Name: a simple behavioral assay for testing visual function in xenopus laevis
Uploaded: 2014-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health: EY015748, EY017964 (MEZ) und EY019517 (ASV). Diese Arbeit wurde von der Forschung unterstützt, um Blindheit gebundene Zuwendung an die Augenklinik und die Lions des Zentral New York verhindern. Wir möchten auch unseren Tiertechniker, Matthew Mellini, für seine hervorragende Betreuung der Tiere und für die Intensivierung in in diesem Video Star danken.

Tierpflege Die Xenopus laevis Kaulquappen in dieser Studie verwendet wurden nach Verfahren, die von Upstate Medical University IACUC und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt angebaut, aufgezogen und behandelt. . Ein Pre-Verhalten Setup: Kaulquappen <ol><li> Erhalten befruchteten Xenopus-Embryonen aus einer handelsüblichen Quelle oder in vitro zu befruchten Oozyten, wie oben beschrieben 6. </li><li> Zeigen Blastula zu Neuralplatte Embryonen bei 18 ˚ C in 60 mm Petrischalen mit 0,1 X MMR [10 X Marc Geändert Ringer-(MMR)-Lösung Lager (10 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2, 50 mM HEPES; 1 M NaCl, eingestellt auf pH 7,5, autoklaviert und bei RT gelagert)] mit 50 ug / ml Gentamicin-Antibiotikum. Ändern 0,1 X MMR jeden Tag und entfernen Sie alle toten Embryonen. </li><li> Sobald die Embryonen erreichen Nieuwkoop und Faber Bühne ~ von 27. bis 30. Juli, schalten thE Embryonen in 0,1 × MMR ohne Antibiotikum Darm Bakterienwachstum zu ermöglichen. </li><li> Wachsen die Kaulquappen, bis sie die Fütterungsstufe (Stufe 45) zu erreichen und sie in 100 mm Petrischalen mit 0,1 X MMR gefüllt. Füttere sie Brennnesselpulver Stand jeden zweiten Tag für eine Woche, die Änderung der MMR 0,1 X auf dem dazwischen Tag. </li><li> Nach einer Woche in der 100-mm-Petrischale, verschieben Tiere halben Liter Tanks mit Wasser gefüllt Frosch [0,5 g / L Instant Meer und 2 mM Dinatriumhydrogenphosphat (Na 2 HPO 4: mw 141,96) pH 6,8]. Füttere sie, wie in Schritt 2.4, aber ändern Sie Wasser nur 2-3 mal pro Woche, wenn das Wasser trüb ist. Pflegen Sie die Tiere in einer 12-Stunden-Licht/12 dunklen Lichtzyklus mit die Lichter einschalten um 6 Uhr. </li><li> Legen Sie die Hälfte-Liter-Tank mit den Testpersonen auf einer weißen Fläche wie ein Labortisch Unterlage, mindestens 12 Stunden O / N, vor der Prüfung. </li><li> Test Kaulquappen in Stufen 45 bis 50, wie in Schritt 3 unten beschrieben. </li></ol> . 2 Pre-Verhalten Setup: Equipment <ol><li> Beiseite stellen einen Bereich der Labor-Test für das Verhalten. Es sollte in einer ruhigen, verkehrsarmen Bereich mit Standard-Leuchtstofflampen sein. </li><li> Vorbereitung der Testbehälter für die Tiere. Die verschachtelte, halb-Liter Testbehälter sind aus zwei Teilen: einem Innenbehälter, die das Wasser und Kaulquappen halten wird; und einen äußeren Tank mit dem visuellen Stimulus. <ol><li> Für den Innentank, machen Sie eine kleine Markierung auf den Außenecken mit einem Sharpie, 5 cm aus dem Boden; dies ist die Wasserleitung (1A, grün gestrichelte Linie). </li><li> Auch für den inneren Tank, füllen die divets im Behälter (in den Ecken und der Mitte) mit einer inerten Verbindung, wie Sylgard Elastomer. HINWEIS: Die Kaulquappen werden in diesen Bereichen aufhalten, wenn sie nicht ausgefüllt </li><li> Für den äußeren Behälter, Deckel genau eine Hälfte der Außenseite eines Tanks mit schwarzem Isolierband und die andere Hälfte mit dem weißen Papier 1B. </li></ol></li><li> Legen Sie die Tanks auf dieImpfen Drehscheibe. </li><li> Setup die Webcam / Stativ, so dass es über den Testtanks. Einstellen der Kamera auf die Visualisierung der Testfläche zu ermöglichen, wie in Fig. 1C gezeigt. </li><li> Schließen Sie die Webcam an einen Computer mit Quicktime Player Software installiert 5. Schalten Sie die Kamera ein. Im Quicktime Player unter Datei, wählen Sie &quot;Neue Video-Aufnahme.