עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות: EY015748, EY017964 (MEZ), וEY019517 (ASV). עבודה זו נתמכה גם על ידי המחקר למניעת העיוורון החופשי גרנט למחלקת העיניים והאריות של מרכז ניו יורק. כמו כן, אנו רוצים להודות לטכנאים שלנו בעלי החיים, מתיו Mellini, לטיפולו מצוין של בעלי החיים ולדריכה בלככב בסרטון זה.

טיפול בבעלי חיים Xenopus laevis ראשנים השתמשו במחקר זה גדלו, גדלו וטופלו בהתאם לנהלים שאושרו על ידי IACUC לרפואה של אוניברסיטת צפון מדינת והמדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. 1. התקנה טרום התנהגות: ראשנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג עוברי Xenopus מופרים ממקור זמין באופן מסחרי או במבחנה להפרות ביציות, כפי שתואר לעיל 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח blastula לעוברי שלב צלחת עצביים ב18 ˚ C ב60 מ&quot;מ צלחות פטרי המכילות 0.1X MMR [10 מניית רינגר הפתרון (MMR) השתנה של X מארק (10 מ&quot;מ MgCl 2; 20 מ&quot;מ KCl; 20 מ&quot;מ CaCl 2; 50 HEPES מ&quot;מ; 1 M NaCl; מותאם pH 7.5, autoclaved ומאוחסן ב RT)] עם האנטיביוטיקה גנטמיצין 50 מיקרוגרם / מיליליטר. שינוי 0.1X MMR בכל יום ולהסיר כל עוברים מתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שעובר להגיע לשלב Nieuwkoop ופייבר ~ 27-30 יולי, לעבור העוברי דואר ל0.1X MMR ללא אנטיביוטיקה כדי לאפשר התפתחות חיידקי מעיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את הראשנים עד שהם מגיעים לשלב ההאכלה (שלב 45) ולהעביר אותם ל100 מ&quot;מ צלחות פטרי מלא ב0.1X MMR. להאכיל אותם supernatant אבקת סרפד כל יום אחר במשך שבוע, שינוי MMR 0.1X ביום שחלף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שבוע אחד בצלחת פטרי 100 מ&quot;מ, להעביר חיות למחצית טנקי גלון מלאים במי צפרדע [אוקיינוס ​​מיידי 0.5 גר &#39;/ ליטר ו -2 dibasic פוספט מ&quot;מ נתרן (Na 2 HPO 4: MW 141.96) pH 6.8]. להאכיל אותם כמו בשלב 2.4, אבל לשנות את המים רק 2-3 פעמים בשבוע, כאשר המים עכורים. לשמור על בעלי החיים במחזור אור הכהה light/12 שעות 12 עם אורות ההפעלה ב -6 בבוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המכל חצי ליטר עם נושאי בדיקה על משטח לבן כמו underpad מעבדה ספסל, O שעה לפחות 12 / N, לפני הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשני מבחן בשלבי 45-50 כמתואר בשלב 3 להלן. </li></ol> . 2 התקנה טרום התנהגות: Equipmenלא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בצד על שטח של המעבדה עבור assay ההתנהגות. זה צריך להיות באזור עם תאורת ניאון סטנדרטית שקט, עם תנועה נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את טנקי בדיקות לבעלי החיים. , טנקי בדיקות חצי ליטר מקונן מורכבים משני חלקים: מיכל פנימי שיחזיק מים וראשנים; ומכל חיצוני עם הגירוי ויזואלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למכל הפנימי, לעשות סימן קטן בפינות בחוץ עם נוכל, 5 סנטימטר מהחלק התחתון; זה קו המים (איור 1 א, קו מקווקו ירוק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו כן, למכל הפנימי, למלא divets במכל (בפינות והמרכז) עם מתחם אינרטי, כמו אלסטומר Sylgard. הערה: הראשנים להשתהות באזורים אלה אם הם לא מלאים פנימה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למכל החיצוני, לכסות את המחצית בדיוק אחד מחוץ לטנק אחד עם סרט שחור חשמלי ואת החצי השני עם 1B איור נייר הטישו הלבן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הטנקים עליחסינו פטיפון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת מצלמות הרשת / חצובה, כך שהוא נמצא מעל למכלי הבדיקה. כוון את המצלמה כדי לאפשר הדמיה של אזור הבדיקה, כפי שמוצג באיור 1 ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מצלמת האינטרנט למחשב עם תוכנת QuickTime Player המותקנת 5. הפעל את המצלמה. בQuickTime Player, תחת קובץ, בחר &quot;חדשה סרט הקלטה.