li><li>Davidson, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DISCRIMINATION+OF+RESIDENT+AND+INFILTRATED+ALVEOLAR+MACROPHAGES+BY+FLOW+CYTOMETRY+IN+INFLUENZA+A+VIRUS-INFECTED+MICE.">DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE.</a> Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).</li><li>Gelderman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+suppress+T+cell+responses+and+arthritis+development+in+mice+by+producing+reactive+oxygen+species.">Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species.</a> J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).</li><li>Pizzolla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+produced+by+the+NADPH+oxidase+2+complex+in+monocytes+protect+mice+from+bacterial+infections.">Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections.</a> J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).</li><li>Luther, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+phagocytic+uptake+of+Aspergillus+fumigatus+conidia+by+macrophages.">Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages.</a> Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).</li><li>Geunes-Boyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+Protein+D+Increases+Phagocytosis+of+Hypocapsular+Cryptococcus+neoformans+by+Murine+Macrophages+and+Enhances+Fungal+Survival.">Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival.</a> Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).</li><li>Garc&#237;a-Rodas, R., Gonz&#225;lez-Camacho, F., Rodr&#237;guez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interaction+between+Candida+krusei+and+Murine+Macrophages+Results+in+Multiple+Outcomes,+Including+Intracellular+Survival+and+Escape+from+Killing.">The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing.</a> Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).</li><li>Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+from+C3H/HeJ+mice+show+sensitivity+to+endotoxin.">Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).</li><li>Redente, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+polarization+of+alveolar+macrophages+and+bone+marrow-derived+monocytes+following+chemically+and+pathogen-induced+chronic+lung+inflammation.">Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation.</a> J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).</li><li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+Aspergillus+spores+depends+on+the+anatomical+source+of+the+macrophage.">Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage.</a> Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).</li><li>Goodridge, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+use+of+CARD9+by+dectin-1+in+macrophages+and+dendritic+cells.">Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells.</a> J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

השימוש בגישה זו לניתוח vivo לשעבר של הפעילות נגד פטריות של מקרופאגים יחד עם אתגר פטרייתי in vivo, שהוכחנו בעבר כי מונואמין NADPH במקרופאגים ממלא תפקיד חשוב בהגנה מפני א 4 fumigatus. שימוש במקרופאגים מכתשיים מבודדים מאפשרים לנו להתמקד בפעילות נגד פטריות שלהם ?...

מקרופאגים מכתשיים הם תאי phagocytic הקו הראשון שנתקלים בחיידקים בשאיפה. המקרופאגים מכירים מוטיבים אספרגילוס על ידי קולטנים זיהוי הפתוגן, לבלוע ולהגביל את הצמיחה של נבגים בשאיפה (נבגים), וליזום תגובות דלקתיות. מונואמין NADPH התא בלען ממיר חמצן מולקולרי לאניון סופראוקסיד ביניים במורד הזרם חמצן מגיבים (ROIs). המחלה granulomatous כרונית (CGD) היא הפרעה תורשתית של מונואמין NADPH מתאפיין בזיהומים חיידקיים ופטרייתיים חמורים ועל ידי תגובות דלקתיות מוגזמות. למרות מונואמין NADPH הוא קריטי להגנה מארחת בתיווך נויטרופילים 3 - 1, את החשיבות של מונואמין NADPH במקרופאגים אינה מוגדרת היטב. מחקרים קודמים הראו כי מקרופאגים מכתשיים לבלוע ולהרוג נבגי אספרגילוס, בעוד שהנויטרופילים בעיקר למקד את שלב hyphal 5. עם זאת, היו resul סותרts כלתפקיד של מונואמין NADPH במקרופאג בשליטה על הצמיחה של א &#39; fumigatus נבגי 6, 7. מטרתה של שיטה זו הייתה להתוות את התפקיד הספציפי של מונואמין NADPH במקרופאגים בתיווך הגנת מארחת נגד א &#39; נבגי fumigatus. מצאנו כי מונואמין NADPH במקרופאגים מכתשיים שולט על הצמיחה של א &#39;phagocytosed fumigatus נבגי 4. למודל תגובת המארח לפטריות בשאיפה באופן הדוק ביותר, השתמשנו מקרופאגים מכתשיים שנקטפו על ידי שטיפה ברונכואלוואולרית מעכברי unstimulated הבא להקריב באופן מיידי. שימוש במקרופאגים מכתשיים מבודדים אפשרו לנו להתמקד בפעילות נגד פטריות שלהם בהיעדרם של תאים חיסוניים אחרים (למשל נויטרופילים שגויסו,) שלהתגונן מפני אספרגילוס in vivo. בשיטה זו, מקרופאגים מכתשיים הוכתמו in vivo לפני קציר, כדי למזער את הכמות של מניפולציה לאחר קטיף. &lt;/ P&gt; יתרון נוסף לפרוטוקול זה הוא השימוש בא-GFP-לבטא זן fumigatus. פטרייה זו מבטאת GFP משלב הנבגים דרך שלב hyphal ואין לו צורך בצביעה נוספת. כדי להשיג תמונות עם פירוט רב יותר, בחרנו מיקרוסקופיה confocal המאפשרת הבנייה מחדש של מבנים תלת ממדיים מהתמונות שהושגו. שחזור תלת ממדי נותן את היכולת להבדיל בין העובש גדל בסביבה ולא באו באמצעות מקרופאג. נבגים יכולים להיות גם בדיוק מכובדים כתאי לעומת תאי.

