עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות: EY015748, EY017964 (MEZ), וEY019517 (ASV). עבודה זו נתמכה גם על ידי המחקר למניעת העיוורון החופשי גרנט למחלקת העיניים והאריות של מרכז ניו יורק. כמו כן, אנו רוצים להודות לטכנאים שלנו בעלי החיים, מתיו Mellini, לטיפולו מצוין של בעלי החיים ולדריכה בלככב בסרטון זה.

טיפול בבעלי חיים Xenopus laevis ראשנים השתמשו במחקר זה גדלו, גדלו וטופלו בהתאם לנהלים שאושרו על ידי IACUC לרפואה של אוניברסיטת צפון מדינת והמדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. 1. התקנה טרום התנהגות: ראשנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג עוברי Xenopus מופרים ממקור זמין באופן מסחרי או במבחנה להפרות ביציות, כפי שתואר לעיל 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח blastula לעוברי שלב צלחת עצביים ב18 ˚ C ב60 מ&quot;מ צלחות פטרי המכילות 0.1X MMR [10 מניית רינגר הפתרון (MMR) השתנה של X מארק (10 מ&quot;מ MgCl 2; 20 מ&quot;מ KCl; 20 מ&quot;מ CaCl 2; 50 HEPES מ&quot;מ; 1 M NaCl; מותאם pH 7.5, autoclaved ומאוחסן ב RT)] עם האנטיביוטיקה גנטמיצין 50 מיקרוגרם / מיליליטר. שינוי 0.1X MMR בכל יום ולהסיר כל עוברים מתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שעובר להגיע לשלב Nieuwkoop ופייבר ~ 27-30 יולי, לעבור העוברי דואר ל0.1X MMR ללא אנטיביוטיקה כדי לאפשר התפתחות חיידקי מעיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את הראשנים עד שהם מגיעים לשלב ההאכלה (שלב 45) ולהעביר אותם ל100 מ&quot;מ צלחות פטרי מלא ב0.1X MMR. להאכיל אותם supernatant אבקת סרפד כל יום אחר במשך שבוע, שינוי MMR 0.1X ביום שחלף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שבוע אחד בצלחת פטרי 100 מ&quot;מ, להעביר חיות למחצית טנקי גלון מלאים במי צפרדע [אוקיינוס ​​מיידי 0.5 גר &#39;/ ליטר ו -2 dibasic פוספט מ&quot;מ נתרן (Na 2 HPO 4: MW 141.96) pH 6.8]. להאכיל אותם כמו בשלב 2.4, אבל לשנות את המים רק 2-3 פעמים בשבוע, כאשר המים עכורים. לשמור על בעלי החיים במחזור אור הכהה light/12 שעות 12 עם אורות ההפעלה ב -6 בבוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המכל חצי ליטר עם נושאי בדיקה על משטח לבן כמו underpad מעבדה ספסל, O שעה לפחות 12 / N, לפני הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשני מבחן בשלבי 45-50 כמתואר בשלב 3 להלן. </li></ol> . 2 התקנה טרום התנהגות: Equipmenלא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בצד על שטח של המעבדה עבור assay ההתנהגות. זה צריך להיות באזור עם תאורת ניאון סטנדרטית שקט, עם תנועה נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את טנקי בדיקות לבעלי החיים. , טנקי בדיקות חצי ליטר מקונן מורכבים משני חלקים: מיכל פנימי שיחזיק מים וראשנים; ומכל חיצוני עם הגירוי ויזואלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למכל הפנימי, לעשות סימן קטן בפינות בחוץ עם נוכל, 5 סנטימטר מהחלק התחתון; זה קו המים (איור 1 א, קו מקווקו ירוק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו כן, למכל הפנימי, למלא divets במכל (בפינות והמרכז) עם מתחם אינרטי, כמו אלסטומר Sylgard. הערה: הראשנים להשתהות באזורים אלה אם הם לא מלאים פנימה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למכל החיצוני, לכסות את המחצית בדיוק אחד מחוץ לטנק אחד עם סרט שחור חשמלי ואת החצי השני עם 1B איור נייר הטישו הלבן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הטנקים עליחסינו פטיפון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת מצלמות הרשת / חצובה, כך שהוא נמצא מעל למכלי הבדיקה. כוון את המצלמה כדי לאפשר הדמיה של אזור הבדיקה, כפי שמוצג באיור 1 ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מצלמת האינטרנט למחשב עם תוכנת QuickTime Player המותקנת 5. הפעל את המצלמה. בQuickTime Player, תחת קובץ, בחר &quot;חדשה סרט הקלטה.&quot; התקנת assay ההתנהגות תהיה גלויה במחשב מייד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף בבד כותנה קלה על כל ההתקנה כדי להפחית סימנים חיצוניים שיכול להשפיע על התנהגות ראשן, כמו גם, להפחית את האור מוחזר על פני השטח של המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שעוצמת ההארה באמצעי הבד בין 35-50 cd / m 2. </li></ol> 3. Assay ההתנהגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את מיכל הבדיקה הפנימי לסימן המים 5 סנטימטר נעשה בשלב 1.2.1 עם מים צפרדע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ברשת קטנה, בעדינות להזיז את בעל החיים לתוך טנק בדיקות הפנימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Q הפתוחuickTime תוכנה במחשב, ושימוש במכל החיצוני כמדריך, ודא שהמצלמה היא מסוגלת לדמיין ולהקליט את אזור הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתוב את שם החיה, תאריך ושעה על פיסת נייר ולהקליט עם המצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מיכל הבדיקה למכל החיצוני עם הצד השחור של הטנק לאיור מימין 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל להקליט את הסרט מייד לאחר הסדרת הטנק ולהגדיר טיימר למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר צפצופי טיימר, להסיר את מיכל הבדיקה הפנימי, לסובב את המכל החיצוני 180 מעלות ומניחים את מיכל הבדיקה הפנימי בתוך הטנק החיצוני. הפעל את שעון העצר. הערה: בצד השחור צריך עכשיו להיות בצד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.7, שמונה פעמים יותר עבור סכום כולל של עשרה ניסיונות. השתמש באיור 2 כמדריך, בודק את כל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על assay ההתנהגות בשני ימים נפרדים. </li></ol> 4. רשתית Axotomy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניחו לבעלי חיים בtricaine 0.02% עד שהם לא מגיביםלקמצוץ זנב עם # 3 מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמס agarose 1% ב0.1X MMR ולאחר מכן להוסיף לצלחת פטרי 60 מ&quot;מ. לאחר המצונן, להפוך divot מלבני קטן בagarose ולהוסיף את הראשן לdivot עם tricaine 0.02% קטנים, כדי שבעל החיים הוא שקוע בחלקו בנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירס העור בזווית של 45 תואר מאחורי אזור הגב של העין עם מחט 25 G, בעוד מרענן החיה נגד מלקחיים בצד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נזהר שלא לגזור את הווריד, הנמצא בסמוך לעצב הראייה, להגיע בזהירות לתוך החור עם # 5 מלקחיים, לגזור את עצב הראייה ולהעיף החוצה את דרכו. אם יש דימום חמור בשל טעות לגזום את העורק, ואז למקם את מהירות של בעלי החיים בtricaine 2% להרדים. זהירות: 2% פתרון tricaine יכול לגרום לחוסר תחושה בבני אדם. פתרון זה צריך להיות מטופלים עם כפפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשחזר את בעלי החיים לאחר ניתוח, למקם את בעלי החיים ב100 מ&quot;מ צלחת פטרי עם 0.7x MMR ו50 גנטמיצין מיקרוגרם / מיליליטר עבור 20 דקות. NeXT, ראשן העברה להחלמה מיכל עם מים צפרדע. בואו O / נ שאר בעלי החיים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, לבדוק את תפקוד הראייה כפי שתואר לעיל (שלבים 3.1-3.9). </li></ol> 5. לנתח את התוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניסויים שתסיימו, למדוד את כמות הזמן שהראשן נשאר בצד השחור של הטנק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני להציג את קטעי הווידאו באמצעות תוכנה המציגה את השעה ומאפשרת השהיה תכופה. תסתכל על זמן תצוגת וידאו. רשום את תחילת המשפט של שתי דקות, וזה כאשר המכל הפנימי מקנן בהצלחה בתוך הטנק החיצוני והוא בריבוע בתצוגה של המצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקום של העיניים של הראשן להגדיר באיזה צד של טנק החיות שוחות ב. הגדר חוצה את הגבול מצד אחד של הטנק האחר רק כאשר שני העיניים חצו את הקו השחור / לבן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את ההתחלה ואת הסוף של כל מרווח זמן (בשניות) שהחיה מבלה בצד השחור. השהה ומחדשבסופו של הווידאו כדי להבטיח דיוק. סה&quot;כ שניות בתוך כל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלט מספרים אלה לתוך גיליון ההתנהגות המצורפת. הגיליון יהיה לחשב את היחס בין הזמן שהחיה בילתה בצד הלבן על ידי הפחתת המשך הזמן על הצד השחור של הטנק מהמשפט הכולל 120 שניות ולחלק את הסך כל הזמן בשניות [(120 - שניות בסך הכל בילו על הצד השחור) / 120 שניות]. ממוצעי גיליון יחס זה על כל 10 הניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במבחן t של סטודנט, לזווג, הפצת שני זנב כדי לקבוע אם הניסויים בין הימים הם משמעותיים (P ≤ 0.05). </li></ol>