&quot; התקנת assay ההתנהגות תהיה גלויה במחשב מייד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף בבד כותנה קלה על כל ההתקנה כדי להפחית סימנים חיצוניים שיכול להשפיע על התנהגות ראשן, כמו גם, להפחית את האור מוחזר על פני השטח של המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שעוצמת ההארה באמצעי הבד בין 35-50 cd / m 2. </li></ol> 3. Assay ההתנהגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את מיכל הבדיקה הפנימי לסימן המים 5 סנטימטר נעשה בשלב 1.2.1 עם מים צפרדע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ברשת קטנה, בעדינות להזיז את בעל החיים לתוך טנק בדיקות הפנימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Q הפתוחuickTime תוכנה במחשב, ושימוש במכל החיצוני כמדריך, ודא שהמצלמה היא מסוגלת לדמיין ולהקליט את אזור הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתוב את שם החיה, תאריך ושעה על פיסת נייר ולהקליט עם המצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מיכל הבדיקה למכל החיצוני עם הצד השחור של הטנק לאיור מימין 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל להקליט את הסרט מייד לאחר הסדרת הטנק ולהגדיר טיימר למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר צפצופי טיימר, להסיר את מיכל הבדיקה הפנימי, לסובב את המכל החיצוני 180 מעלות ומניחים את מיכל הבדיקה הפנימי בתוך הטנק החיצוני. הפעל את שעון העצר. הערה: בצד השחור צריך עכשיו להיות בצד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.7, שמונה פעמים יותר עבור סכום כולל של עשרה ניסיונות. השתמש באיור 2 כמדריך, בודק את כל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על assay ההתנהגות בשני ימים נפרדים. </li></ol> 4. רשתית Axotomy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניחו לבעלי חיים בtricaine 0.02% עד שהם לא מגיביםלקמצוץ זנב עם # 3 מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמס agarose 1% ב0.1X MMR ולאחר מכן להוסיף לצלחת פטרי 60 מ&quot;מ. לאחר המצונן, להפוך divot מלבני קטן בagarose ולהוסיף את הראשן לdivot עם tricaine 0.02% קטנים, כדי שבעל החיים הוא שקוע בחלקו בנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירס העור בזווית של 45 תואר מאחורי אזור הגב של העין עם מחט 25 G, בעוד מרענן החיה נגד מלקחיים בצד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נזהר שלא לגזור את הווריד, הנמצא בסמוך לעצב הראייה, להגיע בזהירות לתוך החור עם # 5 מלקחיים, לגזור את עצב הראייה ולהעיף החוצה את דרכו. אם יש דימום חמור בשל טעות לגזום את העורק, ואז למקם את מהירות של בעלי החיים בtricaine 2% להרדים. זהירות: 2% פתרון tricaine יכול לגרום לחוסר תחושה בבני אדם. פתרון זה צריך להיות מטופלים עם כפפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשחזר את בעלי החיים לאחר ניתוח, למקם את בעלי החיים ב100 מ&quot;מ צלחת פטרי עם 0.7x MMR ו50 גנטמיצין מיקרוגרם / מיליליטר עבור 20 דקות. NeXT, ראשן העברה להחלמה מיכל עם מים צפרדע. בואו O / נ שאר בעלי החיים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, לבדוק את תפקוד הראייה כפי שתואר לעיל (שלבים 3.1-3.9). </li></ol> 5. לנתח את התוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניסויים שתסיימו, למדוד את כמות הזמן שהראשן נשאר בצד השחור של הטנק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני להציג את קטעי הווידאו באמצעות תוכנה המציגה את השעה ומאפשרת השהיה תכופה. תסתכל על זמן תצוגת וידאו. רשום את תחילת המשפט של שתי דקות, וזה כאשר המכל הפנימי מקנן בהצלחה בתוך הטנק החיצוני והוא בריבוע בתצוגה של המצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקום של העיניים של הראשן להגדיר באיזה צד של טנק החיות שוחות ב. הגדר חוצה את הגבול מצד אחד של הטנק האחר רק כאשר שני העיניים חצו את הקו השחור / לבן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את ההתחלה ואת הסוף של כל מרווח זמן (בשניות) שהחיה מבלה בצד השחור. השהה ומחדשבסופו של הווידאו כדי להבטיח דיוק. סה&quot;כ שניות בתוך כל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלט מספרים אלה לתוך גיליון ההתנהגות המצורפת. הגיליון יהיה לחשב את היחס בין הזמן שהחיה בילתה בצד הלבן על ידי הפחתת המשך הזמן על הצד השחור של הטנק מהמשפט הכולל 120 שניות ולחלק את הסך כל הזמן בשניות [(120 - שניות בסך הכל בילו על הצד השחור) / 120 שניות]. ממוצעי גיליון יחס זה על כל 10 הניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במבחן t של סטודנט, לזווג, הפצת שני זנב כדי לקבוע אם הניסויים בין הימים הם משמעותיים (P ≤ 0.05). </li></ol>

