עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר כדי למנוע עיוורון (פיתוח קריירה פרסים MEZ ו ASV ו מענק חופשית מחלקת עיניים), את מטילדה א זיגלר קרן (MEZ ו ASV) ואת העין לאומי / NIH (MEZ , מענקים R01EY015748 ו R01EY017964).

חלק א הקמה עבור Assay ACT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת רנ&quot;א כתרים להזרקה כפי שהוצע על ידי היצרן, באמצעות פנול שלהם: שיטת טיהור כלורופורם (למשל mMessage mMachine קיט; Applied Biosystems / Ambion, אוסטין, טקסס). קידוד RNA חלבון פלואורסצנטי משמש נותב. אנו לתמלל או חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) או mCherry 5 cDNA, שהוא וקטור ביטוי pCS2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך צינורות זכוכית בורוסיליקט נימי טיפים ליצירת זכוכית קוני באמצעות חולץ micropipette. אנו משתמשים סאטר micropipette פולר, P-97 (סאטר מכשירים, Inc, Novato, CA), כפי שתואר לעיל 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את פתרונות סטרילי בטבלה 1 מתוך 10 השתנה X של מארק Ringer של (MMR) פתרון המניות (10 mM MgCl 2: 20 מ&quot;מ KCl: 20 מ&quot;מ CaCl 2; 50 HEPES מ&quot;מ; 1 M NaCl; מותאם pH 7.5, autoclaved ומאוחסנים ב RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד האשכים מן צפרדע זכר לחנות רקמה על 4 ° C בתמיסה סטרילית של 1X MMR / גנטמיצין (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​גנטמיצין סולפט; BioWhittaker, חתול # 17-518Z). ניתן לעשות זאת עד שבוע לפני תחילת הניסוי, אבל זה מאבד את יעילותו לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון ההטלה (1X: 150 mM NaCl, KCl mM 2.62, 0.8 mM Na 2 HPO 4, 20 מ&quot;מ Trizma בסיס, 2.62 mM NaHCO 3 ו - 2.75 mM MgSO 4; מותאם pH 7.6) ניתן גם מניות 8X, אשר ניתן לאחסן 4 ° C למשך עד שבועיים. הערה: להיזהר זיהום בפתרון זה, כמו זה ישפיע על איכות הביצים שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור צלחות ההזרקה. כדי לעשות זאת, להמיס agarose 1% MMR 0.4X במיקרוגל, מוסיפים 6 ~ פתרון נמס לתוך 60 מ&quot;ל agarose צלחות מ&quot;מ, לגולל בעדינות עובש אלסטומר (איור 1) על גבי פתרון כדי למנוע בועות ולתת להתקרר למשך כ 20 דקות RT. כדי לקבוע את מספר צורך לשקול מספר תנאים ניסויים (למשל 1, YFP; 2, YFP noggin +) ואת מספר העוברים המושתלים מארח הצורך. על הניסויים שלנו, אנחנו מייצרים לפחות 20 עוברי מארח המושתלים עבור כל תנאי הניסוי. ב 18-19 ° C, עוברים יהיה בשלב 15 במשך כשעה. אם זה לוקח שעה לבצע 20 השתלות, אז שתי נקודות זמן הפריה יש צורך, בהנחה עוברים מארח לקבל את כל ההשתלות. לכן, ארבע מנות הזרקה יהיה צורך (2 תנאים exp x 2 נקודות זמן הפריה = 4). אחסן את הלוחות על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור בידוד כובע צלחות באמצעות 1% agarose + 0.7X MMR עם תבניות כמו צלחת ההזרקה. בצע את אותו מספר של בידוד כובע כמו צלחות זריקה ועוד אחד זמן נוסף לכל נקודה הפריה (4 + 2 נקודות זמן הפריה = 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק נקבות עם 500 יחידות גונדוטרופין כוריוני אנושי מאוחר יותר באותו יום יום לפני microinjection. חנות נקבות ב 16-18 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> חלק II. RNA Microinjection עוברים Xenopus laevis א הכנה microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נקבה המושרה הורמונלי ומכניסים אותם