LPE הוא עמית קליני בכיר סקוטי ומודה לתמיכה של לשכת המדען הראשית (SCD/03). עבודה זו מומנה על ידי קרן Wellcome הפרויקט גרנט לLPE (089930). NARG מומן על ידי קרן Wellcome תכנית גרנט (080088) וציוד גרנט (075470) (לDeltaVision), ועל ידי FP7-2007-2013 גרנט (בריאות-F2-2010-260338-ALLFUN). ברצוננו להודות לאוניברסיטה של ​​מתקן הדמית אברדין, בקווין מקנזי בפרט, על תמיכה ועצות מועילות.

1. ג צמיחה ותנאי קנדידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הצלחות אגרו SC-URA ידי הוספת בסיס חנקן שמרים גרמו 6.9 ללא חומצות אמינו, 1 מ&quot;ל 1 M NaOH, 10% מ&quot;ל 1 (w / v) מלח hemisulphate אדנין ואגר 20 גרם טכני (שתואר בעבר בהרחבה ב11). הפוך את הנפח עד 900 מ&quot;ל עם H 2 O. המזוקק חיטוי, לאפשר אגר להתקרר, אבל לא מספיק כדי לבסס, ולאחר מכן להוסיף 50 40% D-גלוקוז סטרילית מ&quot;ל ו 50 מיליליטר נשירת 4% סטרילי SC-אורה בתנאים אספטיים. מערבבים, יוצק לצלחות הפטר ולהשאיר את הצלחות אגרו להתקרר ולחזק. צלחות אגרו חנות בשעה 5 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרצף ג קנדידה סרוטיפ מתח CAI4 + CIp10 ממניות גליצרול מאוחסן ב-80 ° C לצלחת אגר SC-אורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלחת ב 30 מעלות צלזיוס עד שצורת מושבות וחנות בשעת 5 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות יחיד ג קנדידה מושבה ב5 מ&quot;ל SC-אורה בינוני (כמו במתכון 1.1, אך ללא אגר טכני) ו דגירת הלילה בשעת 30מעלות צלזיוס, 200 סל&quot;ד ליצור שלב ג הנייח קנדידה. </li></ol> 2. ג כתמי קנדידה שימוש Isothiocyanate fluorescein (FITC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 ג μl תרבות לילה קנדידה עד 990 PBS μl (pH 7.4) ולבצע ספירת תאים באמצעות haemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לסייע להדמיה של ג קנדידה במהלך מבחני פאגוציטוזיס, כתם 1 × 10 8 ג קנדידה באמצעות 1 מ&quot;ג / המ&quot;ל FITC במאגר 0.05 M-יקרבונט קרבונט (pH 9.6) למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר FITC המאוגד, לשטוף ג קנדידה ב1 המ&quot;ל PBS x 1, צנטריפוגה ב3000 × גרם במשך 5 דקות, להסיר supernatant ו resuspend גלול ב 1 המ&quot;ל PBS x 1. חזור 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב1 × 10 6 תאים / μl בx PBS 1. </li></ol> 3. הכנה של שורת תאי macrophage עכבר J774.1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור J774.1 המקרופאגים ברקמות 2 סנטימטר 75צלוחיות תרבות במדיום DMEM בתוספת 10% (v / v) עוברי עגל בסרום (FCS), 200 U / מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין ו2 מ&quot;מ L-גלוטמין על 37 המעלות צלזיוס עם 5% CO 2. ההכנה של מקרופאגים העיקריים מתוארת בפירוט במקום אחר 12, 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד J774.1 תאים מבקבוק תרבית הרקמה ולהעביר לצינור פלקון 50 מ&quot;ל. צנטריפוגה ב 600 × גרם במשך 5 דקות לקבלת תא גלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת supernatant ו resuspend גלול ב 10 מיליליטר מדיום DMEM להשלים מראש מחומם. ספירת תאים באמצעות haemocytometer וצלחת 1 × 10 6 J774.1 מקרופאגים בתוספת 2 מ&quot;ל DMEM בינוני בצלחת זכוכית הדמיה מבוססת 35 מ&quot;מ. דגירת הלילה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההדמיה, יחליף מדיום DMEM בתוספת 2 מ&quot;ל מראש חמם ​​בינוני תוספת CO 2-עצמאי (עם 10% (v / v) עוברי עגל בסרום (FCS), 200 U / מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין ו2 מ&quot;מ L-גלוטמין) מכיל 1 מיקרומטר LysoTracker האדום DND-99.</li></ol> 4. Assay החי Cell וידאו המיקרוסקופי phagocytosis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבחירה של מיקרוסקופ יהיה תלויה מה זמין באופן מקומי, אבל התקנת מיקרוסקופ תצטרך לכלול שלב הפוך, קאמרי סביבתית מחומם ל 37 מעלות צלזיוס ומסנני עירור / פליטה לכתמים שנבחרו (FITC וTRITC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תנור מיקרוסקופ לפני הניסוי ולאפשר מספיק זמן לחדר הבקרה הסביבתי לחמם עד 37 מעלות צלזיוס הזמן שלוקח לטמפרטורת חדר כדי לייצב ישתנה עבור setups מיקרוסקופ השונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המחשב ומיקרוסקופ, ולטעון את תוכנת ההדמיה. הר צלחת ההדמיה על במת מיקרוסקופ ולהתאים את הפוקוס כדי למצוא את J774.1 מקרופאגים. ייעל את המראה של תמונות TRITC ודסק&quot;ש על ידי התאמת אחוז האור מועבר וזמני חשיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא את כלי ההדמיה ולהוסיף 3 × 10 6 FITC מוכתם ג קנדידה לtהוא המנה. רשום את הזמן שג קנדידה מתווספת למנה. להחזיר את הצלחת לבמה ולייעל את המראה של תמונות FITC במידת צורך. הגדר את רשימת נקודות במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחל הדמיה כאשר כל הנקודות נמצאות בפוקוס ואת הערוצים מותאמים. צלם תמונות FITC, TRITC ודסק&quot;ש בכל דקה במשך 6 שעות. </li></ol>