<table><tbody><tr><td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2 Tribromoethanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>Used to make AvertinAnesthetic</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol</td><td>Sigma</td><td>A-1685</td><td>Used to make AvertinAnesthetic</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;#039;s Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>A0171</td><td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td></tr><tr><td>KHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P91444</td><td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td></tr><tr><td>22 G x 1.00 inch i.v. catheter</td><td>BD</td><td>381523</td><td>Insyte Autoguard Winged</td></tr><tr><td>Insulin syringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 ml Syringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-way stopcock</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-700-077</td><td></td></tr><tr><td>Suture thread</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gauze sponges (4 inch square)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 with L-glutamine</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td>heat inactivated</td></tr><tr><td>Hema 3 Stain Set</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants</td><td>BD</td><td>297252</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aspergillus fumigatous&lt;/em&gt; strain expressing green fluorescent protein</td><td></td><td></td><td>provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada</td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m Cell strainers</td><td>BD Falcon</td><td>64753-00</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biological Safety Cabinet Class II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DM1000 light microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 2 centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td></td><td></td><td>37 &amp;deg;C, 5%&amp;nbsp; CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>22 x 22 mm micro cover glass</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>glass coverslips</td></tr><tr><td>6-well Cell culture plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>VWR</td><td>BDH0502-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP2 system with a laser point scanner</td><td></td><td></td><td>Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope</td></tr></tbody></table>

assessing anti-fungal activity of isolated alveolar macrophages by confocal microscopy

הריאות היא ממשק שבו תאי מארח נחשפים באופן שיגרתי לחיידקים ומוצרים של חיידקים. מקרופאגים מכתשיים הם תאי phagocytic הקו הראשון שנתקלים בפטריות בשאיפה וחיידקים אחרים. המקרופאגים ותאים אחרים של מערכת חיסון לזהות את המוטיבים אספרגילוס על ידי קולטנים זיהוי הפתוגן וליזום תגובות דלקתיות במורד הזרם. מונואמין NADPH תא בלען מייצר ביניים חמצן מגיבים (ROIs) והוא קריטי להגנה מארחת. למרות מונואמין NADPH הוא קריטי להגנה מארחת בתיווך נויטרופילים 3 - 1, את החשיבות של מונואמין NADPH במקרופאגים אינה מוגדרת היטב. מטרת המחקר הנוכחי הייתה להתוות את התפקיד הספציפי של מונואמין NADPH במקרופאגים בתיווך הגנת מארחת נגד א &#39; fumigatus. מצאנו כי מונואמין NADPH במקרופאגים מכתשיים שולט על הצמיחה של א &#39;phagocytosed fumigatus נבגי 4. כאן אנו מתארים שיטה להערכת היכולת של עכברמקרופאגים lveolar (AMS) לשלוט על הצמיחה של נבגי phagocytosed אספרגילוס (נבגים). מקרופאגים מכתשיים הם מוכתמים בvivo ועשרה ימים לאחר מכן בודדו מעכברים על ידי שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL). המקרופאגים הם מצופים על coverslips זכוכית, ולאחר מכן זורעים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) להביע א נבגי fumigatus. בזמנים שצוינו, תאים הם קבועים ומספר מקרופאגים שלמים עם נבגי phagocytosed נבחנים על ידי מיקרוסקופיה confocal.