<ol>
	<li>Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+zebrafish+oculomotor+behavior+to+model+human+disorders.">Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders.</a> Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).</li><li>Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+modulation+of+temporal+properties+of+the+rod+pathway+in+larval+Xenopus.">Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus.</a> J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).</li><li>Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preference+for+background+color+of+the+Xenopus+laevis+tadpole.">Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole.</a> J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).</li><li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells.">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7 (8), (2009).</li><li>Choi, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cone+degeneration+following+rod+ablation+in+a+reversible+model+of+retinal+degeneration.">Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).</li><li>Viczian, A. S., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+determination+using+the+animal+cap+transplant+(ACT)+assay+in+Xenopus+laevis.">Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis.</a> J Vis Exp. 16 (39), (2010).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second-generation+device+for+automated+training+and+quantitative+behavior+analyses+of+molecularly-tractable+model+organisms.">A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms.</a> PLoS One. 5 (12), (2010).</li><li>Rosemberg, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+spatio-temporal+behavior+of+zebrafish+in+the+open+tank+paradigm+after+a+short-period+confinement+into+dark+and+bright+environments.">Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li><li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Avoidance+in+Xenopus+Tadpoles+is+Correlated+With+the+Maturation+of+Visual+Responses+in+the+Optic+Tectum.">Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum.</a> J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li><li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin+Elicits+Retinal+Fate+In+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells.">Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).</li><li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos.">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