טנקים בודדים המכיל 1X פתרון ההטלה (ELS). הערה: אנחנו לא משתמשים בביצים, כי כבר ב ELS יותר משעתיים כמו איכות הביצים מצטמצם. לכן, כשעה לפני הפריה חוץ גופית, אנו לזרוק את כל הביצים מהטנק כך ביצים רק טרי נאספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המחט על ידי microinjection תולשת את קצה להשיג בקוטר 25-35 מיקרומטר. מניחים את המחט אל picoinjector לכייל אותו כך שהוא מחלק 10 NL לכל זריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר באינקובטור עד 14 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הנקבות יש הטילו ביצים במשך כשעה, להסיר את הביצים מהטנק באמצעות פיפטה להעביר ולהכניס אותם לתוך 60 מ&quot;מ צלחות פטרי. הסר כמו ELS הרבה מן הביצים ככל האפשר ולהחליף MMR 1X. הביצים יכול להיות מופרית מיד או להישאר MMR 1X עד שעה. עבור assay ההשתלה, עדיף להפרות שתי מנות, 80% מלא בשכבה אחת של ביצים עד שלוש קבוצות נפרדות בסביבות 11:00, צהריים 01:00. לאחר ההזרקה, הם יוצבו על 14 מעלות צלזיוס, כך שהם יגדלו בשלבים הרצוי עבור בידוד כובע (שלב 8.5-9) וכן השתלה (שלב 15; לראות חלק I, # 6 לעיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק את האיכות של האשכים, אנו מבצעים הפריה הבוקר המוקדמות (~ 08:00), אשר מאפשרת לנו לחלץ מן האשכים הגברי אחר אם הזרע הראשון אינו בר קיימא. הערה: אנו homogenize ~ 0.25 האשכים ב 1 מ&quot;ל 1X MMR ולהוסיף כ 5-7 טיפות לכל צלחת של ביציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במבחנה להפרות את הביצים עם האשכים הומוגני וגם, כעבור שעה, להסיר את המעיל ג&#39;לי על הביצים באמצעות דה ג&#39;לי פתרון (164μl 1M DTT + 10 מ&quot;ל 1M טריס, pH 8.8 עד 50 מים nanopure autoclaved מ&quot;ל). חכו עד שהם מגיעים שני תאים בשלב להתחיל מיון, אשר לוקח בערך 2 שעות 18 ° C או 1.5 שעות בטמפרטורת החדר (22 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש transfאה פיפטה, עוברים מיון פיגמנט אחיד לחלק באופן שווה, כפי שמוצג כובע החיה שמאל באיור 3, לתוך הבאר של צלחת זריקה מלא Ficoll + 0.4X MMR 6%. </li></ol> ב Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתיחה Parafilm מעל מכסה 60 מ&quot;מ צלחת פטרי. פיפטה 2 μl של הדוגמה הראשונה RNA שלך על Parafilm ואת לשאוב באמצעות PLI-100 כדי למלא את מחט הזריקה שלך. הקפד לבדוק כי המחט עדיין מחלק 10 NL המדגם לפני תחילת ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 20-30 שני תא עוברי בשלב (שניהם בלסטומרים) עם 500 עמ YFP RNA בצלחת אחת הגן העניין שלך (למשל 20 pg noggin RNA) בתוספת YFP RNA בצלחת נוספת 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 100-200 הלא מוזרק עוברים לכל נקודת זמן בצלחת עוד זריקה עם פתרון Ficoll. העבר אותם פנימה והחוצה של החממה באותו זמן כמו עוברי מוזרק. אלה המארחים כדי לשמש חלק ד &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה, דגירה כל העוברים על 14 מעלות צלזיוס למשך הלילה. חזור על הפעולה עבור כל נקודות הזמן. </li></ol> חלק III. בודד כמוסות חיים מעוברים מוזרק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגעה בשעות הבוקר המוקדמות לשלב עוברי. נקודת הזמן המוקדם אמור להיות בשלב 9. הסר את אלה שלא שרדו. המשך בשלבים הבאים לעבוד עם נקודה בכל פעם בקבוצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הפתרון Ficoll מהצלחת כל ולהוסיף MMR 0.7X בחזרה / פתרון גנטמיצין. כדי בצלחת הבידוד