&quot; Das Verhalten Test-Setup wird sofort auf dem Computer sichtbar sein. </li><li> Drape ein leichtes Baumwolltuch über die gesamte Setup auf externe Signale, die Kaulquappe Verhalten beeinflussen könnten zu reduzieren, als auch auf der Oberfläche des Wassers zu reduzieren reflektierte Licht. </li><li> Sicherzustellen, dass die Leuchtdichte unter dem Tuch Maßnahmen zwischen 35-50 cd / m 2. </li></ol> 3. Verhalten Assay <ol><li> Füllen Sie den Innentank zur Prüfung 5 cm Wassermarke in Schritt 1.2.1 mit Frosch Wasser. </li><li> Mit einem kleinen Netz, sanft bewegen, das Tier in die innere Prüfung Tank. </li><li> Offene QuickTime Software auf dem Computer und mit dem Außentank als Leitfaden, stellen Sie sicher, dass die Kamera in der Lage ist, zu visualisieren und notieren Sie den Testbereich. </li><li> Schreiben Sie die Tiernamen, Datum und Zeit auf ein Stück Papier und notieren mit der Kamera. </li><li> Die Testbehälter in den Außenbehälter mit der schwarzen Seite des Behälters nach rechts 2. </li><li> Starten Sie die Filmaufnahme unmittelbar nach der Anordnung der Tank und setzen Timer für 2 min. </li><li> Nach dem Signal, entfernen Sie die inneren Testtank, drehen Sie den Außentank 180 ° und legen Sie den inneren Testtank im Inneren des Außentanks. Starten Sie den Timer. Hinweis: die schwarze Seite sollte nun auf der anderen Seite sein. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.7, acht weitere Male für insgesamt zehn Studien. Verwenden Sie Abbildung 2 als ein Führer, Abhaken jede Studie. </li><li> Wiederholen Sie den Test Verhalten an zwei verschiedenen Tagen. </li></ol> 4. Retinal Axotomie <ol><li> Tier in den 0,02% Tricaine bis sie nicht mehr reagiert werdenzu einem Schwanz mit einer Prise Nr. 3 Pinzette. </li><li> Schmelze 1% Agarose in 0,1 × MMR und dann zu einer 60 mm Petrischale hinzuzufügen. Nach dem Abkühlen einen kleinen rechteckigen Divot in der Agarose und fügen die Kaulquappe zum Divot mit wenig Tricaine 0,02%, so dass das Tier ist teilweise in die Flüssigkeit eingetaucht. </li><li> Die Schale in einem 45 Grad-Winkel hinter dem dorsalen Bereich des Auges mit einer 25 G Nadel, während die Abstützung des Tieres gegen Zange an der gegenüberliegenden Seite. </li><li> Kümmert sich nicht um die Ader, die neben dem Sehnerv liegt schnippeln, zu erreichen sorgfältig in das Loch mit der Pinzette Nr. 5, schnipp den Sehnerv und drehen Sie sie aus dem Weg. Wenn es schwere Blutungen aufgrund versehentlich Kappen der Arterie, dann schnell zu platzieren, das Tier in 2% Tricaine zu einschläfern. ACHTUNG: 2% Tricaine Lösung kann Taubheitsgefühl in den Menschen verursachen. Diese Lösung sollte mit Handschuhen angefasst werden. </li><li> Um das Tier zu bergen nach der Operation, legen Tier in 100 mm Petrischale mit 0,7 X MMR und 50 ug / ml Gentamicin für 20 min. Next, Transfer Kaulquappe zum Frosch Rückgewinnungstank mit Wasser. Lassen Tier Rest O / N. </li><li> Am nächsten Morgen, testen Sie die visuelle Funktion wie oben beschrieben (Schritte von 3,1 bis 3,9). </li></ol> 5. Analysieren Ergebnisse <ol><li> Nachdem die Studien abgeschlossen haben, messen Sie die Zeit, die der Kaulquappe bleibt auf der schwarzen Seite des Tanks. <ol><li> Manuell die Videos mit einer Software, die die Zeit anzeigt und ermöglicht häufigen Pausen. Schauen Sie sich die Video-Anzeigezeit. Notieren den Beginn der zwei-Minuten-Studie, die ist, wenn der Innentank erfolgreich verschachtelt innerhalb des Außenbehälters und wird im Hinblick auf die Kamera quadriert. </li><li> Verwenden Sie die Position der Augen des Kaulquappe ist zu definieren, welche Seite des Tanks werden die Tiere schwimmen auf. Definieren Sie über Kreuzung von einer Seite des Tanks auf die andere nur dann, wenn beide Augen haben die schwarz / weiße Linie gekreuzt. </li></ol></li><li> Notieren Sie sich den Anfang und das Ende jedes Intervalls (in sec), dass das Tier auf der schwarzen Seite verbringt. Pause und Wiederwickeln Sie das Video, um die Genauigkeit zu gewährleisten. Insgesamt sec die in jeder Studie. </li><li> Eingangs diese Zahlen in der beigefügten Verhalten Arbeitsblatt. Das Arbeitsblatt wird das Verhältnis der Zeit, dass das Tier auf der weißen Seite verbracht, indem die Zeit auf der schwarzen Seite des Tanks von der Gesamt 120 sec Versuch und Division durch die Gesamtzeit in Sekunden ausgegeben berechnen [(120 - Gesamtaufwand für Sekunden die schwarze Seite) / 120 sec]. Die Arbeitsblattdurchschnittswerte dieses Verhältnis über alle 10 Studien. </li><li> Verwenden Sie ein Student-T-Test, gepaart, two-tailed Verteilung zu bestimmen, ob die Prozesse zwischen den Tagen sind signifikant (P ≤ 0,05). </li></ol>