אנו מדווחים כאן assay מודרך חזון פשוט התנהגותיים שניתן לבצע בקלות בשבוע על ידי אנשי מעבדה מינימאלי מאומנים. בעוד מבחני אחרים דורשים ציוד מיוחד ומומחיות בהתנהגות בעלי חיים, assay זה מאפשר בדיקה מהירה כדי לקבוע תפקוד ראייה. עוד assay התנהגותיות, assay ההימנעות החזותי, פותח כדי לקבוע כיצד tectum תורם לתפיסה חזותית בXenopus 10. כוונון זה אמצעי assay במרחב וברגישות לקונטרסט בתגובה להעברה לעומת רקע יציב, ובכך, יכול למדוד התנהגות מבוססת ראיה מיוחדת יותר מ assay הפשוט דיווחו כאן. התנהגות מערכת אוטומטית כבר דיווחה כי יכול למדוד את כמות הזמן המושקעת בצד אחד של הטנק 8. יש גם תוכנה זמינה באופן מסחרי (תוכנה כל מבוך למשל) שבו נעשה שימוש כדי למדוד את הכמות של דג הזברה הזמן להשקיע בסביבות כהות או בהירות 9.ssay אנו מדווחים כאן אינו דורשים הרכישה של סוגים אלה של ציוד או תוכנה יקר, אך במקום זאת מסתמך על חומרים כימיים וציוד יומיומיים כדי למדוד את התפקוד חזותי. Assay מודרך הראייה מבוצע על חיה אחת כדי לבדוק את תפקוד הראייה שלה. כאשר משווה את תוצאות assay התנהגותיים של כמה ראשנים אחד לשני, אנחנו לא הבחנו בהבדל סטטיסטי בין בעלי חיים בקבוצות טיפול. בדקנו שלושה ראשנים בשישה ימים רצופים וגם נבדקו עוד חמישה בעלי חיים על שלושה ימים רצופים, ריצת עשרה ניסויים ליום. בכל מקרה, לא מצאנו שינויים משמעותיים מבחינה סטטיסטית בין הקבוצות שלא טופלו או axotomy יחיד (P = .2067), ובכל זאת השגתי שינוי משמעותי מבחינה סטטיסטית, כאשר בעלי החיים אלה הושוו לקבוצה הכפולה axotomy (P = 0.002). זה נמדד באמצעות תוכנת 6.0c פריזמה פועל מבחן סטטיסטי 2-way ANOVA עם המבחן של Tukey מספר השוואה (n = 8 ראשנים). כדי לקבל את המקסימוםכמות נקודות נתונים לפני הניתוח, אנו מציעים באמצעות assay ההתנהגות של שישה הימים. אם תוצאות צריכים להיות מושגת מהר יותר עם פחות ניוון של הרקמה, אנו מציעים המערכת של שלושה ימי שימוש. assay זה ניסויים בבעלי חיים אחד בכל פעם. ביצענו מחקרי טייס כדי לראות אם שני ראשנים או יותר ניתן היה למדוד בו זמנית. כדי לקבוע אם יש שני ראשנים בטנק אחד שנפגע ההעדפה שלהם לצד הלבן של הטנק, בדקנו כל ראשן בנפרד ולאחר מכן ביחד. מאז התמונות צולמו מעל המכל, אם הראשנים שחו מעל או מתחת לאחד את השני לכל אורך זמן, מצאנו את זה קשה להבדיל ביניהם. אם היינו ראשנים בגדלים שונים, שמנו לב שאחד הגדול יותר ישפיע בו שחו אחד הקטן יותר. טכנולוגיות עתיד יכולה להיות מפותחות לראשנים גנטי סימן, אשר יאפשר מעקב טוב יותר של בעלי חיים רבים באותו הגודל. בביצוע assay זה על עשרות tadpoles, שמנו לב שכמה ראשנים העדיפו את הצד הלבן באופן עקבי יותר מאשר לאחרים. ראשנים, שהתנהגותם הייתה שונה על ידי יותר מ 10% על שני ימים רצופים, היינו לוקח נבדקו שוב ביום שלישי לפני הניתוח. זה היה אולי בגלל תצפית נוספת: שמה לב שהצבת החיות על רקע לבן גם עשתה את הבדל בהעדפה שלהם לצד הלבן של הטנק. לאחר שיום נוסף אולי סייע להתנות כמה ראשנים להעדיף את הצד הלבן של הטנק. הגבלה של assay זה היא שזה רק בדיקות תפקוד ראייה. ההשתנות שצפינו יכולה להיות כתוצאה מפגמים התפתחותיים אחרים, מלבד תפקוד ראייה מופחת או עיוורון. מסיבה זו, בעלי חיים שהראו העדפה פחות מ 60% לפני הניתוח לא נבדקו נוסף. גם בדקנו טווח גילים של ראשנים מראש מותמרים. מצאנו כי ראשנים צעירים משלב 45 היו קטנים מאוד ועיניהם היו קשה לעקוב אחר השימוש שBcAm. ראשנים מבוגרים (שלבי 51-55 +) היו מוסחים יותר; למרות שהם בילו יותר זמן בסופו של דבר בצד הלבן של המכל, נראה שהם לוקחים יותר זמן לשחות שם. בעלי החיים המבוגרים אלה היו גדולים יותר, ולכן, קלים יותר לעקוב אחר, אבל נדרשים בדיקות לפני הניתוח כאמור לעיל. לעומת זאת, הרוב המכריע של ראשנים בשלב 45 עד 50 התנהג כצפוי ובעלי החיים בגילים אלה יהיו הכי טובים להשתמש במחקרים עתידיים. שינויי אור היממה הוכחו להשפיע תגובות התנהגותיות מונחה חזון בXenopus 2. עולה בקנה אחד עם תצפית זו, הבחנו כי אותו בעל החיים ששחו במהירות לצד הלבן של טנק המבחן בניסויים שנערכו בבוקר, לקחו הרבה יותר זמן במבחני התנהגות אחר הצהריים. לאחר ביצוע מספר &#39;חיה אותו / זמן שונה &quot;ניסויים, קבענו את הזמן הטוב ביותר עבור assay ההתנהגות היה 06:00-13:00. יש לנו גם השתמשתי בhandh דיגיטליישנות מצלמת וידאו מחובר באמצעות firewire כדי לבדוק את החיות בתנאי אור נמוכים 5. הבדיקות אפשרו הזה בחזון הלילה או scotopic, שבו בעלי החיים משתמשים בקולטני אור המוט שלה כדי לראות. תנאים שונו על ידי פשוט למצוא את הכמות המינימאלית של אור הדרוש לבעלי החיים כדי לבצע את assay מונחי החזון. Assay שהוצג כאן בדיקות ראיית photopic, שבו בעלי החיים בעיקר משתמשים בקולטני אור החרוט שלה כדי לראות. על ידי שילוב של גישות אלה, בשני הסוגים של חזון, scotopic וphotopic, יכולים להיבדק. אנו משמשים assay זה כדי לבדוק את תפקוד הראייה של בעלי חיים עם עין מחוץ לרחם גדלה מתאי pluripotent ביתר גורמי שעתוק שדה עין הביעו באופן מהותי וגורם החיצוני, Noggin. עיניים המופקות מרקמות אלה היו פונקציונליות 4,11. גולגולת גם משחקת תפקיד בהתפתחות הקדמית של מערכת עצבים מרכזית אך 12 באמצעות assay מודרך חזון זה בשיתוף עם TR כובע בעלי החייםassay ansplant, תפקידה בפיתוח העין נחשף. גורמים חיצוניים אחרים המשפיעים על היווצרות עובר מוקדמת, אבל עדיין לא הוכח יש תפקיד בהתפתחות העין עלול המושרה היווצרות אב רשתית בתאי כובע בעלי החיים pluripotent 4,11. שימוש assay ההתנהגות הזה, מחקרים עתידיים יכולים לקבוע את תפקוד הראייה של עיניים שנוצרו זה עתה אלה.

