עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה והמחלות מדבקות גרנט R01AI079253 (לBHS), ועל ידי המכון הלאומי לסרטן סרטן מרכז תמיכת גרנט CA016056 לRoswell Park Cancer Institute.

כל ההליכים שבוצעו בבעלי חיים במחקר זה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים והשימוש בRoswell Park Cancer Institute ועמדו בכל המדינה, הפדרלית, והמכון הלאומי לתקנות בריאות. 1. בvivo Macrophage תיוג הערה: PHK26 הוא צבע lipophilic שיינקט על ידי תאי phagocytic גם במחזור וברקמות, כאשר בהזרקה לווריד (IV). PKH26 שימש לסימון in vivo כדי למזער את הכמות של מניפולציה לאחר הקטיף של מקרופאג. יש PKH-26 היתרון של יציבות צבירה במקרופאגים מכתשיים לאורך תקופות ממושכות. מחכה 10 ימים לאחר מתן מאפשר סליקה של כל התאים שכותרתו ממחזור ומשאירים רק מכתשיים מקרופאג שכותרתו ביציבות עם PKH26 8, 9. PKH26 הוא fluorochrome אדום שיש עירור (551 ננומטר) ופליטת מאפיינים (567 ננומטר) תואמיםעם מערכות rhodamine או זיהוי phycoerythrin. כל הליך תיוג יכול להציג את החפץ, לרבות אובדן יכולת הקיום. עם זאת, מאחר שאנו משתמשים באותה הגישה לתיוג של מקרופאגים בגנוטיפים עכבר שונים (למשל, WT לעומת NADPH אוקסידאז לקוי), את ההשפעות של חפצים אלה יהיו אחידות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל פתרון מניות של PKH26 (1 x 10 -3 M באתנול) 1:05 ב-C diluent המסופק על ידי יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> של PKH26 דילול עומס 100 μl לתוך מזרק 1/2 מיליליטר אינסולין (29 G x 1/2 &quot;) לכל עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל לעכברים בהזרקת IV (או וריד זנב או מסלולית רטרו) 10 ימים לפחות לפני הקציר. </li></ol> 2. קציר מכתשיים המקרופאגים על ידי שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL) מספר העכברים לשימוש עבור ניסוי יכול להשתנות. תשואה אופיינית מעכבר unstimulated היא בטווח של 3-5 x 10 5 מקרופאגים מכתשיים, אולם מספר זה יכול להשתנות במידה רבה BASאד בגורמים כגון גודל של העכבר, החוויה של האדם שבצע את שטיפה, ומספר instillations של נוזל שטיפה והנפח נסוג מריאות. בפרוטוקול זה שטיפת ריאות מתבצעת עם חלל בית החזה סגור אשר יחד עם lavages 1 מיליליטר חוזר ונשנה עוזר להגדיל את תשואת תא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את עכבר על ידי מתן מנה קטלנית של חומר ההרדמה Avertin (12.5 מ&quot;ג) intraperitoneally (IP) באמצעות תנאים אספטיים כדי לשמור על התמיסה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספריי עכבר ביסודיות עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העור מקצה הגולגולת של בעלי חיים וחושפים את בית החזה (איור 1 א). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן בעור ממש מתחת לסרעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את האצבע לתוך החתך ולמשוך את עור מקצה הגולגולת של (איור 1 א) לבעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף את מעט על הראש, המשתרע בצד הגחוני של הצוואר (איור 1 א). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חור קטן שדרך כלוב הצלעותלצד הימני של בית החזה כדי להוציא את האוויר לריאות וגם לאפשר הדמיה של ריאות במהלך השלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את קנה הנשימה, ובזהירות לנתח משם רקמה שמסביב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בלוטות רוק, שרירי sternohyoid וגרון, וכו &#39;עם מלקחיים מעוקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להרים עם מלקחיים מעוקלים ולחתוך עם מספריים הרקמה דקה המכסה את קנה הנשימה (adventitia) לחשוף את מבנה סחוס טבעתי שבבסיס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קטטר לתוך קנה הנשימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים מעוקלים, הנח תפר מאחור (גב ל) קנה הנשימה ולשלוף