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	<li>Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+zebrafish+oculomotor+behavior+to+model+human+disorders.">Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders.</a> Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).</li><li>Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+modulation+of+temporal+properties+of+the+rod+pathway+in+larval+Xenopus.">Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus.</a> J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).</li><li>Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preference+for+background+color+of+the+Xenopus+laevis+tadpole.">Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole.</a> J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).</li><li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells.">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7 (8), (2009).</li><li>Choi, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cone+degeneration+following+rod+ablation+in+a+reversible+model+of+retinal+degeneration.">Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).</li><li>Viczian, A. S., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+determination+using+the+animal+cap+transplant+(ACT)+assay+in+Xenopus+laevis.">Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis.</a> J Vis Exp. 16 (39), (2010).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second-generation+device+for+automated+training+and+quantitative+behavior+analyses+of+molecularly-tractable+model+organisms.">A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms.</a> PLoS One. 5 (12), (2010).</li><li>Rosemberg, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+spatio-temporal+behavior+of+zebrafish+in+the+open+tank+paradigm+after+a+short-period+confinement+into+dark+and+bright+environments.">Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li><li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Avoidance+in+Xenopus+Tadpoles+is+Correlated+With+the+Maturation+of+Visual+Responses+in+the+Optic+Tectum.">Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum.</a> J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li><li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin+Elicits+Retinal+Fate+In+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells.">Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).</li><li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos.">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Wir berichten hier über eine einfache Vision geführte Verhaltenstest, die leicht in weniger als einer Woche durch minimal geschulte Laborpersonal durchgeführt werden können. Während andere Tests erfordern spezielle Ausrüstung und Know-how in das Verhalten der Tiere, ermöglicht dieser Test ein Schnelltest der visuellen Funktion zu bestimmen. Ein anderer Verhaltenstest, der Visual Avoidance Assay wurde entwickelt, um zu bestimmen, wie Tectum trägt zur visuellen Wahrnehmung in Xenopus 10. Dieser...