המכסה, מוסיפים כמות נדיבה של פתרון ה-MMR / גנטמיצין 0.7X. לעקור עוברים מצלחת זריקה שלהם בארות באמצעות פיפטה להעביר מקום את התבשיל מוכן טרי הבידוד המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד כמוסות חיה פתרון 0.7X MMR + גנטמיצין, שמירה על 2 או 3 עוברים שלם עבור הבימוי. או Gastromaster, מצויד קצה צהוב התכופפה 400 מיקרומטר, או זוג 5 מלקחיים חדה במספר ניתן להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים כמוסות בחזרה 14 ° C החממה עד למחרת. עוברים המארח יש להסיר מן האינקובטור באותו זמן כמו כובעים כדי לשמור אותם בשלב התפתחותי זהה רקמות התורם. </li></ol> חלק ד &#39;. השתלה של כמוסות על האגף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כובעים עוברים מנקודה זו הפעם הראשונה מתוך 14 ° C החממה בשלב עוברי. מיון אחיד עבור ניאון חיובי כמוסות צהוב או אדום, תלוי הזריקו נותב (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת כובעים להסיר להכפיל את מספר השלב 12-13 עוברים לצלחת הזרקת מוכן טרי עם 0.7X MMR / פתרון גנטמיצין. עם חדות מלקחיים # 5, להסיר את הקרום vitelline מכל אחד. העברת אותם בצלחת עם כובעים, אבל להיות זהירים. ללא קרומים vitelline שלהם, עוברים במהירות לנתק את פני המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש (קצה צהוב, חוט 200-250μm כפופות, הגדרת הגבוה ביותר) gastromaster או # 5 מלקחיים, להסיר 200 מיקרומטר מרובע בצד של העובר בשלב 14-15 (איור 3). לאחר מכן, לחתוך כובע במחצית (עם gastromaster או # 5 מלקחיים) והמקום רקמות החור שנעשו בעובר המארח. סובב את העובר נגד היטב כדי לאפשר ריפוי. האם זה כמו עוברים רבים ככל שאתה יכול בזמן שהם בשלב 15. חזור על הפעולה עבור כל נקודות הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העובר בדרך כלל לרפא בתוך 30 דקות. הסרת התאים המתים (לבן) בתנועה הברשה עדינה עם מלקחיים # 5. לגדל אותם 18 ° C במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח, עוברים מיון עם רקמה, fluorescently שכותרתו המושתלים. שים אותם בחזרה 18 ° C לגדול עד לשלב 42-43. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיות tricaine. בשלב זה, אתה יכול לצלם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח. לאחר שתסיים, לתקן, סעיף ו immunostain או לבצע הכלאה באתרו באמצעות סמנים עבור רקמות העניין שלך. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. עיצוב של פרספקס ליציקת את התבנית אלסטומר משמש להכנת מאכלים מחזיק העובר. 38 x 38 עגול פינות מ&quot;מ מרובע (~ 5 מ&quot;מ עמוק) כבר מנותב מתוך פיסת פרספקס כי הוא 50 x 50 מ&quot;מ מרובע ו 25 מ&quot;מ עובי. בחוזר, בארות מחולקת באופן שווה (בקוטר 1.5 מ&quot;מ) כבר קדחו 1 מ&quot;מ עמוק לתוך הפלסטיק. כדי להפוך את התבנית אלסטומר עבור microinjection את הכלים, אנחנו מזג אלסטומר Sylgard לתוך פרספקס ואיפשר לו לגבש, לפי הוראות היצרן. עובש זה אלסטומר משמש לייצור הזרקת ובידוד צלחות כובע. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. כובע מיון בעלי חיים לפני השתלת חשוב, כביטוי יכול להשתנות. כובע בעלי חיים בצד שמאל מבטא mCherry באופן שווה על פני רקמת בעוד explant בצד ימין יש ביטוי מחוצ&#39;קנים, ייפסל. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. Tadp מארחOLE פיתחה מבנה העין כמו על האגף שלו מן התאים המושתלים כובע בעלי חיים. תמונה פלורסנט כבר overlayed על התמונה brightfield.