laevis Xenopus שימש כאורגניזם מודל ללמוד היווצרות עין. העיניים לפתח במהירות, הולכת וגדלה לפדיון בפחות משבוע לגנים או מסלולי בדיקה שיש להם השפעה על התפתחות ותפקוד ראייה. כדי לבדוק את התפקוד חזותי, תגובת optokinetic וoptomotor נעשתה שימוש בדג זברה וראשני Xenopus, בהתאמה 1,2. בגלל העיניים של ראשני Xenopus הן קטנות יחסית לדג זברה, assay זה מחייב שימוש בציוד מיוחד וצוות מיומן לזהות את הזנב להעיף ועיני תנועת התנהגות העדינה בXenopus. התנהגות חזקה יותר בXenopus היא ההעדפה לשחייה במכל עם רקע לבן, אשר מתואר במסמך 3. בעת ביצוע ראשן במחצית טנק שחור / חצי לבן, הראשן מראש מותמרים שוחה במהירות לצד הלבן של הטנק. אנחנו השתמשנו בעבר assay זה כדי לקבוע אם נגזר תאי pluripotentעיניים היו פונקציונליות 4. כאן אנו מדווחים גרסה מפורטת של assay זה, אשר יכול לשמש כדי לבדוק את תפקוד הראייה של ראשני Xenopus premetamorphic. assay זה הוא פשוט יותר מאשר assay תגובת optomotor, שכן הוא רק דורש מצלמת וידאו מותקן דיגיטלית, תוכנת מצלמה דיגיטלית וציוד סטנדרטי המצוי ברוב מעבדות Xenopus. בנוסף, התגובה נרשמה לא דורשת הכשרה מיוחדת לתוצאות עולים בקנה אחד. תוצאות הנציג שלנו מראות כי אותה הקבוצה של ראשנים, שעברה axotomy כפול רשתית, לשחות באופן אקראי מסביב לטנק. כללנו גם את תוצאות assay ההתנהגות מראשן של נציג, המראה כיצד עין אחת יכולה להיבדק על תגובה חזותית. גיליון עבודה כבר כלול כך שניתן להוסיף מספרים שנרכשו במהלך assay ונותחו. גיליון עבודה זה יכול לשמש כדי לקבוע אם יש להם את הראשנים שנבדקו תגובה חזותית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1/2-gal. Flex-Tank with Cover</td>
			<td style="width:95px;">eNasco</td>
			<td style="width:119px;">SB19271M</td>
			<td style="width:225px;">size: 5-3/8&#34; x 7&#34; x 3-3/4&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Black electrical tape</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">White tissue paper</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Large Inoculating Turntable</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">50809-022</td>
			<td>size: Dia 114.3 x&#160; H 76.2 mm (4 1/2&#160; x&#160; 3&#34;)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Durasorb Underpad</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82004-836</td>
			<td>size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24&#34;)</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Kim wipe</td>
			<td style="width:95px;">Krackeler Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1945-34155-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Standard Tripod</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:119px;">various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iSight camera or webcam</td>
			<td style="width:95px;">Apple</td>
			<td style="width:119px;">M8817LL/A</td>
			<td>Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Portable computer</td>
			<td style="width:95px;">Apple/PC</td>
			<td style="width:119px;">various</td>
			<td>We used a 13&#34; MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiniDV Handycam Camcorder</td>
			<td style="width:95px;">SONY</td>
			<td style="width:119px;">DCR-HC42</td>
			<td>Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Handycam Station</td>
			<td style="width:95px;">SONY</td>
			<td style="width:119px;">DCRA-C121</td>
			<td>This can be used for connecting firewire to camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QuickTime Player software</td>
			<td style="width:95px;">Quicktime</td>
			<td style="width:119px;">Version 10.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">26 Gauge Needle (5/8&#34; length)</td>
			<td style="width:95px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD305115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Dumont #5 Forceps Biology</td>
			<td style="width:95px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Disposables</td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Gentamicin Sulfate [50 mg/ml]</td>
			<td style="width:95px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17-528Z</td>
			<td>Stored at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer</td>
			<td style="width:95px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9644388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:95px;">Doctors Foster and Smith</td>
			<td style="width:119px;">CD-116528</td>
			<td>Stock solution = 100 g/L stored at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:95px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S0876</td>
			<td>Stock solution = 0.4 M stored at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Tricaine (Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td>
			<td style="width:95px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040</td>
			<td>Stock solution = 10% stored at -20&#730;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">In vitro fertilized embryos</td>
			<td style="width:95px;">eNasco</td>
			<td style="width:119px;">LM00490MX</td>
			<td>100 embryos/unit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple behavioral assay for testing visual function in xenopus laevis