Xenopus laevis wurden als Modellorganismus zur Augenbildung studieren verwendet. Die Augen entwickeln schnell wachsenden Zeit in weniger als einer Woche zum Testen Gene oder Wege, die einen Einfluss auf die visuelle Entwicklung und Funktion haben. Um visuelle Funktion zu testen, hat die optokinetischen und optomotorischen Reaktion im Zebrafisch und Xenopus Kaulquappen verwendet wurde, bzw. 1,2. Da die Augen von Xenopus Kaulquappen sind relativ kleiner als Zebrafisch, dieser Test erfordert den Einsatz von Spezialgeräten und geschultes Personal, um die subtilen tail-Flip und Blickbewegungsverhalten in Xenopus zu erkennen. Ein robusteres Verhalten in Xenopus ist die Vorliebe für das Schwimmen in einem Tank mit einem weißen Hintergrund, die hier 3 beschrieben wird. Beim Platzieren einer Kaulquappe in einem halb schwarz / halb-weißen Tank, die Pre-metamorphen Kaulquappe schnell schwimmt auf der weißen Seite des Tanks. Bislang hatten wir diesen Test, um festzustellen, ob pluripotenten Zellen abgeleitetenAugen waren funktionellen 4. Hier berichten wir über eine detaillierte Version dieses Assays, die verwendet werden können, um die visuelle Funktion premetamorphic Xenopus-Kaulquappen testen. Dieser Test ist einfacher als der optomotorischen Reaktion Assay, da bedarf es nur einen montierten digitalen Camcorder, Digitalkamera-Software und Standard-Ausrüstung in den meisten Labors Xenopus gefunden. Darüber hinaus ist die aufgezeichnete Reaktion erfordert keine spezielle Ausbildung, um tally Ergebnisse. Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die gleiche Gruppe von Kaulquappen, mit Doppelnetzhaut Axotomie unterzogen, schwimmen zufällig um den Tank. Wir haben auch die Verhaltens Assay-Ergebnisse aus einer repräsentativen Kaulquappe, die zeigt, wie ein Auge für die visuelle Reaktion getestet werden. Ein Arbeitsblatt aufgenommen wurde, so daß während des Tests erworben Zahlen eingesetzt und ausgewertet werden. Dieses Arbeitsblatt kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob die getesteten Kaulquappen eine visuelle Antwort sein.

<table><tbody><tr><td>1/2 Gallon Flex-Tank with Cover</td><td>eNasco</td><td>SB19271M</td><td>Size: 5-3/8&quot; x 7&quot; x 3-3/4&quot;</td></tr><tr><td>Black electrical tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>White tissue paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large inoculating turntable</td><td>VWR</td><td>50809-022</td><td>Size: Dia 114.3 x&amp;nbsp; H 76.2 mm (4 1/2&amp;nbsp; x&amp;nbsp; 3&quot;)</td></tr><tr><td>Durasorb underpad</td><td>VWR</td><td>82004-836</td><td>Size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24&quot;)</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1945-34155-CS</td><td></td></tr><tr><td>Standard tripod</td><td></td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>iSight camera or webcam</td><td>Apple</td><td>M8817LL/A</td><td>Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see</td></tr><tr><td>Portable computer</td><td>Apple/PC</td><td>Various</td><td>We used a 13&quot; MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5</td></tr><tr><td>MiniDV handycam camcorder</td><td>SONY</td><td>DCR-HC42</td><td>Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Handycam station</td><td>SONY</td><td>DCRA-C121</td><td>This can be used for connecting firewire to camera</td></tr><tr><td>QuickTime Player software</td><td>Quicktime</td><td>Version 10.1</td><td></td></tr><tr><td>26 G Needle (5/8&quot; length)</td><td>VWR</td><td>BD305115</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate [50 mg/ml]</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-528Z</td><td>Stored at RT</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>Instant ocean</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-116528</td><td>Stock solution = 100 g/L stored at RT</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0876</td><td>Stock solution = 0.4 M stored at RT</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In vitro&lt;/em&gt; fertilized embryos</td><td>eNasco</td><td>LM00490MX</td><td>100 embryos/unit</td></tr></tbody></table>

a simple behavioral assay for testing visual function in xenopus laevis

Die Messung der visuellen Funktion in den Kaulquappen der Frösche, Xenopus laevis, ermöglicht Screening für Blindheit in lebenden Tieren. Der optokinetische Reaktion ist eine Vision-basierte, reflexive Verhalten, das in allen getesteten Wirbeltieren beobachtet worden ist. Tadpole Augen sind klein, so wurde der Schwanz Flip Antwort als alternative Maßnahme, die einen geschulten Techniker, um die subtile Antwort aufzeichnen erfordert verwendet. Wir haben eine alternative Verhalten Assay basiert auf der Tatsache, dass Kaulquappen lieber auf der weißen Seite eines Tanks schwimmen, wenn sie in einem Behälter mit sowohl Schwarz-Weiß-Seiten angeordnet. Die hier vorgestellte Test ist eine kostengünstige, einfache Alternative, die eine Antwort, die leicht gemessen wird erstellt. Der Aufbau besteht aus einem Stativ, Webcam und verschachtelte Prüfung Tanks, in den meisten Labors Xenopus leicht verfügbar. Dieser Artikel enthält einen Film, die das Verhalten von Kaulquappen, vor und nach dem Durchtrennen des Sehnervs. Um die Funktion von einem Auge zu testen, sind wir auch Vertretreter Ergebnisse einer Kaulquappe, in dem jedes Auge unterzog Netzhaut Axotomie an aufeinander folgenden Tagen. Zukünftige Studien könnten eine automatisierte Version dieses Tests für die Prüfung der Vision von vielen Kaulquappen auf einmal zu entwickeln.