<ol>
	<li>McKenzie, C. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Candida+albicans+cell+wall+components+to+recognition+by+and+escape+from+murine+macrophages.">Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages.</a> Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).</li><li>Mora-Montes, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+blocking+of+innate+immunity+cells+by+Candida+albicans+chitin.">Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin.</a> Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).</li><li>Keppler-Ross, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+yeast+by+murine+macrophages+requires+mannan+but+not+glucan.">Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan.</a> Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).</li><li>Vijayan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mincle+polarizes+human+monocyte+and+neutrophil+responses+to+Candida+albicans.">Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans.</a> Immunol. Cell Biol. , (2012).</li><li>Seider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation.">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).</li><li>Sheth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+status+of+the+C.+albicans+cell+wall+affects+the+efficiency+of+neutrophil+phagocytosis+and+killing+but+not+cytokine+signalling.">Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling.</a> Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).</li><li>Lewis, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage+specific+assessment+of+Candida+albicans+phagocytosis+by+macrophages+identifies+cell+wall+composition+and+morphogenesis+as+key+determinants.">Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).</li><li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialoadhesin+Promotes+Rapid+Proinflammatory+and+Type+I+Interferon+Responses+to+a+Sialylated+Pathogen,+Campylobacter+jejuni.">Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni.</a> J. Immunol. , (2012).</li><li>Lewis, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+infection+inhibits+macrophage+cell+division+and+proliferation.">Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li><li>Bain, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic+expulsion/exocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages.">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li><li>Mora-Montes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+macrophages+and+cell+wall+oligosaccharides+of+Candida+albicans.">Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).</li><li>McPhillips, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptotic+cell+phagocytosis+by+macrophages.">Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).</li><li>Erwig, L. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+phagosome+maturation+in+macrophages+and+dendritic+cells+mediated+by+Rho+GTPases+and+ezrin-radixin-moesin+(ERM)+proteins.">Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).</li></ol>

המחברים אין לי מה לחשוף. NG הוא מקבל תמיכת מענק בלתי מוגבלת למחקר בסיסי במדעי הגלעד. LE עובד כיועץ לחברת GSK בפיתוח תרופות בשלב מוקדם.