<ol>
	<li>Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+zebrafish+oculomotor+behavior+to+model+human+disorders.">Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders.</a> Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).</li><li>Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+modulation+of+temporal+properties+of+the+rod+pathway+in+larval+Xenopus.">Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus.</a> J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).</li><li>Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preference+for+background+color+of+the+Xenopus+laevis+tadpole.">Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole.</a> J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).</li><li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells.">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7 (8), (2009).</li><li>Choi, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cone+degeneration+following+rod+ablation+in+a+reversible+model+of+retinal+degeneration.">Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).</li><li>Viczian, A. S., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+determination+using+the+animal+cap+transplant+(ACT)+assay+in+Xenopus+laevis.">Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis.</a> J Vis Exp. 16 (39), (2010).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second-generation+device+for+automated+training+and+quantitative+behavior+analyses+of+molecularly-tractable+model+organisms.">A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms.</a> PLoS One. 5 (12), (2010).</li><li>Rosemberg, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+spatio-temporal+behavior+of+zebrafish+in+the+open+tank+paradigm+after+a+short-period+confinement+into+dark+and+bright+environments.">Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li><li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Avoidance+in+Xenopus+Tadpoles+is+Correlated+With+the+Maturation+of+Visual+Responses+in+the+Optic+Tectum.">Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum.</a> J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li><li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin+Elicits+Retinal+Fate+In+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells.">Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).</li><li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos.">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

אנו מדווחים כאן assay מודרך חזון פשוט התנהגותיים שניתן לבצע בקלות בשבוע על ידי אנשי מעבדה מינימאלי מאומנים. בעוד מבחני אחרים דורשים ציוד מיוחד ומומחיות בהתנהגות בעלי חיים, assay זה מאפשר בדיקה מהירה כדי לקבוע תפקוד ראייה. עוד assay התנהגותיות, assay ההימנעות החזותי, פותח כדי ל?...