אורך 10 סנטימטר דרך הפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מעל cricoid (הטבעת המעובה של סחוס) ינחה בזהירות קטטר G 22 המורד קנה הנשימה לעצור בו את קנה הנשימה נעלמת מאחורי עצם החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוקף לקשור תפר סביב קנה הנשימה וקטטר להתאמה הדוקה. הסר את המחט מקטטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב ברזלים 4 כיוונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלאאחד 6 מיליליטר המזרק עם DPBS, FBS 1% ולצרף לברזלי 4 כיוונים כפי שמצוין באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מזרק מיליליטר ריק 6 במיקום מצויינים על ברזלים 4-way (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף נמל פתוח בברזלים 4-דרך קטטר (איור 1). היזהר שלא לסלק קטטר מקנה הנשימה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף שטיפת נוזלים מריאות. הערה: חוקרים יכולים לבחור להשתמש בכמויות נמוכות יותר של נוזל שטיפה כדי למזער את האפשרות של נזק לרקמות. זה חשוב כי באותה הגישה יש ליישם באופן עקבי בכל קבוצות העכבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הידית על ברזלים כך המזרק הריק סגור ולאט להזריק DPBS ~ 1 מיליליטר, 1% FBS לנפח את הריאות. שים לב לאינפלצית ריאה דרך החור בשלב 2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היזהר שלא overinflate הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הידית על ברזלים, כך שהמזרק המלא סגור, ולסגת בזהירות השפעת<html> id מהריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לריאות להוציא את האוויר דרך החור בשלב 1.4. קטטר ייתכן שיצטרך להזיז מעט אחורה או אחורה כדי לקבל הגרלה טובה. לנקוט אמצעי זהירות מיוחדת כדי לשמור את הקטטר בתוך קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.8.1-2.8.4 5-6x עד שכל DPBS, 1% FBS כבר הזריק ונסוג מהריאות. הערה: התאוששות של ריאות נוזל לא תהיה של נוזל מוזרק 100%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק ריק עם נוזל שטיפה לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. לשמור על תאים בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים על ידי צנטריפוגה XG 300 5 דקות בטמפרטורת חדר ויוצקים את supernatant. זו ניתן לשמור לניתוח ציטוקינים אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים ב1-5 מיליליטר RPMI 1640 עם FBS 10% ולסמוך על hemocytometer. בעכבר unstimulated,&gt; 95% מתאים שנקטפו על ידי BAL צפויים להיות מקרופאגים, אשר יכול להיות מאושר על ידי ציטולוגיה. </li></ol> 3. Culturing וקציר פטרייה &quot;&gt; Fumigatus Aspergillus שימוש בפרוטוקול זה מבטא GFP בכל שלבי מחזור החיים שלו:. נבגים, germlings ועובש פטרייתי זן זה הניתן על ידי ד&quot;ר מרגו מור, אוניברסיטת סיימון פרייזר, Burnaby, BC, קנדה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נבגי צלחת של מתח fumigatus Aspergillus להביע GFP בעירוי לב מוח Sabouraud (BHI) אגר שיפועים עם Chloramphenicol (0.05 גר &#39;/ ל&#39;) וגנטמיצין (0.5 גר &#39;/ ל&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בחושך כתרים באופן רופף ל7-10 ימים בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר נבגים על ידי אלכסון כביסה עם 10 מיליליטר של 0.01% Tween 20 בDPBS. קל לגרד את הפטרייה עם stripette כדי לשחרר. יש לשטוף את השיפוע מספר פעמים כדי להגדיל את התשואה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובר השעיה נבגים דרך מסננת תא 100 מיקרומטר ל50 מיליליטר חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה נבגים על ידי צנטריפוגה ב XG 400 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נבגי resuspend ב 50 DPBS מיליליטר ולספור באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף פעמיים עם DPBS ולדלל את ריכוזים