הנה השיטה לשימוש במיקרוסקופ וידאו חי תאים ללמוד phagocytosis macrophage מתוארת. מיקרוסקופיה וידאו מציעה רבדים נוספים רבים של מידע לצורך הניתוח. יתרון בסיסי אחת הוא שנתוני ספיגה יכולים להיות שנוצרו (מניסוי בודד) עבור כל נקודת זמן לאורך התקופה של 6 שעתי התצפית. וחשוב יותר, בשיטה המתוארת מאפשרת ניתוח הפרש של השלבים הפרטניים של phagocytosis. יש לנו, למשל, הראה כי שינויים בספיגה כוללת של ג glycosylation קנדידה ומוטנטים המורפוגנזה ששורות תאים macrophage ומקרופגים העיקריים יכולות להיות כתוצאה משינויים בהגירת macrophage כלפי תאי מטרה או שיעור של בליעה פעם קשר תאי תאים היא הוקמה 7. ישנן מספר המלכודות להימנע בעת ביצוע ניסויים אלה. ראשית, חשוב מאוד על מנת להבטיח תנאים סביבתיים יציבים לאורך proce הניסיוני<html> דורה. זו מושגת הטובה ביותר בחדר סביבתי שנקבע לתנאי הניסוי כמה שעות לפני תחילת הניסוי. איכות וידאו תלויה מאוד במודולים מתוחכמים המשתמשים בלייזרים אינפרא אדומים כדי לשמור באופן אוטומטי מדגם Z-עמדה ללא קשר לשינויים מכאניים או תרמית ובכך לחסל את הצורך בתיקוני מיקוד ידני. בהתחשב באופי הארוך של הניסויים, חשוב להגביל את חשיפת אור ליזר ואפקטי photobleaching וphotoconversion קשורים, שניתן למזער על ידי העסקת סמני ניאון גבוה, המאפשרים זמני חשיפה נמוכות. הפרוטוקול המכתים FITC המתואר כאן הוא מהיר ואמין. כFITC הוא פעמים בהירות מאוד ויציבות כתם, נמוכות חשיפה נדרשות וזה הופך אידיאלי FITC לסרטים ארוכים זמן לשגות. עם זאת, אנו משתמשים באופן שגרתי במגוון של כתמי היעד שונים, כולל צבעי PKH Calcofluor לבן וכמו גם אורגניזמים מתויגים. ילדה = &quot;jove_content&quot;&gt; רוב העבודה שלנו פורסמה מתבצע באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב, אך ניתן למזער חשיפה נוספת באמצעות מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב בידות שלנו וזה חיוני למיקרוסקופיה וידאו 3D זמן לשגות. במהלך מחקר זה, תמונות שנתפסו במרווחי 1 דקות מעל assay phagocytosis 6 שעות. המרווח בין תמונות יכול להיות מותאם בהתאם לתהליך נחקר. לדוגמה, המרווח יכול להיות ירידה כאשר חוקרים תהליכים מהירים כגון סחר פוחי. מרווח הזמן המינימאלי יהיה מוגבל על ידי מפרטי מיקרוסקופ ומצלמה. יש כמה שיקולים שכדאי לזכור בעת כוונון תזמונים. ראשית, ירידה במרווח בין תמונות תהיה אומרת פחות נקודות יכולות להיות צלמה וגודל קובץ יהיה במידה ניכר. להיפך, להגדיל את מרווח התמונה יותר מדי יעשה את הסרט יאבד את הרצף. גישה זו יכולה להיות מיושמתבעיקרון ללמוד פתוגנים וספיגה למות תאי מארח אחרים. לדוגמה, שהראינו לאחרונה כי מקרופאגים שמקורם של מח עצם מעכברים sialoadhesin-לקויים להפגין מופחתים מאוד מחייב וphagocytosis של קמפילובקטר jejuni sialylated 8. עם זאת, גודל היעד הוא גורם חשוב להיתכנות, כמו ניתוח תמונה הופך קשה יותר ויותר עם ירידה בגודל תא המטרה. תוכנת ניתוח תמונה מתוחכמת חיונית לניתוח מיקרוסקופי וידאו מהיר, וזה צריך להיות בשילוב עם תמיכה ביואינפורמטיקה המתאימה כדי להקל על הדור של אלגוריתמים ללמוד הגירה של תאים בודדים ואוכלוסיות שלמות של תאים 7. מיקרוסקופיה וידאו חי תאים בשילוב עם תוכנת עיבוד תמונה מתוחכמת לניתוח דקה אחרת דקה של הגירה ואינטראקציות אישיות macrophage-C.albicans, מספקת תובנה ייחודית המורכבות של ג phagocytosis קנדידה ידי macrophages. יש פוטנציאל עצום להרחבה בשיטות אלה כדי ללמוד פתוגנים וphagocytes (תאים דנדריטיים, נויטרופילים) אחרים ולפתח מיקרוסקופיה וידאו 3D לאינטראקציות תא תאי תמונה בפירוט רב יותר, או על משטחים פיסיולוגיים נוספים כגון שכבות תאי אפיתל ואנדותל. טכניקה זו היא חלק מהדור הבא של כלים בחקר אינטראקציות המארח פתוגן ותעזור להפיק מידע מרחב ובזמן מפורט על מגוון רחב של תהליכים דינמיים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו </td><td> Formedium </td><td> CYN0402 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> סיגמא </td><td> S5881-500G </td></tr><tr><td> מלח hemisulphate אדנין </td><td> סיגמא </td><td> A3159-25G </td></tr><tr><td> אגר טכני (3 מס) </td><td> Oxoid </td><td> LP0013 </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> סיגמא </td><td> G7021-1 ק&quot;ג </td></tr><tr><td> SC-אורה נשירה </td><td> Formedium </td><td> DSCK102 </td></tr><tr><td> FITC </td><td> סיגמא </td><td> F7250-1G </td></tr><tr><td> סודיום קרבונט </td><td> BDH </td><td> 301215M </td></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט </td><td> BDH </td><td> 102475W </td></tr><tr><td> PBS </td&gt; <td> Gibco </td><td> 18912-014 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Lonza </td><td> BE12-614F </td></tr><tr><td> FCS </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 10106169 </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Paa </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Lonza </td><td> BE17-605E </td></tr><tr><td> LysoTracker האדום DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td></tr><tr><td> 35 מ&quot;מ זכוכית מנות </td><td> Paa </td><td> PAA12305160X </td></tr></tbody></table>