laevis Xenopus שימש כאורגניזם מודל ללמוד היווצרות עין. העיניים לפתח במהירות, הולכת וגדלה לפדיון בפחות משבוע לגנים או מסלולי בדיקה שיש להם השפעה על התפתחות ותפקוד ראייה. כדי לבדוק את התפקוד חזותי, תגובת optokinetic וoptomotor נעשתה שימוש בדג זברה וראשני Xenopus, בהתאמה 1,2. בגלל העיניים של ראשני Xenopus הן קטנות יחסית לדג זברה, assay זה מחייב שימוש בציוד מיוחד וצוות מיומן לזהות את הזנב להעיף ועיני תנועת התנהגות העדינה בXenopus. התנהגות חזקה יותר בXenopus היא ההעדפה לשחייה במכל עם רקע לבן, אשר מתואר במסמך 3. בעת ביצוע ראשן במחצית טנק שחור / חצי לבן, הראשן מראש מותמרים שוחה במהירות לצד הלבן של הטנק. אנחנו השתמשנו בעבר assay זה כדי לקבוע אם נגזר תאי pluripotentעיניים היו פונקציונליות 4. כאן אנו מדווחים גרסה מפורטת של assay זה, אשר יכול לשמש כדי לבדוק את תפקוד הראייה של ראשני Xenopus premetamorphic. assay זה הוא פשוט יותר מאשר assay תגובת optomotor, שכן הוא רק דורש מצלמת וידאו מותקן דיגיטלית, תוכנת מצלמה דיגיטלית וציוד סטנדרטי המצוי ברוב מעבדות Xenopus. בנוסף, התגובה נרשמה לא דורשת הכשרה מיוחדת לתוצאות עולים בקנה אחד. תוצאות הנציג שלנו מראות כי אותה הקבוצה של ראשנים, שעברה axotomy כפול רשתית, לשחות באופן אקראי מסביב לטנק. כללנו גם את תוצאות assay ההתנהגות מראשן של נציג, המראה כיצד עין אחת יכולה להיבדק על תגובה חזותית. גיליון עבודה כבר כלול כך שניתן להוסיף מספרים שנרכשו במהלך assay ונותחו. גיליון עבודה זה יכול לשמש כדי לקבוע אם יש להם את הראשנים שנבדקו תגובה חזותית.

<table><tbody><tr><td>1/2 Gallon Flex-Tank with Cover</td><td>eNasco</td><td>SB19271M</td><td>Size: 5-3/8&quot; x 7&quot; x 3-3/4&quot;</td></tr><tr><td>Black electrical tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>White tissue paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large inoculating turntable</td><td>VWR</td><td>50809-022</td><td>Size: Dia 114.3 x&amp;nbsp; H 76.2 mm (4 1/2&amp;nbsp; x&amp;nbsp; 3&quot;)</td></tr><tr><td>Durasorb underpad</td><td>VWR</td><td>82004-836</td><td>Size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24&quot;)</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1945-34155-CS</td><td></td></tr><tr><td>Standard tripod</td><td></td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>iSight camera or webcam</td><td>Apple</td><td>M8817LL/A</td><td>Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see</td></tr><tr><td>Portable computer</td><td>Apple/PC</td><td>Various</td><td>We used a 13&quot; MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5</td></tr><tr><td>MiniDV handycam camcorder</td><td>SONY</td><td>DCR-HC42</td><td>Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Handycam station</td><td>SONY</td><td>DCRA-C121</td><td>This can be used for connecting firewire to camera</td></tr><tr><td>QuickTime Player software</td><td>Quicktime</td><td>Version 10.1</td><td></td></tr><tr><td>26 G Needle (5/8&quot; length)</td><td>VWR</td><td>BD305115</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate [50 mg/ml]</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-528Z</td><td>Stored at RT</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>Instant ocean</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-116528</td><td>Stock solution = 100 g/L stored at RT</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0876</td><td>Stock solution = 0.4 M stored at RT</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In vitro&lt;/em&gt; fertilized embryos</td><td>eNasco</td><td>LM00490MX</td><td>100 embryos/unit</td></tr></tbody></table>

a simple behavioral assay for testing visual function in xenopus laevis

מדידה של תפקוד הראייה בראשנים של הצפרדע, laevis Xenopus, מאפשרת הקרנה לעיוורון בבעלי חיים. תגובת optokinetic היא, התנהגות רפלקסיבית המבוסס על חזון שכבר נצפתה בכל בעלי החוליות שנבדקו. עיני ראשן הם קטנים כל כך התגובה להעיף זנב שימשה כאמצעי חלופי, שדורש טכנאי מיומן כדי להקליט את התגובה העדינה. פיתחנו assay התנהגות חלופי המבוסס על העובדה שראשנים מעדיפים לשחות בצד הלבן של טנק כאשר הוא ממוקם בטנק עם צדדים הן בשחור לבן. Assay שהוצג כאן מהווה חלופה זולה ופשוטה שיוצרת תגובה שנמדדת בקלות. ההתקנה מורכבת מחצובה, מצלמת האינטרנט וטנקים בדיקות מקוננות, זמינה ברוב מעבדות Xenopus. מאמר זה כולל סרט המראה את התנהגותם של ראשנים, לפני ואחרי ניתוק עצב הראייה. על מנת לבדוק את התפקוד של עין אחת, אנחנו גם כוללים ייצוגיםתוצאות sentative של ראשן שבו כל עיניים עברו axotomy רשתית בימים רצופים. מחקרים עתידיים יכולים לפתח גרסה אוטומטית של assay זה לבדיקת הראייה של ראשנים רבים בבת אחת.