מדידה של תפקוד הראייה בראשנים של הצפרדע, laevis Xenopus, מאפשרת הקרנה לעיוורון בבעלי חיים. תגובת optokinetic היא, התנהגות רפלקסיבית המבוסס על חזון שכבר נצפתה בכל בעלי החוליות שנבדקו. עיני ראשן הם קטנים כל כך התגובה להעיף זנב שימשה כאמצעי חלופי, שדורש טכנאי מיומן כדי להקליט את התגובה העדינה. פיתחנו assay התנהגות חלופי המבוסס על העובדה שראשנים מעדיפים לשחות בצד הלבן של טנק כאשר הוא ממוקם בטנק עם צדדים הן בשחור לבן. Assay שהוצג כאן מהווה חלופה זולה ופשוטה שיוצרת תגובה שנמדדת בקלות. ההתקנה מורכבת מחצובה, מצלמת האינטרנט וטנקים בדיקות מקוננות, זמינה ברוב מעבדות Xenopus. מאמר זה כולל סרט המראה את התנהגותם של ראשנים, לפני ואחרי ניתוק עצב הראייה. על מנת לבדוק את התפקוד של עין אחת, אנחנו גם כוללים ייצוגיםתוצאות sentative של ראשן שבו כל עיניים עברו axotomy רשתית בימים רצופים. מחקרים עתידיים יכולים לפתח גרסה אוטומטית של assay זה לבדיקת הראייה של ראשנים רבים בבת אחת.