רצוייםטיפול במשפחה. </li></ol> 4. פטרייתיים אתגר ומיקרוסקופיה confocal כדי לחקור את התפקיד של מונואמין NADPH מקרופאג בהגנת מארחת, את היכולת של מקרופאגים מכתשיים מבודדים מעכברים של שלושה גנוטיפים לשלוט על הצמיחה של נבגי אספרגילוס phagocytosed הוערכה. גנוטיפים השתמשו במחקר זה כוללים; 1) wild-type עכברים, 2) Ncf1 * / * Mn-עכברים עם מוטציה Ncf1 טבעית (Ncf1 מקודד לphox p47, רכיב הנדרש של מונואמין NADPH תא בלען) ומשאיר אותם חסר מונואמין NADPH, ו3) Ncf1 * / * Mn + עכברים הטרנסגניים (MN מציין transgene מחסה wildtype Ncf1 תחת השליטה של אמרגן CD68 אדם) שבו פעילות מונואמין NADPH כבר מחדש באוכלוסיית מונוציטים / מקרופאג 10, 11. מיקרוסקופיה confocal היא מתאימה ביותר עבור assay זה בשל נוכחותםוצמיחה של נבגים שאינם phagocytosed בשקופיות. מיקרוסקופ confocal יאפשר להדמיה של מטוסים בודדים בתוך ציר ה-Z, ולאפשר הבחנה בין הפטרייה גדלה בסביבה ולא בתוך מקרופאג. כל תמונות confocal נרכשות באמצעות עדשת טבילת שמן 63X. Z-ערימות נרכשות עם גורם הזום אלקטרוני של 2.5. העובי של Z-מחסנית נקבע באמצעות DAPI ותמונות שדה בהירים כדי לאתר את החלק העליון ותחתון של השדה. Z-ערימות נעו 14-24 מיקרומטר עם פרוסות בודדות ~ 1 מיקרומטר עבה. לכימות של מקרופאגים, סריקות יחידה של זום האלקטרוני 1X בוצעו על 10 שדות לכל גנוטיפ. מקרופאגים ללא פגע זוהו מבוסס על PKH26 ומכתים DAPI של הקרום וגרעין בהתאמה. נבגים זוהו מבוסס על ביטוי FITC ותמונת שדה בהיר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את coverslips וצלחות סטרילי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת ארון בטיחות ביולוגית, לספוג 22 x 22 coverslips זכוכית מ&quot;מ בethano 70%l ל5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף coverslips ב PBS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים סטרילית, מניח בעדינות coverslip יחיד בתחתית היטב בכל צלחת 6 היטב ארוזה בנפרד סטרילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע ~ 1 x 10 6 נקטף PKH26 כותרת מקרופאגים מכתשיים מושעים ב300 μl RPMI 1640, FBS 10% על כל coverslip. המספר המדויק עשוי להשתנות תלוי בתשואת הקציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר מקרופאג לדבוק ידי דוגרים על 37 ° C עם 5% CO 2 בלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, להוסיף ~ 1 x 10 7 א-GFP-לבטא נבגי fumigatus מושעים ב100 μl RPMI 1640, 10% FBS (37 מעלות צלזיוס) מחומם מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את צלחת לאינקובטור 37 ° C עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צריכים להיות קבועים למשך התקופה מינימאלית של 2 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C. בבית 3, 7, ו14 תאים לתקן את שעה על ידי הוספת נפח שווה של פורמלדהיד 2% לכל טוב (ריכוז סופי פורמלדהיד 1%). צלחות מקוםנקודות זמן המוקדם ב 4 ° C למשך הלילה. לנקודת הזמן הסופית (14 hr), לתקן את התאים בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, בעדינות להסיר coverslips באמצעות מלקחיים ולשטוף בDPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את הנוזלים עודפים על ידי הצבת קצה coverslip על Kimwipe מקופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 6 הרכבה בינונית הקרינה μl עם DAPI לשקופית הזכוכית מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קצה אחד של coverslip בשקופית ובעדינות שחרר עם צד תא למטה להרכבה בינונית. הרכבה בינונית תתפשט ויוצר שכבה אחידה מתחת coverslip. אין צורך ללחוץ על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום קצוות של coverslip עם לק ברור ולאפשר לאוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות שקופיות מוכנה בקופסא שקופיות (המוגנת מפני אור) בטמפרטורת חדר עד מוכן לנתח על ידי מיקרוסקופיה confocal. </li></ol>