live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis

אישור Phagocytic של פתוגנים פטרייתי, ומיקרואורגניזמים אופן כללי יותר, עשוי להיחשב מורכב מארבעה שלבים ברורים: הגירה (ט) לphagocytes לאתר שבו נמצאים פתוגנים (ii) זיהוי תבניות מולקולריות הפתוגן הקשורים (PAMPs) באמצעות דפוס קולטנים הכרה (PRRs), (iii) בליעת מיקרואורגניזמים המאוגדים לקרום תא תא בלען ועיבודים (iv) של תאים שרויים בתוך phagosomes ועיכול של חלקיקי בלע התבגרות. מחקרים שהערכת phagocytosis בשלמותו הם אינפורמטיבי 1, 2, 3, 4, 5, אבל הם מוגבלים בכך שהם בדרך כלל לא לשבור את התהליך לתוך הגירה, בליעה והתבגרות phagosome, שעשוי להיות מושפעות באופן דיפרנציאלי. יתר על כן, מחקרים מסוג זה להעריך ספיגה כאירוע בודד, ולא כתהליך דינמי מתמשך. פתחנו לאחרונה טכנולוגיות הדמיה לחיות סלולריות מתקדמות, ושלבנו אותם עם ניתוח פונקציונלי גנטי של שניהםתאי פתוגנים ומארח כדי ליצור פלטפורמת צולבות משמעת לניתוח תפקוד חיסוני מולד תא ופתוגנזה פטרייתי. מחקרים אלו גילו היבטי רומן של phagocytosis שרק יכולים להיבחן באמצעות ניתוח זמני שיטתי של אינטראקציות המולקולריות ותאיות בין phagocytes אדם ומזיקי פטריות ומיקרואורגניזמים מידבקים יותר בדרך כלל. לדוגמה, התחלנו להגדיר את הפעולות הבאות: (א) מרכיבי תא השטח נדרש לכל שלב בתהליך של הכרה, חנק והרג של תאים פטרייתיים 1, 6, 7, 8 (ב) כיצד גיאומטרית משטח משפיע על יעילות קליטת מקרופאג והרג של תאי שמרים וhyphal 7; ו( ג) כיצד היבלעות מובילה לשינוי של מחזור התא וההתנהגות של מקרופאגים 9, 10. בניגוד לתמונות נקודת זמן בודדות, מיקרוסקופי וידאו חי תאים מאפשר מגוון רחב של תאים פונדקאים ופתוגנים להיחקר כשותףרצפי ntinuous בפרק זמן ממושך, המספקים מידע מרחב ובזמן במגוון רחב של תהליכים דינמיים, כולל נדידת תאים, שכפול וסחר פוחי. כאן אנו מתארים בפירוט כיצד להכין מארח ותאים פטרייתי, וכדי לבצע את ניסויי מיקרוסקופיה וידאו. שיטות אלה יכולים לספק למשתמש מדריך למחקרים עתידיים עם phagocytes ומיקרואורגניזמים אחרים.