דיווחים קודמים הראו כי ראשני Xenopus premetamorphic מעדיפים לשחות בצד הלבן של טנק בשחור / לבן וקראו assay זה, assay העדפות צבע רקע 3 שינינו assay זה על מנת לבדוק את תפקוד הראייה של שני עיניים של ראשנים ב פחות משבוע. בדרך זו, ניתן לאסוף את עיניהם לבדיקה היסטולוגית. אנחנו מראים כאן איך התגובה היא עקב רמזים חזותיים. בסרט 1, הראשנים בלוחות השמאל וימין הם אותם בעלי החיים. בצד השמאל נמצאים את החיות לפני ניתוח ועל הימין, בעלי החיים לאחר ניתוק שני עצבי הראייה. אנחנו הסתחררנו המים כדי להראות ששום דבר לא הוסיף להדוף את בעלי החיים מהצד השחור או למשוך אותם לצד הלבן. בסרט, שאנו מספקים סכמטי של הראשנים בפינות התחתונה, אשר מציגה את המצב של עצב ראייה לכל קבוצה של בעלי חיים. בסרט 1, הנורמלי, uראשני n פעלו-מגיבים לצבע רקע בפחות מ 30 שניות במכל המבחן בעת ​​הראשנים העיוורים לשחות ללא מטרה מסביב לטנק. המהירות של הסרטים הוגדלה והקליט את הזמן בפועל בפינה הימנית העליונה. כדי לבדוק את הראייה של עין אחת, יש לנו כלל תוצאות מבעלי חיים שעצב הראייה נותק בעין אחת ונבדק בassay שלנו. עצב הראייה בעין השנייה נותק לאחר יומיים של בדיקות, וההתנהגות מונחה הראייה נבדקת בימים הבאים שוב. באיור 3, גרף מראה את כמות הזמן שהראשן בחר לשחות בצד השחור של הטנק. זה נמדד ביום שישה איור 3A ימים רצוף. כפי שתואר לעיל, את עצב הראייה תקין נותק לאחר ההתנהגות נבדקה ביום 2 ובשמאל, לאחר בדיקת התנהגות ביום 4. הראשן העדיף את הצד הלבן של הטנק באופן אקראי ב50% 3C איור הזמן. שים לב כיimal בילה זמן רב יותר בצד הלבן של הטנק במהלך 6 הניסויים שעבר בימים 1 עד 4. כמות הזמן שבילתה בצד השחור הייתה יותר גם בימים 5 ו -6, כאשר בעלי החיים היו עיוור בשני העיניים. תוצאות מכל אחד משני הימים היו בממוצע יחד ומוצגות באיור 3C צורת גרף. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51726/51726fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. ניסיוני הגדרה של assay התנהגות מונחה ראייה. () טנק הבדיקה הפנימי נשאר שקוף ומסומן כדי לציין רמות מים (ירוק קווים מקווקווים בפינה). (ב &#39;) מיכל הבדיקה החיצוני מכוסה בשחור הקלטת חשמל על נייר חצי ורקמות הלבנות אחד על השני. (C) הראשנים הם דמיינו באמצעות מצלמת אינטרנט על גבי חצובה ומחוברת למחשב נייד. טנק הבדיקות<html> שאר s על פטיפון inoculating כדי לאפשר מפנה קל בין ניסויים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51726/51726fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51726/51726fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. סכמטי של איך assay ההתנהגות מונחה הראייה מבוצע. המלבנים מייצגים את טנק הבדיקה, המראה כיצד חצי לבן / מחצית שטחים שחורה שינויים בכל ניסוי. זה יכול להיות בשימוש במהלך assay ההתנהגות כדי לסמן את מספר המשפט. טנק הבדיקה בצד הימין הוא תקריב של הראשן וההתנהגות הצפוי שלה במהלך assay שתי דקות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51726/51726fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> הין-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51726/51726fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. ניסוי נציג ספירת אחוז הזמן שחו הראשן בצד הלבן של טנק הבדיקה. (א) הסכום של שניות הראשן בילה בצד השחור של הטנק נמדד ולהציב בטבלה. (B ) השולחן במומר אחוז מהזמן בילה בצד הלבן של הטנק. הדבר נעשה על ידי הפחתת שניות בילו בצד השחור מהזמן הכולל משפט (120 שניות) וחלוקת ידי 120 שניות. ראשנים שהיו מטופלים (U), היו לי axotomy בודד (SA) ולאחר מכן axotomy כפול (DA) נבדק. (C) הגרף מייצג את אחוז הזמן הממוצע בילה בצד הלבן (פס לבן) וצד שחור ( פס שחור). השולחן המשמש לייצור הגרף מוצג למטה.g3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. סרט 1. תגובת התנהגות של בעלי חיים רואי והעיוורים בassay העדפת הרקע הלבן. הראשנים בלוחות השמאל וימין הוא אותו הדבר, אבל אלה בצד הימין עברו axotomy הכפול ברשתית. סכמטית בפינות התחתונה מציינת אם עצב הראייה הוא (פס כחול) ללא פגע או נותק. טיימר בפינה הימנית העליונה מצביע על זמן. הסרט האיץ לצפייה קלה. פעם אחת באזור הלבן, שימו לב כמה הראשנים לשחות קרוב לגבול שבין כיוון הלבן ושחור והפוך. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51726/51726_Viczian_Movie1.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="616" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:88px;"></td><td style="width:88px;"> Day 1 </td><td style="width:88px;"> יום 2 </td><td style="width:88px;"> יום 3 </td><td style="width:88px;"> יום 4 </td><td style="width:88px;"> יום 5 </td><td style="width:88px;"> יום 6 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> ניסוי 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> ניסוי 2 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> משפט 3 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> ניסוי 4 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> ניסוי 5 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 &lt;/ Td&gt; <td> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> משפט 6 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> ניסוי 7 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> ניסוי 8 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 9 ניסיון </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> משפט 10 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td colspan="3"> יחס בין הזמן מושקע בצד לבן </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 1 יחס </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 2 יחס </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 3 יחס </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 4 יחס </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 5 יחס </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 6 יחס </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 7 יחס </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 8 יחס </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 9 יחס </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> 10 יחס </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td></tr><tr height="25"><td height="25" style="height:25px;"> ממוצע </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td><td> 1.00 </td> &lt;td&gt; 1.00 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"></td><td> יום 1 </td><td> יום 2 </td><td> יום 3 </td><td> יום 4 </td><td> יום 5 </td><td> יום 6 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> ניסוי 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 69 </td><td> 69 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> ניסוי 2 </td><td> 0 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 88 </td><td> 68 </td><td> 58 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> משפט 3 </td><td> 7 </td><td> 0 </td><td> 28 </td><td> 0 </td><td> 58 </td><td> 47 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> ניסוי 4 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 11 </td><td> 0 </td><td> 59 </td><td> 72 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> ניסוי 5 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 7 </td><td> 22 </td><td> 57 </td><td> 57 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> משפט 6 </td><td> 1 </td><td> 98 </td><td> 4 </td><td> 56 </td><td> 69 </td><td> 53 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> ניסוי 7 </td><td> 0 </td><td> 13 </td><td> 33 </td><td> 24 </td><td> 44 </td><td> 57 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> ניסוי 8 </td><td> 0 </td><td> 113 </td><td> 38 </td><td> 24 </td><td> 36 </td><td> 64 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 9 ניסיון </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 4 </td><td> 43 </td><td> 60 </td><td> 57 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> משפט 10 </td><td> 1 </td><td> 21 </td><td> 0 </td><td> 32 </td><td> 63 </td><td> 80 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td colspan="2"> יחס בין הזמן מושקע בצד לבן </td<html> &gt; <td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 1 יחס </td><td> 100% </td><td> 100% </td><td> 100% </td><td> 100% </td><td> 43% </td><td> 43% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 2 יחס </td><td> 100% </td><td> 98% </td><td> 100% </td><td> 27% </td><td> 43% </td><td> 52% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 3 יחס </td><td> 94% </td><td> 100% </td><td> 77% </td><td> 100% </td><td> 52% </td><td> 61% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 4 יחס </td><td> 100% </td><td> 100% </td><td> 91% </td><td> 100% </td><td> 51% </td><td> 40% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 5 יחס </td><td> 100% </td><td> 100% </td><td> 94% </td><td> 82% </td><td> 53% </td><td> 53% </td></tr><tr height="21">גובה: 21px; &quot;&gt; 6 יחס </td><td> 99% </td><td> 18% </td><td> 97% </td><td> 53% </td><td> 43% </td><td> 56% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 7 יחס </td><td> 100% </td><td> 89% </td><td> 73% </td><td> 80% </td><td> 63% </td><td> 53% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 8 יחס </td><td> 100% </td><td> 6% </td><td> 68% </td><td> 80% </td><td> 70% </td><td> 47% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 9 יחס </td><td> 100% </td><td> 100% </td><td> 97% </td><td> 64% </td><td> 50% </td><td> 53% </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> 10 יחס </td><td> 99% </td><td> 83% </td><td> 100% </td><td> 73% </td><td> 48% </td><td> 33% </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> ממוצע </td><td> 99% </td><td> 79% </td><td> 90% </td><td> 76% </td><td> 51% </td><td> 49% </td></tr></tbody></table> גיליון 1. גיליון לבן רקע העדפת assay. יש גיליון עבודה זה החישובים שנבנו בכך שניתן להשתמש בו כדי להזין מספרים ותוצאות עולים בקנה אחד.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis at JoVE.com