<ol>
	<li>Reeves, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+activity+of+neutrophils+is+mediated+through+activation+of+proteases+by+K++flux.">Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux.</a> Nature. 416, 291-297 (2002).</li><li>Bianchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis.">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2622 (2009).</li><li>Vethanayagam, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+NADPH+oxidase+versus+neutrophil+proteases+in+antimicrobial+host+defense.">Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Grimm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-+and+Macrophage-Targeted+NADPH+Oxidase+Mediates+Antifungal+Host+Defense+and+Regulation+of+Acute+Inflammation+in+Mice.">Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice.</a> The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).</li><li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+protection+against+conidia+by+mononuclear+and+against+mycelia+by+polymorphonuclear+phagocytes+in+resistance+to+Aspergillus.+Observations+on+these+two+lines+of+defense+in+vivo+and+in+vitro+with+human+and+mouse+phagocytes.">Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).</li><li>Philippe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+Aspergillus+fumigatus+by+alveolar+macrophages+is+mediated+by+reactive+oxidant+intermediates.">Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates.</a> Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).</li><li>Cornish, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+nicotinamide+adenine+dinucleotide+phosphate+oxidase-independent+resistance+to+Aspergillus+fumigatus+in+alveolar+macrophages.">Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages.</a> J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).</li><li>Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+recruited+to+the+lungs+of+mice+during+immune+inflammation+ingest+apoptotic+cells+poorly.">Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).</li><li>Davidson, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DISCRIMINATION+OF+RESIDENT+AND+INFILTRATED+ALVEOLAR+MACROPHAGES+BY+FLOW+CYTOMETRY+IN+INFLUENZA+A+VIRUS-INFECTED+MICE.">DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE.</a> Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).</li><li>Gelderman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+suppress+T+cell+responses+and+arthritis+development+in+mice+by+producing+reactive+oxygen+species.">Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species.</a> J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).</li><li>Pizzolla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+produced+by+the+NADPH+oxidase+2+complex+in+monocytes+protect+mice+from+bacterial+infections.">Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections.</a> J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).</li><li>Luther, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+phagocytic+uptake+of+Aspergillus+fumigatus+conidia+by+macrophages.">Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages.</a> Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).</li><li>Geunes-Boyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+Protein+D+Increases+Phagocytosis+of+Hypocapsular+Cryptococcus+neoformans+by+Murine+Macrophages+and+Enhances+Fungal+Survival.">Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival.</a> Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).</li><li>Garc&#237;a-Rodas, R., Gonz&#225;lez-Camacho, F., Rodr&#237;guez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interaction+between+Candida+krusei+and+Murine+Macrophages+Results+in+Multiple+Outcomes,+Including+Intracellular+Survival+and+Escape+from+Killing.">The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing.</a> Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).</li><li>Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+from+C3H/HeJ+mice+show+sensitivity+to+endotoxin.">Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).</li><li>Redente, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+polarization+of+alveolar+macrophages+and+bone+marrow-derived+monocytes+following+chemically+and+pathogen-induced+chronic+lung+inflammation.">Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation.</a> J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).</li><li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+Aspergillus+spores+depends+on+the+anatomical+source+of+the+macrophage.">Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage.</a> Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).</li><li>Goodridge, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+use+of+CARD9+by+dectin-1+in+macrophages+and+dendritic+cells.">Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells.</a> J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