<ol>
	<li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+cloning+of+noggin,+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos.">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li><li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin.">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li><li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Methods+in+Developmental+Biology:+Xenopus+&#38;+Zebrafish.">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus &#38; Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , (1999).</li><li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells.">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells.">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li></ol>

בסרטון זה, יש לנו הפגינו הגרסה שלנו של טכניקות קלאסיות בשימוש על ידי ביולוגים Xenopus, שאנו מחדש ליצור את כובע חיה assay להשתלה. בטמפרטורת החדר, עוברים Xenopus לפתח מהר מאוד שלבים 9 ו -15. על ידי הצבת אותם על 14 מעלות צלזיוס, התפתחות העובר הוא האט השתלות רבות יותר ניתן לבצע...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>mMessage mMachine SP6 Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems/Ambion</td>
<td>AM1340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FHC, Inc</td>
<td>27-30-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sutter Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments, Inc.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin sulfate [50 mg/ml]</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BW17-528Z</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard/elastomer Kit 1.1lb</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9644388</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 x 15 mm polystyrene petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>8609-0160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>human chorionic gonadotropin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intervet</td>
<td>22219</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pico-Injector Microinjection Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>650003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11-680-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Krackeler</td>
<td>6290-20635A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumostar #5 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11295-10</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

tissue determination using the animal cap transplant (act) assay in xenopus laevis

חלבונים רבים משחקים תפקיד כפול ההתפתחות העוברית. אלה המווסתים את גורל קביעת תא ברקמה מסוימת יכול להשפיע גם על פיתוח של אזור גדול יותר של העובר. זה הופך את הגדרת תפקידה רקמה מסוימת קשה לנתח. לדוגמה,<em&gt; Noggin</em&gt; Overexpression ב<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; עוברים גורמת להרחבת האזור הקדמי כולו, כולל העין<sup&gt; 1,2</sup&gt;. מתוך תוצאה זו, לא ידוע אם noggin ממלאת תפקיד ישיר בקביעת העין או על ידי גרימת הרחבה של רקמה עצבית, noggin משפיע בעקיפין היווצרות העין. אחרי זה פנוטיפ מורכבים עושה לומד תפקיד עין ספציפי שלה בקביעת גורל התא קשה לנתח. פיתחנו assay כי מתגבר על הבעיה הזו. ניצול של הטבע pluripotent של<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; בעלי חיים כובע<sup&gt; 3</sup&gt;, פיתחנו assay לבחון את היכולת של המוצר גן (ים), כמו<em&gt; Noggin</em&gt; או את שדה עין גורמי תעתוק (EFTFs), להפוך כמוסות לרקמה מסוימת או סוגי תאים ידי השתלת רקמה זו על הצד של העובר<sup&gt; 4</sup&gt;. אמנם מצאנו גם חלבון noggin טיפול או אוסף של גורמי שעתוק יכולים לקבוע את גורל התא רשתית כמוסות חיה, הליך זה יכול לשמש כדי לזהות מוצר הגן (ים) מעורב ציון ברקמות אחרות.

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis at JoVE.com

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

בעלי חיים כמוסות overexpressing הגן המוצר (ים) שנמצאים מושתלים האגף לפיתוח<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; עוברים על מנת לקבוע אם רקמת נקבע.

רקמות קביעת שווי שימוש בבעלי חיים להשתלות (ACT) Assay ב Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

tissue-determination-using-animal-cap-transplant-act-assay-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

12.1K Views.  SUNY Upstate Medical University. בעלי חיים כמוסות overexpressing הגן המוצר (ים) שנמצאים מושתלים האגף לפיתוח Xenopus laevis עוברים על מנת לקבוע אם רקמת נקבע.

Video: Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Dissection של ארגונית הקוטב Explants בעלי חיים מעוברים Xenopus laevis והרכבה של Assay הידבקות התא

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

פלסטיק הטבעת ואת חתך של עוברים Xenopus laevis

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

קבלת ביצים Xenopus laevis נקבות

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

הכנה ההיפוך חלוקה של Xenopus laevis ביצה תמציות

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

החלב להשתלות אפיתל נוהל

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Dissection של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; העצבי קרסט עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; Explant תרבות או<em&gt; In vivo</em&gt; השתלות

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

באמצעות plusTipTracker תוכנה כדי למדוד microtubule Dynamics ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; קונוסים צמיחה

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...