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis ראשנים מעדיפים שחייה בצד הלבן של טנק בשחור / לבן. התנהגות זו מונחה על ידי החזון שלהם. בהתבסס על התנהגות זו, אנו מציגים assay פשוט כדי לבדוק את תפקוד הראייה של ראשנים.

Assay התנהגות פשוט לפונקציה של Visual בדיקה ב<em&gt; Laevis Xenopus</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

a-simple-behavioral-assay-for-testing-visual-function-xenopus

Google

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

9.7K Views.  Center for Vision Research, SUNY Eye Institute, Upstate Medical University.  Xenopus laevis ראשנים מעדיפים שחייה בצד הלבן של טנק בשחור / לבן. התנהגות זו מונחה על ידי החזון שלהם. בהתבסס על התנהגות זו, אנו מציגים assay פשוט כדי לבדוק את תפקוד הראייה של ראשנים. 

Video: A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

The Vermicelli and Capellini Handling Tests: Simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended upon this work to develop a simple quantitative measure of forepaw dexterity that is sensitive to lateralized impairments and age-dependent changes. Rodents learn skillful forepaw and digit movements to manage thin pasta pieces, which they eagerly consume. We have previously described methods for quantifying vermicelli handling in rats and showed that the measures are very sensitive to forelimb impairments resulting from unilateral ischemic lesions, middle cerebral artery occlusions and unilateral striatal dopamine depletion [Allred, R.P., Adkins, D.L., Woodlee, M.T., Husbands, L.C., Maldonado M.A., Kane, J.R., Schallert, T. &amp; Jones, T.A. The Vermicelli Handling Test: a simple quantitative measure of dexterous forepaw function in rats. J. Neurosci. Methods 170, 229-244 (2008)]. Here we present a more detailed protocol for this test in rats and compare it with a newly developed version for mice, the Capellini Handling Test. Rats and mice are videotaped while handling short lengths of uncooked vermicelli or capellini pasta, respectively, with a camera positioned to optimize the view of paw movements. Slow motion video playback allows for the identification of forepaw adjustments, defined as any distinct removal and replacement of the paw, or of any number of digits, on the pasta piece after eating commences. Forepaw adjustments per piece are averaged over trials per each testing session. Repeated testing permits sensitive quantitative analysis of changes in forepaw dexterity over time. Protocols for pre-testing habituation and handling practice, as well as procedures for characterizing atypical handling patterns, are described. Because rats and mice perform the pasta handling tests slightly differently, species-specific differences in administration and scoring of these tests are highlighted. All animal use was in accordance with protocols approved by the University of Texas at Austin Animal Care and Use Committee.