דיווחים קודמים הראו כי ראשני Xenopus premetamorphic מעדיפים לשחות בצד הלבן של טנק בשחור / לבן וקראו assay זה, assay העדפות צבע רקע 3 שינינו assay זה על מנת לבדוק את תפקוד הראייה של שני עיניים של ראשנים ב פחות משבוע. בדרך זו, ניתן לאסוף את עיניהם לבדיקה היסטולוגית. <p class="jove_content...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis at JoVE.com

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis ראשנים מעדיפים שחייה בצד הלבן של טנק בשחור / לבן. התנהגות זו מונחה על ידי החזון שלהם. בהתבסס על התנהגות זו, אנו מציגים assay פשוט כדי לבדוק את תפקוד הראייה של ראשנים.

Assay התנהגות פשוט לפונקציה של Visual בדיקה ב<em&gt; Laevis Xenopus</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

a-simple-behavioral-assay-for-testing-visual-function-xenopus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

9.8K Views.  Center for Vision Research, SUNY Eye Institute, Upstate Medical University.  Xenopus laevis ראשנים מעדיפים שחייה בצד הלבן של טנק בשחור / לבן. התנהגות זו מונחה על ידי החזון שלהם. בהתבסס על התנהגות זו, אנו מציגים assay פשוט כדי לבדוק את תפקוד הראייה של ראשנים. 

Video: A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biology

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Assay ההתנהגות כדי למדוד את התגובה של דג הזברה לשינויים לעוצמות אור

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, robust, and simple to manipulate. A suitable model has been found in the optokinetic response (OKR), a reflexive behavior present in all vertebrates due to its high selection value. The OKR involves slow stimulus-following movements of eyes alternated with rapid resetting saccades. The measurement of this behavior is easily carried out in zebrafish larvae, due to its early and stable onset (fully developed after 96 hours post fertilization (hpf)), and benefitting from the thorough knowledge about zebrafish genetics, for decades one of the favored model organisms in this field. Meanwhile the analysis of similar mechanisms in adult fish has gained importance, particularly for pharmacological and toxicological applications.
Here we describe VisioTracker, a fully automated, high-throughput system for quantitative analysis of visual performance. The system is based on research carried out in the group of Prof. Stephan Neuhauss and was re-designed by TSE Systems. It consists of an immobilizing device for small fish monitored by a high-quality video camera equipped with a high-resolution zoom lens. The fish container is surrounded by a drum screen, upon which computer-generated stimulus patterns can be projected. Eye movements are recorded and automatically analyzed by the VisioTracker software package in real time.
Data analysis enables immediate recognition of parameters such as slow and fast phase duration, movement cycle frequency, slow-phase gain, visual acuity, and contrast sensitivity.
Typical results allow for example the rapid identification of visual system mutants that show no apparent alteration in wild type morphology, or the determination of quantitative effects of pharmacological or toxic and mutagenic agents on visual system performance.

The VisioTracker is an automated system for the quantitative analysis of visual performance of larval and small adult fish based on the recording of eye movements. It features full control over visual stimulus properties and real-time analysis, enabling high-throughput research in fields such as visual system development and function, pharmacology, neural circuit studies and sensorimotor integration.

VisioTracker, גישה אוטומטית חדשנית לניתוח oculomotor

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple response. More recently adult visual behavior in zebrafish has become of interest, but methods to measure specific responses are new coming. To address this gap, we set out to develop a methodology to repeatedly and accurately utilize the optokinetic response (OKR) to measure visual acuity in adult zebrafish. Here we show that the adult zebrafish's visual acuity can be measured, including both binocular and monocular acuities. Because the fish is not harmed during the procedure, the visual acuity can be measured and compared over short or long periods of time. The visual acuity measurements described here can also be done quickly allowing for high throughput and for additional visual procedures if desired. This type of analysis is conducive to drug intervention studies or investigations of disease progression.