<html> איסוף מקרופאג מכתשיים ידי BAL מעכברי unstimulated יגרום&gt; 95% מאוכלוסייה טהורה המבוססת על ציטולוגיה. 3 ו 7 שעות (איור 2) נקודות זמן להקדים את שלב hyphal של פטרייתי צמיחה ולאפשר השוואה של יעילות phagocytic של נבגים בין גנוטיפים. נקודת הזמן 14 שעות היא שבו ניתן להשוות גנוטיפים ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy at JoVE.com

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

שיטה כדי להעריך את יכולתם של מקרופאגים מכתשיים עכבר בודדים לשלוט על הצמיחה של נבגי אספרגילוס phagocytosed ידי מיקרוסקופיה confocal.

הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

assessing-anti-fungal-activity-isolated-alveolar-macrophages-confocal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K Views.  Roswell Park Cancer Institute.  שיטה כדי להעריך את יכולתם של מקרופאגים מכתשיים עכבר בודדים לשלוט על הצמיחה של נבגי אספרגילוס phagocytosed ידי מיקרוסקופיה confocal. 

Video: Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Bioengineering

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

מיקרוסקופיה וידאו חי מתא phagocytosis הפתוגן פטרייתיים

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

שימוש cytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

הדמיה חיה של פעילות אנטי פטרייתי על ידי אדם מן המעלה הראשונה נויטרופילים ומונוציטים בתגובה<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Studying the Role of Alveolar Macrophages in Breast Cancer Metastasis

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. The 4T1 cells expressing GFP in combination with imaging and confocal microscopy are used to monitor tumor growth, track metastasizing tumor cells, and quantify the metastatic burden. These approaches are supplemented by digital histopathology that allows the automated and unbiased quantification of metastases. In this method the routinely prepared histological lung sections, which are stained with hematoxylin and eosin, are scanned and converted to the digital slides that are then analyzed by the self-trained pattern recognition software. In addition, we describe the flow cytometry approaches with the use of multiple cell surface markers to identify alveolar macrophages in the lungs. To determine impact of alveolar macrophages on metastases and antitumor immunity these cells are depleted with the clodronate-containing liposomes administrated intranasally to tumor-bearing mice. This approach leads to the specific and efficient depletion of this cell population as confirmed by flow cytometry. Tumor volumes and lung metastases are evaluated in mice depleted of alveolar macrophages, to determine the role of these cells in the metastatic progression of breast cancer.

Here we describe the model and approach to study functions of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. To demonstrate the role of these cells in metastasis, the syngeneic (4T1) model of breast cancer in conjunction with the depletion of alveolar macrophage with clodronate liposomes was used.

לומד את התפקיד של מכתשיים מקרופאגים סרטן שד גרור

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer ...

Medicine

In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce pulmonary inflammation, but little is known regarding how exposure alters processes important to the resolution of inflammation. Efferocytosis is a resolution process, whereby macrophages phagocytize apoptotic cells. The purpose of this protocol is to measure alveolar macrophage efferocytosis following O3-induced lung injury and inflammation. Several methods have been described for measuring efferocytosis; however, most require ex vivo manipulations. Described in detail here is a protocol to measure in vivo alveolar macrophage efferocytosis 24 h after O3 exposure, which avoids ex vivo manipulation of macrophages and serves as a simple technique that can be used to accurately represent perturbations in this resolution process. The protocol is a technically non-intensive and relatively inexpensive method that involves whole-body O3 inhalation followed by oropharyngeal aspiration of apoptotic cells (i.e., Jurkat T cells) while under general anesthesia. Alveolar macrophage efferocytosis is then measured by light microscopy evaluation of macrophages collected from bronchoalveolar (BAL) lavage. Efferocytosis is finally measured by calculating an efferocytic index. Collectively, the outlined methods quantify efferocytic activity in the lung in vivo while also serving to analyze the negative health effects of O3 or other inhaled insults.

This manuscript describes a protocol for determining whether exposure to ozone, a criteria air pollutant, impairs alveolar macrophage efferocytosis in vivo. This protocol utilizes commonly used reagents and techniques and can be adapted to multiple models of pulmonary injury to determine effects on alveolar macrophage efferocytosis.