השימוש בגישה זו לניתוח vivo לשעבר של הפעילות נגד פטריות של מקרופאגים יחד עם אתגר פטרייתי in vivo, שהוכחנו בעבר כי מונואמין NADPH במקרופאגים ממלא תפקיד חשוב בהגנה מפני א 4 fumigatus. שימוש במקרופאגים מכתשיים מבודדים מאפשרים לנו להתמקד בפעילות נגד פטריות שלהם ?...

מקרופאגים מכתשיים הם תאי phagocytic הקו הראשון שנתקלים בחיידקים בשאיפה. המקרופאגים מכירים מוטיבים אספרגילוס על ידי קולטנים זיהוי הפתוגן, לבלוע ולהגביל את הצמיחה של נבגים בשאיפה (נבגים), וליזום תגובות דלקתיות. מונואמין NADPH התא בלען ממיר חמצן מולקולרי לאניון סופראוקסיד ביניים במורד הזרם חמצן מגיבים (ROIs). המחלה granulomatous כרונית (CGD) היא הפרעה תורשתית של מונואמין NADPH מתאפיין בזיהומים חיידקיים ופטרייתיים חמורים ועל ידי תגובות דלקתיות מוגזמות. למרות מונואמין NADPH הוא קריטי להגנה מארחת בתיווך נויטרופילים 3 - 1, את החשיבות של מונואמין NADPH במקרופאגים אינה מוגדרת היטב. מחקרים קודמים הראו כי מקרופאגים מכתשיים לבלוע ולהרוג נבגי אספרגילוס, בעוד שהנויטרופילים בעיקר למקד את שלב hyphal 5. עם זאת, היו resul סותרts כלתפקיד של מונואמין NADPH במקרופאג בשליטה על הצמיחה של א &#39; fumigatus נבגי 6, 7. מטרתה של שיטה זו הייתה להתוות את התפקיד הספציפי של מונואמין NADPH במקרופאגים בתיווך הגנת מארחת נגד א &#39; נבגי fumigatus. מצאנו כי מונואמין NADPH במקרופאגים מכתשיים שולט על הצמיחה של א &#39;phagocytosed fumigatus נבגי 4. למודל תגובת המארח לפטריות בשאיפה באופן הדוק ביותר, השתמשנו מקרופאגים מכתשיים שנקטפו על ידי שטיפה ברונכואלוואולרית מעכברי unstimulated הבא להקריב באופן מיידי. שימוש במקרופאגים מכתשיים מבודדים אפשרו לנו להתמקד בפעילות נגד פטריות שלהם בהיעדרם של תאים חיסוניים אחרים (למשל נויטרופילים שגויסו,) שלהתגונן מפני אספרגילוס in vivo. בשיטה זו, מקרופאגים מכתשיים הוכתמו in vivo לפני קציר, כדי למזער את הכמות של מניפולציה לאחר קטיף. &lt;/ P&gt; יתרון נוסף לפרוטוקול זה הוא השימוש בא-GFP-לבטא זן fumigatus. פטרייה זו מבטאת GFP משלב הנבגים דרך שלב hyphal ואין לו צורך בצביעה נוספת. כדי להשיג תמונות עם פירוט רב יותר, בחרנו מיקרוסקופיה confocal המאפשרת הבנייה מחדש של מבנים תלת ממדיים מהתמונות שהושגו. שחזור תלת ממדי נותן את היכולת להבדיל בין העובש גדל בסביבה ולא באו באמצעות מקרופאג. נבגים יכולים להיות גם בדיוק מכובדים כתאי לעומת תאי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PKH26GL-1KT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2,2,2 Tribromoethanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T48402</td>
			<td>Used to make AvertinAnesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-methyl-2-butanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A-1685</td>
			<td>Used to make AvertinAnesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">NH4CL</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A0171</td>
			<td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">KHCO3</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P91444</td>
			<td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter</td>
			<td style="width:71px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">381523</td>
			<td>Insyte Autoguard Winged</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">insulin syringes</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6 ml syringes</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4-way stopcock</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-700-077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">suture thread</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gauze sponges (4 inch square)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30396.03</td>
			<td>heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hema 3 Stain Set</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-122-911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cytoseal 60</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants</td>
			<td style="width:71px;">BD&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">297252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100 micron Cell Strainers</td>
			<td style="width:71px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">64753-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">scissors</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">forceps</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biological Safety Cabinet Class II</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leica DM1000 light microscope</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cytospin 2 centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Cell Culture Incubator</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>37 &#176;C, 5%&#160; CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">22X22 mm micro cover glass</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48366-227</td>
			<td>glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6 well Cell Culture Plates</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH0502-1LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vectashield Mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:71px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leica TCS SP2 system with a laser point scanner</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing anti-fungal activity of isolated alveolar macrophages by confocal microscopy