כאן אנו מראים תוצאות יציגות לג ספיגת קנדידה ידי קו עכברי macrophage תא J774.1 במהלך ניסוי מיקרוסקופיה וידאו חי תאים 6 שעות. איור 1 היא סרט מיקרוסקופיה נציג חי תאי וידאו, מראה phagocytosis של ג קנדידה ידי J774.1 מקרופאגים עכבריים. מיקרוסקופיה וידאו חי תאים מאפשרת הפנמה של ג קנדידה להיות דמיינו ללא צורך להכתים קנדידה החיצונית. עם זאת, במהלך ניסויים אלה, ג קנדידה הייתה מוכתמת באמצעות צבע FITC pH הרגיש (ירוק), שיכבה במהלך ההחמצה של phagosome macrophage, ומקלה על אישור שקנדידה הופנמה (איור 1). עד ראית סיוע נוספת של ג בלע קנדידה, מקרופאגים הוכתמו באמצעות צבע אדום האדום LysoTracker ניאון DND-99, שכתמי מדורים חומציים ומשמש כסמן הלא ספציפי של התבגרות phagosome.איור 2 עדיין תמונה מניסוי מיקרוסקופיה וידאו חי תאים וממחיש את השונות במספר ג קנדידה לקיבה בJ774.1 המקרופאגים בודדים. בניסוי זה, 82% מJ774.1 מקרופאגים אפפו ג לפחות אחד תא קנדידה בסוף assay phagocytosis 6 שעות. באיור 3, המספר המופנם ג תאי קנדידה למקרופאג מדווחים. המספר הממוצע של ג קנדידה שנלקחה למקרופאג היא 3.4, אבל מעניין המקרופאגים יכולים לבלוע עד 16 תאים פטרייתיים. איור 4 הוא רצף של תמונות סטילס מניסוי נציג חי תאים מיקרוסקופי וידאו מראה macrophage phagocytosing ג תאי קנדידה, צמיחת hypha עם macrophage וסופו של דבר תמוגה מקרופאג. איור 4 ממחישים כי מיקרוסקופיה וידאו מאפשרת ניתוח של אירועים שהתרחש לאחר בליעה של תאי המטרה, נתונים כלומר יכולים להיות שנוצרו עבור קיlling של מקרופאגים ידי ג קורי קנדידה ביחס למספר והמורפוגנזה של תאי מטרת נטילתו, וכמה הרג macrophage מתייחסים להבשלת phagosome שניתן ללמוד בזמן אמת. איור 1. סרט מיקרוסקופיה Live-תא וידאו המראה phagocytosis של ג קנדידה ידי J774.1 מקרופאגים עכבריים. המקרופאגים מוכתמים באמצעות צבע אדום האדום LysoTracker ניאון DND-99, ו-C קנדידה מוכתמת באמצעות FITC (ירוק). מקרופאגים וג קנדידה הייתה שותף בתרבית לתקופה של 6 שעות על 37 מעלות צלזיוס בCO בינוני 2-עצמאי מלא. תמונות שנתפסו ב1 מרווחי דקות עבור 6 שעות. המקרופאגים ניתן לראות יצירת מגע עם תאי תאים ג קנדידה, שלאחר מכן ואחרי הספיגה של ג קנדידה לphagosomes macrophage. חיצים מצביעים על ג קנדידה לפני ההיבלעות על ידי J774.1 מקרופאגים. וידאו זה גם מראה שפלואורסצנטי FITC הוא quencההיבלעות הבאה של הד ג קנדידה. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50196/50196fig1.avi" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בסרט.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig2.jpg" /> איור 2. עדיין וריאצית מיקרוסקופיה וידאו חי תאי נציג תמונה המציגה במספר C.albicans נבלע על ידי מקרופאגים הבודדים. המקרופאגים (מוכתמים באמצעות LysoTracker האדום DND-99) היו שותף בתרבית עם ג FITC המוכתם קנדידה (ירוק). קיימות שונות במספר ג קנדידה נבלעה (מספר הבא לחץ מצביע על מספר קנדידה ג נבלע), ובג מורפולוגיה קנדידה (פסוקי שמרים כלומר hypha). סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig3.jpg" /> איור 3. גרף מראה את מספר ג קנדידה ingested למקרופאג העכברי J774.1 בתום 6 מבחני פאגוציטוזיס hr. הנתונים מייצגים 2 ניסויים עצמאיים. סך של 100 מקרופאגים נספרו מ3 שדות מכל ניסוי, נותן סך של 600 המקרופאגים בודדים. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig4.jpg" /> איור 4. סדרה של תמונות מניסוי נציג חי תאים מיקרוסקופי וידאו מראה מקרופאג (M) וג קנדידה (ג&#39;) לפני ובמהלך ההכרה (A, B), ובמשך ואחרי הספיגה (C, D). ג קנדידה קורים להמשיך לצמוח בתוך מקרופאג (E, F), אשר יכול לגרום לתמס מקרופאג (G). מקרופאגים אחרים מגויסים לאתר של קרע והניסיון להיבלע ג שוחרר קנדידה (H). המקרופאגים מוכתמים באמצעות צבע הניאון האדום LysoTracker אדום DND-99, ו-C קנדידה מוכתמת באמצעות FITC (ירוק). שים לב שהוא מכתים FITC quenched בעקבות ג ספיגת קנדידה ידי J774.1 מקרופאגים (C). סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר.

Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis at JoVE.com

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

אנו מתארים שיטות למיקרוסקופיה וידאו חי מתא<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; Phagocytosis ידי מקרופאגים. שיטות אלו מאפשרות ניתוח שלב ספציפי של macrophage הגירה, הכרה, בליעה והתבגרות phagosome ולחשוף היבטי רומן של phagocytosis.

מיקרוסקופיה וידאו חי מתא phagocytosis הפתוגן פטרייתיים

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

live-cell-video-microscopy-of-fungal-pathogen-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

38.7K Views.  University of Aberdeen. אנו מתארים שיטות למיקרוסקופיה וידאו חי מתא קנדידה אלביקנס Phagocytosis ידי מקרופאגים. שיטות אלו מאפשרות ניתוח שלב ספציפי של macrophage הגירה, הכרה, בליעה והתבגרות phagosome ולחשוף היבטי רומן של phagocytosis.

Video: Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

תצפית ישירה של phagocytosis ו-NET היווצרות ידי נויטרופילים בריאות נגועים באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

ויזואליזציה של תגובות מושרות רעלן של חיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא החי

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

בידוד, טיהור וסימון של נויטרופילים מח עצם עכבר ללימודים פונקציונליים וניסויי העברת מאמצת

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

הדמיה של תא חי התחבורה אנטרוגרדית וירוס Alphaherpes ומורחים

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Isothermal הגברה מבחני בתיווך לולאה (LAMP) לאיתור המינים ספציפי של<em&gt; Eimeria</em&gt; כי להדביק תרנגולות

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

שינוי Biolistic של פלורסנט Tagged Gene לOpportunistic פטרייתיים פתוגן<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.