The Vermicelli and Capellini Handling Tests of forepaw dexterity take advantage of the natural inclination of rodents to manipulate food items using skillful forepaw and digit movements. Animals are videotaped while handling short strands of uncooked dry pasta. Slow motion video playback allows for the quantification of forepaw adjustments.

אטריה ו בדיקות Capellini טיפול: מדדים כמותיים פשוט פונקציה של מיומנות בכפו אצל חולדות ועכברים

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended ...

A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and relapse to food taking 1. Food craving conceptualized in this way is akin to drug craving in response to drug-paired cues. A rich literature has been developed around understanding the behavioral and neurobiological determinants of drug craving; we and others have been focusing recently on translating techniques from basic addiction research to better understand addiction-like behaviors related to food 2-4.
As done in previous studies of drug craving, we examine sucrose craving behavior by utilizing a rat model of relapse. In this model, rats self-administer either drug or food in sessions over several days. In a session, lever responding delivers the reward along with a tone+light stimulus. Craving behavior is then operationally defined as responding in a subsequent session where the reward is not available. Rats will reliably respond for the tone+light stimulus, likely due to its acquired conditioned reinforcing properties 5. This behavior is sometimes referred to as sucrose seeking or cue reactivity. In the present discussion we will use the term "sucrose craving" to subsume both of these constructs.
In the past decade, we have focused on how the length of time following reward self-administration influences reward craving. Interestingly, rats increase responding for the reward-paired cue over the course of several weeks of a period of forced-abstinence. This "incubation of craving" is observed in rats that have self-administered either food or drugs of abuse 4,6. This time-dependent increase in craving we have identified in the animal model may have great potential relevance to human drug and food addiction behaviors.
Here we present a protocol for assessing incubation of sucrose craving in rats. Variants of the procedure will be indicated where craving is assessed as responding for a discrete sucrose-paired cue following extinction of lever pressing within the sucrose self-administration context (Extinction without cues) or as responding for sucrose-paired cues in a general extinction context (Extinction with cues).

Responding for food or drug-paired cues increases over the course of a period of abstinence and this may relate to an increased susceptibility to relapse behaviors. Here we detail a procedure for evaluating this "incubation of craving" in rats that have self-administered sucrose.

שיטה כללית להערכת דגירה של השתוקקות סוכרוז בחולדות

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

תרבויות Explant עצביות מן<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissection, תרבות וניתוח של<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; רקמת רשתית עוברית

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

Microinjection האינסולין היפוקמפוס ו<em&gt; בחי</em&gt; Microdialysis במהלך בדיקת זיכרון המרחבי

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and sensorimotor plasticity1. Consistent sensory perturbations result in compensatory changes in motor output, reflecting changes in feedforward motor control that reduce the experienced feedback error. By quantifying how different sensory feedback errors affect human behavior, prior studies have explored how visual signals are used to recalibrate arm movements2,3 and auditory feedback is used to modify speech production4-7. The strength of this approach rests on the ability to mimic naturalistic errors in behavior, allowing the experimenter to observe how experienced errors in production are used to recalibrate motor output.
Songbirds provide an excellent animal model for investigating the neural basis of sensorimotor control and plasticity8,9. The songbird brain provides a well-defined circuit in which the areas necessary for song learning are spatially separated from those required for song production, and neural recording and lesion studies have made significant advances in understanding how different brain areas contribute to vocal behavior9-12. However, the lack of a naturalistic error-correction paradigm - in which a known acoustic parameter is perturbed by the experimenter and then corrected by the songbird - has made it difficult to understand the computations underlying vocal learning or how different elements of the neural circuit contribute to the correction of vocal errors13.
The technique described here gives the experimenter precise control over auditory feedback errors in singing birds, allowing the introduction of arbitrary sensory errors that can be used to drive vocal learning. Online sound-processing equipment is used to introduce a known perturbation to the acoustics of song, and a miniaturized headphones apparatus is used to replace a songbird's natural auditory feedback with the perturbed signal in real time. We have used this paradigm to perturb the fundamental frequency (pitch) of auditory feedback in adult songbirds, providing the first demonstration that adult birds maintain vocal performance using error correction14. The present protocol can be used to implement a wide range of sensory feedback perturbations (including but not limited to pitch shifts) to investigate the computational and neurophysiological basis of vocal learning.

We describe the design and assembly of miniaturized headphones suitable for replacing a songbird&#x2019;s natural auditory feedback with a manipulated acoustic signal. Online sound processing hardware is used to manipulate song output, introduce real-time errors in auditory feedback via the headphones, and drive vocal motor learning.

, מערכת אוזניות קלה משקל מבוססת על מניפולצית משוב שמיעתי בציפורי שיר

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

בו זמנית<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; In vivo</emמערכת electroretinogram&gt;

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

התנהגות Assay עבור Mechanosensation של MARCM מבוסס משובט ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

הקלטת פעילות עצבית הנגרמת טמפרטורה באמצעות ניטור שינויי סידן נורה חוש הריח של<em&gt; Laevis Xenopus</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...