הריאות היא ממשק שבו תאי מארח נחשפים באופן שיגרתי לחיידקים ומוצרים של חיידקים. מקרופאגים מכתשיים הם תאי phagocytic הקו הראשון שנתקלים בפטריות בשאיפה וחיידקים אחרים. המקרופאגים ותאים אחרים של מערכת חיסון לזהות את המוטיבים אספרגילוס על ידי קולטנים זיהוי הפתוגן וליזום תגובות דלקתיות במורד הזרם. מונואמין NADPH תא בלען מייצר ביניים חמצן מגיבים (ROIs) והוא קריטי להגנה מארחת. למרות מונואמין NADPH הוא קריטי להגנה מארחת בתיווך נויטרופילים 3 - 1, את החשיבות של מונואמין NADPH במקרופאגים אינה מוגדרת היטב. מטרת המחקר הנוכחי הייתה להתוות את התפקיד הספציפי של מונואמין NADPH במקרופאגים בתיווך הגנת מארחת נגד א &#39; fumigatus. מצאנו כי מונואמין NADPH במקרופאגים מכתשיים שולט על הצמיחה של א &#39;phagocytosed fumigatus נבגי 4. כאן אנו מתארים שיטה להערכת היכולת של עכברמקרופאגים lveolar (AMS) לשלוט על הצמיחה של נבגי phagocytosed אספרגילוס (נבגים). מקרופאגים מכתשיים הם מוכתמים בvivo ועשרה ימים לאחר מכן בודדו מעכברים על ידי שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL). המקרופאגים הם מצופים על coverslips זכוכית, ולאחר מכן זורעים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) להביע א נבגי fumigatus. בזמנים שצוינו, תאים הם קבועים ומספר מקרופאגים שלמים עם נבגי phagocytosed נבחנים על ידי מיקרוסקופיה confocal.

<html> איסוף מקרופאג מכתשיים ידי BAL מעכברי unstimulated יגרום&gt; 95% מאוכלוסייה טהורה המבוססת על ציטולוגיה. 3 ו 7 שעות (איור 2) נקודות זמן להקדים את שלב hyphal של פטרייתי צמיחה ולאפשר השוואה של יעילות phagocytic של נבגים בין גנוטיפים. נקודת הזמן 14 שעות היא שבו ניתן להשוות גנוטיפים ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy at JoVE.com

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

שיטה כדי להעריך את יכולתם של מקרופאגים מכתשיים עכבר בודדים לשלוט על הצמיחה של נבגי אספרגילוס phagocytosed ידי מיקרוסקופיה confocal.

הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

assessing-anti-fungal-activity-isolated-alveolar-macrophages-confocal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K Views.  Roswell Park Cancer Institute.  שיטה כדי להעריך את יכולתם של מקרופאגים מכתשיים עכבר בודדים לשלוט על הצמיחה של נבגי אספרגילוס phagocytosed ידי מיקרוסקופיה confocal. 

Video: Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

הדמיה של Dynamics התאים מיאלואידית בזמן אמת<em&gt; Apc<sup&gt; מינימום / +</sup</em&gt; מעיים גידולים על ידי דיסק מסתובב Confocal מיקרוסקופית

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Proteomic פרופיל של המקרופאגים על ידי 2D אלקטרופורזה

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

דור וזיהוי GM-CSF נגזר מכתשיים דמוי מאקרופאגים דנדריטים תאי עכבר מח עצם

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

אפיון פנוטיפי של מקרופאגים כליה עכברוש ידי cytometry זרימה

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

בידוד, אפיון, טיהור של מקרופאגים רקמות מושפעות על ידי דלקת הקשורות להשמנת יתר

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של Phagocytosis על ידי העכבר מקרופאגים

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.