Zebrafish have been a valuable tool for many research areas. Here we demonstrate a method to elicit a visual response and calculate a functional visual acuity in the adult zebrafish.

תגובת Optokinetic כמדד כמותי של חדות ראייה בדג הזברה

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the  earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple  ...

Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats

The optomotor response and the Y-maze are behavioral tests useful for assessing visual and cognitive function, respectively. The optomotor response is a valuable tool to track changes in spatial frequency (SF) and contrast sensitivity (CS) thresholds over time in a number of retinal disease models, including diabetic retinopathy. Similarly, the Y-maze can be used to monitor spatial cognition (as measured by spontaneous alternation) and exploratory behavior (as measured by a number of entries) in a number of disease models that affect the central nervous system. Advantages of the optomotor response and the Y-maze include sensitivity, speed of testing, the use of innate responses (training is not needed), and the ability to be performed on awake (non-anesthetized) animals. Here, protocols are described for both the optomotor response and the Y-maze and examples of their use shown in models of Type I and Type II diabetes. Methods include preparation of rodents and equipment, performance of the optomotor response and the Y-maze, and post-test data analysis.

Neural degeneration in both eyes and brain as a result of diabetes can be observed through behavioral tests carried out on rodents. The Y-maze, a measure of spatial cognition, and the optomotor response, a measure of visual function, both provide insight into potential diagnoses and treatments.

הערכה התנהגותית של תפקוד חזותי באמצעות תגובת Optomotor ותפקוד קוגניטיבי באמצעות Y-Maze בחולדות סוכרתיות

The optomotor response and the Y-maze are behavioral tests useful for assessing visual and cognitive function, respectively. The optomotor response is a ...

Behavior

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Developmental Biology

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

רקמות קביעת שווי שימוש בבעלי חיים להשתלות (ACT) Assay ב Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the surface of the cornea, electrical activity generated in response to light can be measured and used to assess the activity of retinal cells in vivo. This manuscript describes the use of the ERG to measure visual function in zebrafish. Zebrafish have long been utilized as a model for vertebrate development due to the ease of gene suppression by morpholino oligonucleotides and pharmacological manipulation. At 5-10 dpf, only cones are functional in the larval retina. Therefore, the zebrafish, unlike other animals, is a powerful model system for the study of cone visual function in vivo. This protocol uses standard anesthesia, micromanipulation and stereomicroscopy protocols that are common in laboratories that perform zebrafish research. The outlined methods make use of standard electrophysiology equipment and a low light camera to guide the placement of the recording microelectrode onto the larval cornea. Finally, we demonstrate how a commercially available ERG stimulator/recorder originally designed for use with mice can easily be adapted for use with zebrafish. ERG of larval zebrafish provides an excellent method of assaying cone visual function in animals that have been modified by morpholino oligonucleotide injection as well as newer genome engineering techniques such as Zinc Finger Nucleases (ZFNs), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs), and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9, all of which have greatly increased the efficiency and efficacy of gene targeting in zebrafish. In addition, we take advantage of the ability of pharmacological agents to penetrate zebrafish larvae to evaluate the molecular components that contribute to the photoresponse. This protocol outlines a setup that can be modified and used by researchers with various experimental goals.

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

ניתוח electroretinogram של התגובה החזותית בדג הזברה זחלים

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

הערכה תפקודית של חוש הריח מסלולים ב ראשנים של צפרדע רפואית חי

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Zebrafish Avoidance and Thigmotaxis Assay: A High-Throughput Method to Examine Larval Behavior in Response to Aversive Visual Stimulus

Source: Richendrfer, H., et al. <a href="https://www.jove.com/v/50622/" target="_blank">Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae</a>. &#160;J. Vis. Exp.&#160;(2013)
The video describes the avoidance and thigmotaxis assay of zebrafish larvae. The video examines the behavior of zebrafish larvae in response to visual aversive stimulus.

הימנעות מדגי זברה ובדיקת תיגמוטקסיס: שיטה בעלת תפוקה גבוהה לבחינת התנהגות הזחלים בתגובה לגירוי חזותי מרתיע

Source: Richendrfer, H., et al. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. &#160;J. Vis. Exp.&#160;(2013)
The video describes the ...

Assay התנהגות פשוט לפונקציה של Visual בדיקה ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video