Frühere Berichte haben gezeigt, dass Xenopus Kaulquappen premetamorphic lieber auf der weißen Seite einer schwarz / weißen Tank schwimmen und nannte diesen Test, der Hintergrundfarbe Vorlieben Assay 3 Wir haben diesen Test, um die visuelle Funktion eines Augen von Kaulquappen in testen geändert weniger als eine Woche. Auf diese Weise kann die Augen für die histologische Untersuchung gesammelt werden. Wir zeigen hier, wie die Reaktion durch visuelle Hinweise ist. In <...

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A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis Kaulquappen schwimmen lieber auf der weißen Seite einer schwarz / weißen Tank. Dieses Verhalten wird von ihrer Vision geleitet. Basierend auf diesem Verhalten stellen wir eine einfache Test, um die visuelle Funktion der Kaulquappen zu testen.

Eine einfache Verhaltenstest zur Prüfung von Visual Function in<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

a-simple-behavioral-assay-for-testing-visual-function-xenopus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

9.8K Aufrufe.  Center for Vision Research, SUNY Eye Institute, Upstate Medical University.  Xenopus laevis Kaulquappen schwimmen lieber auf der weißen Seite einer schwarz / weißen Tank. Dieses Verhalten wird von ihrer Vision geleitet. Basierend auf diesem Verhalten stellen wir eine einfache Test, um die visuelle Funktion der Kaulquappen zu testen. 

Serie: A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

A Behavioral Assay, um die Reaktionsfähigkeit der Zebrafisch zu Änderungen in Lichtintensitäten messen

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, robust, and simple to manipulate. A suitable model has been found in the optokinetic response (OKR), a reflexive behavior present in all vertebrates due to its high selection value. The OKR involves slow stimulus-following movements of eyes alternated with rapid resetting saccades. The measurement of this behavior is easily carried out in zebrafish larvae, due to its early and stable onset (fully developed after 96 hours post fertilization (hpf)), and benefitting from the thorough knowledge about zebrafish genetics, for decades one of the favored model organisms in this field. Meanwhile the analysis of similar mechanisms in adult fish has gained importance, particularly for pharmacological and toxicological applications.
Here we describe VisioTracker, a fully automated, high-throughput system for quantitative analysis of visual performance. The system is based on research carried out in the group of Prof. Stephan Neuhauss and was re-designed by TSE Systems. It consists of an immobilizing device for small fish monitored by a high-quality video camera equipped with a high-resolution zoom lens. The fish container is surrounded by a drum screen, upon which computer-generated stimulus patterns can be projected. Eye movements are recorded and automatically analyzed by the VisioTracker software package in real time.
Data analysis enables immediate recognition of parameters such as slow and fast phase duration, movement cycle frequency, slow-phase gain, visual acuity, and contrast sensitivity.
Typical results allow for example the rapid identification of visual system mutants that show no apparent alteration in wild type morphology, or the determination of quantitative effects of pharmacological or toxic and mutagenic agents on visual system performance.

The VisioTracker is an automated system for the quantitative analysis of visual performance of larval and small adult fish based on the recording of eye movements. It features full control over visual stimulus properties and real-time analysis, enabling high-throughput research in fields such as visual system development and function, pharmacology, neural circuit studies and sensorimotor integration.

VisioTracker, eine innovative automatisierte Ansatz zur oculomotorius Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Neurowissenschaften

The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple response. More recently adult visual behavior in zebrafish has become of interest, but methods to measure specific responses are new coming. To address this gap, we set out to develop a methodology to repeatedly and accurately utilize the optokinetic response (OKR) to measure visual acuity in adult zebrafish. Here we show that the adult zebrafish's visual acuity can be measured, including both binocular and monocular acuities. Because the fish is not harmed during the procedure, the visual acuity can be measured and compared over short or long periods of time. The visual acuity measurements described here can also be done quickly allowing for high throughput and for additional visual procedures if desired. This type of analysis is conducive to drug intervention studies or investigations of disease progression.

Zebrafish have been a valuable tool for many research areas. Here we demonstrate a method to elicit a visual response and calculate a functional visual acuity in the adult zebrafish.

Die optokinetischen Antwort als quantitatives Maß der Sehschärfe im Zebrafisch

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the  earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple  ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Mikroinjektion von DNA in Augenknospen in Xenopus laevis Embryonen und Bildgebung von GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Entwicklungsbiologie

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Tissue Bestimmung mit dem Tier Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the surface of the cornea, electrical activity generated in response to light can be measured and used to assess the activity of retinal cells in vivo. This manuscript describes the use of the ERG to measure visual function in zebrafish. Zebrafish have long been utilized as a model for vertebrate development due to the ease of gene suppression by morpholino oligonucleotides and pharmacological manipulation. At 5-10 dpf, only cones are functional in the larval retina. Therefore, the zebrafish, unlike other animals, is a powerful model system for the study of cone visual function in vivo. This protocol uses standard anesthesia, micromanipulation and stereomicroscopy protocols that are common in laboratories that perform zebrafish research. The outlined methods make use of standard electrophysiology equipment and a low light camera to guide the placement of the recording microelectrode onto the larval cornea. Finally, we demonstrate how a commercially available ERG stimulator/recorder originally designed for use with mice can easily be adapted for use with zebrafish. ERG of larval zebrafish provides an excellent method of assaying cone visual function in animals that have been modified by morpholino oligonucleotide injection as well as newer genome engineering techniques such as Zinc Finger Nucleases (ZFNs), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs), and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9, all of which have greatly increased the efficiency and efficacy of gene targeting in zebrafish. In addition, we take advantage of the ability of pharmacological agents to penetrate zebrafish larvae to evaluate the molecular components that contribute to the photoresponse. This protocol outlines a setup that can be modified and used by researchers with various experimental goals.

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Elektroretinogramm Analyse der Sicht Antwort in Zebrafisch-Larven

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

Funktionsauswertung olfaktorische Wege im Leben Xenopus Kaulquappen

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for the investigation of processes of neurodegeneration, neuroprotection and neuro-repair involving the visual system, as these often correlate well with retinal changes. As a functional readout, visually evoked compensatory eye and head movements are commonly used in experimental models involving the visual function. Combining both techniques allows a quantitative in vivo investigation of structure and function, which can be used to investigate the pathological conditions or to evaluate the potential of novel therapeutics. A great benefit of the presented techniques is the possibility to perform longitudinal analyses allowing the investigation of dynamic processes, reducing variability and cuts down the number of animals needed for the experiments. The protocol described aims to provide a manual for acquisition and analysis of high quality retinal scans of mice and rats using a low cost customized holder with an option to deliver inhalational anesthesia. Additionally, the proposed guide is intended as an instructional manual for researchers using optokinetic response (OKR) analysis in rodents, which can be adapted to their specific needs and interests.

A detailed protocol for the assessment of structural and visual readouts in rodents by optical coherence tomography and optokinetic response is presented. The results provide valuable insights for ophthalmologic as well as neurologic research.

Mit optischen Kohärenztomographie und optokinetischen Antwort als strukturelle und funktionelle visuelles System auslesen bei Mäusen und Ratten

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

Zebrafish Avoidance and Thigmotaxis Assay: A High-Throughput Method to Examine Larval Behavior in Response to Aversive Visual Stimulus

Source: Richendrfer, H., et al. <a href="https://www.jove.com/v/50622/" target="_blank">Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae</a>. &#160;J. Vis. Exp.&#160;(2013)
The video describes the avoidance and thigmotaxis assay of zebrafish larvae. The video examines the behavior of zebrafish larvae in response to visual aversive stimulus.

Zebrafischvermeidung und Thigmotaxis-Assay: Eine Hochdurchsatzmethode zur Untersuchung des Larvenverhaltens als Reaktion auf aversiven visuellen Reiz

Source: Richendrfer, H., et al. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. &#160;J. Vis. Exp.&#160;(2013)
The video describes the ...

Eine einfache Verhaltenstest zur Prüfung von Visual Function in

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