בהערכת Vivo של מכתשי מקרופאג Efferocytosis בעקבות חשיפת האוזון

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

מדידת פאיגוציטוזה של אספרגייוס מחטאים מחט על ידי האדם לוקיולוציטים באמצעות זרם ציטוטוטרי

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and immunological tolerance, while in immunocompromised patients, conidia can colonize airways and cause severe invasive respiratory disorders. Various cells in different airway compartments are involved in the immune response that prevents fungal invasion; however, the spatio-temporal aspects of pathogen elimination are still not completely understood. Three-dimensional (3D) imaging of optically cleared whole-mount organs, particularly the lungs of experimental mice, permits detection of fluorescently labeled pathogens in the airways at different time points after infection. In the present study, we describe an experimental setup to perform a quantitative analysis of A. fumigatus conidia distribution in the airways. Using fluorescent confocal laser scanning microscopy (CLSM), we traced the location of fluorescently labeled&#160;conidia in the bronchial branches and the alveolar compartment 6 hours after oropharyngeal application to mice. The approach described here was previously used for detection of the precise pathogen location and identification of the pathogen-interacting cells at different phases of the immune response. The experimental setup can be used to estimate the kinetics of the pathogen elimination in different pathological conditions.

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

We describe the method for quantitative analysis of the distribution of Aspergillus fumigatus conidia (3 &#181;m in size) in the airways of mice. The method also can be used for the analysis of microparticles and nanoparticle agglomerate distribution in the airways in various pathological condition models.

קונפוקלית לייזר סריקה מיקרוסקופיה מבוסס ניתוח כמותי של אספרגילוס פומיגטוס קונידיה ריאות עכבר נקי לחלוטין

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and ...

יעילות פינוי פטרייתי של מקרופאגים

Viability Assay of Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages

Macrophages represent a crucial line of defense and are responsible for preventing the growth and colonization of pathogens in different tissues. Conidial phagocytosis is a key process that allows for the investigation of the cytoplasmic and molecular events involved in macrophage-pathogen interactions, as well as for the determination of the time of death of internalized conidia. The technique involving the phagocytosis of fungal conidia by macrophages is widely used for studies evaluating the modulation of the immune responses against fungi. The evasion of phagocytosis and escape of phagosomes are mechanisms of fungal virulence. Here, we report the methods that can be used for the analysis of the phagocytosis, clearance, and viability of T. stromaticum conidia, a fungus which is used as a biocontrol and biofertilizer agent and is capable of inducing human infections. The protocol consists of 1) Trichoderma culture, 2) washing to obtain conidia, 3) the isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using the polysucrose solution method and the differentiation of the PBMCs into macrophages, 4) an in vitro phagocytosis method using round glass coverslips and coloration, and 5) a clearance assay to assess the conidia viability after conidia phagocytosis. In summary, these techniques can be used to measure the&#160;fungal clearance efficiency of macrophages.

מחבר זרקור: חשיפת יחסי הגומלין בין Trichoderma stromaticum לבין מערכת החיסון של יונקים

The technique involving the phagocytosis of fungal conidia by macrophages is widely used for studies evaluating the modulation of the immune responses against fungi. The purpose of this manuscript is to present a method for evaluating the phagocytosis and clearance abilities of human peripheral blood mononuclear-derived macrophages stimulated with Trichoderma stromaticum conidia.

בדיקת כדאיות של Trichoderma stromaticum conidia בתוך מקרופאגים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי

Macrophages represent a crucial line of defense and are responsible for preventing the growth and colonization of pathogens in different tissues. Conidial ...

הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride

מיקרוסקופיה וידאו חי מתא phagocytosis הפתוגן פטרייתיים

שימוש cytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח

הדמיה חיה של פעילות אנטי פטרייתי על ידי אדם מן המעלה הראשונה נויטרופילים ומונוציטים בתגובה

לומד את התפקיד של מכתשיים מקרופאגים סרטן שד גרור

בהערכת Vivo של מכתשי מקרופאג Efferocytosis בעקבות חשיפת האוזון

מדידת פאיגוציטוזה של אספרגייוס מחטאים מחט על ידי האדם לוקיולוציטים באמצעות זרם ציטוטוטרי

קונפוקלית לייזר סריקה מיקרוסקופיה מבוסס ניתוח כמותי של אספרגילוס פומיגטוס קונידיה ריאות עכבר נקי לחלוטין

בדיקת כדאיות של Trichoderma stromaticum conidia בתוך מקרופאגים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי

בדיקת כדאיות של Trichoderma stromaticum conidia בתוך מקרופאגים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי