This work was funded by grant from the BBSRC (grant number BB/H019685/1 and BB/E527663/1) to the University of Exeter.

<ol>
	<li>Freyer, M. W., Lewis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry:+experimental+design,+data+analysis,+and+probing+macromolecule/ligand+binding+and+kinetic+interactions.">Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions.</a> Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).</li><li>Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorimetry+as+a+tool+for+understanding+biomolecular+interactions+and+an+aid+to+drug+design.">Calorimetry as a tool for understanding biomolecular interactions and an aid to drug design.</a> Biochem Soc Trans. 38, 888-893 (2010).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal Biochem. 377, 209-217 (2008).</li><li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery.">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> J Biomol Screen. 6, 429-440 (2001).</li><li>Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+denaturation+assays+in+chemical+biology.">Thermal denaturation assays in chemical biology.</a> Assay Drug Dev Technol. 10, 128-136 (2012).</li><li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies.">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Anal Biochem. 357, 289-298 (2006).</li><li>Lo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorescence-based+thermal+shift+assays+for+hit+identification+in+drug+discovery.">Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery.</a> Anal Biochem. 332, 153-159 (2004).</li><li>Nettleship, J. E., Brown, J., Groves, M. R., Geerlof, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+protein+characterization+by+mass+spectrometry,+thermal+shift+(ThermoFluor)+assay,+and+multiangle+or+static+light+scattering.">Methods for protein characterization by mass spectrometry, thermal shift (ThermoFluor) assay, and multiangle or static light scattering.</a> Methods Mol Biol. 426, 299-318 (2008).</li><li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability.">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).</li><li>Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+optimize+the+purification+and+crystallization+of+PLP-dependent+enzymes.">Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 68, 596-600 (2012).</li><li>Vedadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screening+methods+to+identify+ligands+that+promote+protein+stability,+protein+crystallization,+and+structure+determination.">Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15835-15840 (2006).</li><li>Davis, B. J., Erlanson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+from+our+mistakes:+the+'unknown+knowns'+in+fragment+screening.">Learning from our mistakes: the 'unknown knowns' in fragment screening.</a> Bioorg Med Chem Lett. 23, 2844-2852 (2013).</li><li>Larsson, A., Jansson, A., Aberg, A., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+hit+generation+and+structural+characterization+in+fragment-based+ligand+discovery.">Efficiency of hit generation and structural characterization in fragment-based ligand discovery.</a> Curr Opin Chem Biol. 15, 482-488 (2011).</li><li>Scott, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+fragment-based+approach+to+target+protein-protein+interactions.">Using a fragment-based approach to target protein-protein interactions.</a> Chembiochem. 14, 332-342 (2013).</li><li>Cimmperman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+model+of+thermal+stabilization+and+destabilization+of+proteins+by+ligands.">A quantitative model of thermal stabilization and destabilization of proteins by ligands.</a> Biophys. J. 95, 3222-3231 (2008).</li><li>Matulis, D., Kranz, J. K., Salemme, F. R., Todd, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+stability+of+carbonic+anhydrase:+measurements+of+binding+affinity+and+stoichiometry+using+ThermoFluor.">Thermodynamic stability of carbonic anhydrase: measurements of binding affinity and stoichiometry using ThermoFluor.</a> Biochemistry. 44, 5258-5266 (2005).</li><li>Zubriene, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nanomolar+dissociation+constants+by+titration+calorimetry+and+thermal+shift+assay+-+radicicol+binding+to+Hsp90+and+ethoxzolamide+binding+to+CAII.">Measurement of nanomolar dissociation constants by titration calorimetry and thermal shift assay - radicicol binding to Hsp90 and ethoxzolamide binding to CAII.</a> Int J Mol Sci. 10, 2662-2680 (2009).</li><li>Weiss, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hill+equation+revisited:+uses+and+misuses.">The Hill equation revisited: uses and misuses.</a> FASEB J. 11, 835-841 (1997).</li><li>Cuccui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Burkholderia+pseudomallei+K96243+capsular+polysaccharide+I+coding+region.">Characterization of the Burkholderia pseudomallei K96243 capsular polysaccharide I coding region.</a> Infect Immun. 80, 1209-1221 (2012).</li><li>DeShazer, D., Waag, D. M., Fritz, D. L., Woods, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Burkholderia+mallei+polysaccharide+gene+cluster+by+subtractive+hybridization+and+demonstration+that+the+encoded+capsule+is+an+essential+virulence+determinant.">Identification of a Burkholderia mallei polysaccharide gene cluster by subtractive hybridization and demonstration that the encoded capsule is an essential virulence determinant.</a> Microb Pathog. 30, 253-269 (2001).</li><li>Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Announcing+the+worldwide+Protein+Data+Bank.">Announcing the worldwide Protein Data Bank.</a> Nat Struct Biol. 10, 980 (2003).</li><li>Vivoli, M., Ayres, E., Beaumont, E., Isupov, M., Harmer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+WcbI,+a+novel+polysaccharide+biosynthesis+enzyme.">Structural insights into WcbI, a novel polysaccharide biosynthesis enzyme.</a> IUCr Journal. 1 (1), 28-38 (2014).</li><li>Sorrell, F. J., Greenwood, G. K., Birchall, K., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+differential+scanning+fluorimetry+based+high+throughput+screening+assay+for+the+discovery+of+affinity+binders+against+an+anthrax+protein.">Development of a differential scanning fluorimetry based high throughput screening assay for the discovery of affinity binders against an anthrax protein.</a> J Pharm Biomed Anal. 52, 802-808 (2010).</li><li>Uniewicz, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+fluorimetry+measurement+of+protein+stability+changes+upon+binding+to+glycosaminoglycans:+a+screening+test+for+binding+specificity.">Differential scanning fluorimetry measurement of protein stability changes upon binding to glycosaminoglycans: a screening test for binding specificity.</a> Anal Chem. 82, 3796-3802 (2010).</li><li>Wan, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+fluorimetry+as+secondary+screening+platform+for+small+molecule+inhibitors+of+Bcl-XL.">Differential scanning fluorimetry as secondary screening platform for small molecule inhibitors of Bcl-XL.</a> Cell Cycle. 8, 3943-3952 (2009).</li><li>Koropatkin, N. M., Holden, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+alpha-D-glucose-1-phosphate+cytidylyltransferase+from+Salmonella+typhi.">Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi.</a> J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).</li><li>Paleskava, A., Konevega, A. L., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+the+GTP-GDP-operated+conformational+switch+of+selenocysteine-specific+translation+factor+SelB.">Thermodynamics of the GTP-GDP-operated conformational switch of selenocysteine-specific translation factor SelB.</a> J Biol Chem. 287, 27906-27912 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have nothing to disclose.

fluorimetry סריקת ההפרש הוכיח את כוחה כשיטת חזקה ותכליתית לאפיון חלבונים, וזיהוי ligands חלבון הפוטנציאלי. ההצלחות המתועדות היטב בזירוז ייצוב חלבון, גילוי תרופות (במיוחד במעבדות פחות מימנו גם) והתגבשות 10,23-25 ​​עשו את זה בשיטה אטרקטיבית לסינון ראשוני של תרכובות. תרכובות הוסיפו לחלבונים מצביעות על עלייה ברורה במינון תלויה ב7,9 טמפרטורת התכה לכאורה. עם זאת, יש כבר כמה ניסיונות להשתמש בתוצאות מהניסויים אלה כדי לקבוע קבועים המחייבים לכאורה כדי לסייע בדירוג תרכובות לזיקה שלהם. כאן, אנו מציגים שיטה לקביעה באופן שיטתי קבוע דיסוציאציה לכאורה לחלבונים בנוכחות ליגנד. התוצאות שהוצגו כאן מראות כי DSF במהירות ובאופן עמיד יכול לספק הערכות של קבוע דיסוציאציה לשילוב חלבון ליגנד. ניתן להשפיע נתונים נצפו עם כלים זמינים מסחרי כדי לספק נחישות מהירה של ד K, ללא הצורך להניח הנחות באשר לערך הצפוי של פרמטרים. יש שיטת יתרון משמעותי על פני כמה בשיטות דומות של להיות חסכן בשני חלבונים וזמן הנדרשים. הניסוי המתואר כאן יצרוך 0.13 מ&quot;ג חלבון לכל ניסוי (כ 0.4 מ&quot;ג לניסויים חוזרים ונשנים בשלושה עותקים). זה משווה לטובה עם calorimetry טיטרציה בידוד התרמי (ITC), שבו ניסוי יחיד עם חלבון kDa 40 ממוצע יצרוך כמות דומה. הסט המלא של ניסויים הנדרשים לפרוטוקול זה היה לצרוך כ -4 שעות, כולל הכנה, לסט אחד של ניסויים. שוב, זו עשויה להיות משמעותי יותר מהר מאשר שיטות כגון ITC או תהודת plasmon פני השטח, אשר לעתים קרובות תוך עוצמה דורש אופטימיזציה ניכרת כדי להשיג נתונים הטובים ביותר. התוצאות שלנו מראות כי יש עדיין דרישה לבחון בזהירות את הנתונים הגולמיים, בכושר של נתונים אלה כדי לקבוע את טמפרטורת ההתכה, ואת ההתאמה של נתוני טמפרטורת התכה כדי לקבוע את קבוע דיסוציאציה. אתגר ראשון הוא הצורה של נתונים הגולמיים המופקים בהיתוך החלבון. בחלק מהמקרים, את הצורה לא להתקרב לזה שנצפה באיור 1 א. נושאים משותפים כוללים משמרות בטמפרטורה נמוכות על יגנד מחייבים, הקרינה רקע גבוהה, ומעברים מרובים יוצא דופן בטמפרטורה. משמרות טמפרטורה נמוכה נתפסות על כריכת מספר הליגנדים. לשיטה זו, הפרמטר הקריטי ביותר הוא השגיאה במדידת T מ &#39;, בהשוואה לשינוי הטמפרטורה. נתונים בדרך כלל יכולים להיות מצוידים בצורה סבירה כאשר סטיית התקן של מדידות בשלושה עותקים לא תעלה על 10% שינוי טמפרטורת ההתכה בין חלבון מאוגד וכרוך באופן מלא. הניסיון שלנו הוא שבו זמני כגוןמשמרות erature רק 2 מעלות צלזיוס, זה יכול להיות מספיק עבור התאמת הנתונים, אם נקודות נתוני הפרט הן מאוד מדויקות. נושא שני הוא בצורה יוצאת דופן עקום. אלה נבדלים לעתים קרובות בין חלבון החופשי וטפסים ליגנד קשורים, כיגנד המחייב משפיע התגלגלות מצבים של החלבון. במקרים אלה, המשתמש חייב לשקול אם הנתונים ניתן להשתמש עם התחשבות הולמת במודלים שישמשו לקביעת טמפרטורת התכה וקבועה דיסוציאציה. בעיה נפוצה נוספת היא כי תוספת של cofactor לחלבון (לדוגמא, MgCl 2 בדוגמא שלנו עם hexokinase) נדרש כדי להשיג את הנתונים אמינות ביותר. הניסיון שלנו היה ששיקול דעת של כל הגורמים צפויים בניסוי בשלב של לקיחת קריאות ראשוניות היא חיונית להשגת התוצאות הטובות ביותר. יתר על כן, טיפולים תיאורטי חלופיים יכולים לחשוף תכונות של נתונים אלה 15,17. לבסוף, אין זה נדיר עבור חלבונים מסוימים שגontain מקורי נחשף אזורים הידרופובי להראות הקרינה רקע גבוהה. ישנם מספר פתרונות לבעיות אלה, שנסקרו בהרחבה במקומות אחרים 6,9. בפרט, המשתמש חייב לשקול אם להשתמש בולצמן או מודלים נגזרים (למשל, איור 4), ובמקרה של שימוש בנגזרים, אם חייב להיות מודל נמס מרובה. שתי השיטות למידול תרמית התגלגלות שונות שבשיטה בולצמן מתאימה את נתוני ניסוי למשוואת בולצמן, בהנחת צורת sigmoidal רגילה לעקומת התגלגלות. בניגוד לכך, השיטה הנגזרת לוקחת הנגזרת הראשונה של נתוני ניסוי בכל נקודה (פנל תחתון באיור 1 א), ורואה את טמפרטורת ההתכה להיות הנקודה נגזרת הראשון הגבוה ביותר. השיטה הנגזרת, בדרך כלל, חוזרת טמפרטורת התכה גבוהה יותר בכ 2 - 3 מעלות צלזיוס. רוב החלבונים יחזרו עקביים יותרתוצאה (כלומר, סטיית ההתקן של טמפרטורת ההתכה לניסויים בשלושה עותקים הוא נמוכה יותר) לאחת משתי השיטות. זה בדרך כלל בצורה אינטימית הקשורים לצורה המדויקת של חלבון התגלגלות עקומה, ויש צורך לקבוע את השיטה הטובה ביותר בכל מקרה ומקרה באופן אמפירי. איפה המודל הנגזר משמש, חשוב גם לקחת בחשבון אירועי היתוך מרובים. חלק מהנתונים מראים בבירור ראיות למעברים מרובים, ובמקרים אלה התוצאות צפויות להיות קל יותר לפרש אם אירועי היתוך המרובים אלה הם מודל. בהקשר של פרוטוקול זה, הוא לעתים קרובות את המקרה כי התוספת של ליגנד יכולה לגרום לחלבון לעבור מיש מעברי היתוך מרובים למעבר בודד (למשל, על ידי ייצוב המשנה ביותר תרמית השבירה), או להיפך. היינו אפוא עו&quot;ד שהנתונים הגולמיים נבחנים יחד לפני שוקל גישה אשר יהיה הטוב ביותר לשימוש. בעקבות מ &#39;odelling של טמפרטורות התכה בודדות, נושאים נוספים יכולים להתעורר בהתאמה אלה לדגמים שהוצגו בסעיף בפרוטוקול. זה הכרחי כדי לבחון היטב את ההתאמה למשוואה הקבועה דיסוציאציה באמצעות סולם לוגריתמים, כמו ניתוח זה לעתים קרובות מדגיש פערים בין הנתונים שנצפו והמודל (ה .g., איור 3). בעוד התוצאות שהתקבלו הן בדרך כלל חזקות, טיפול בפרשנות מציע את ההזדמנות כדי לחלץ תוצאות טובות יותר, והמשמעות ביותר, מן הנתונים. נושא מסוים שהועלה על ידי נתונים אלה הוא הפרשנות שצריכה להיות ממוקם על חלבונים שמראים cooperativity, או אירועים המחייבים מרובים, בDSF. יש לנו, עד היום, רק בתופעה זו, בחלבונים שצפויים להיות להם אירועים המחייבים ספציפיים מרובים (למשל, WcbM, חלבון שטוב ביותר homologue הוא multimer 26, ואשר משמש כmultimer על כרומטוגרפיה הדרת גודל [נתונים לאמוצג]). זה בכלל לא ברור שcooperativity השלילי שנצפה בdenaturation DSF מצביע על כך שאנזים סופו של דבר להראות cooperativity השלילי: ולא, זה עשוי להיות סימן למחייב מורכבים שחייבים להיחקר באופן יסודי יותר באמצעות מגוון רחב יותר של שיטות. אין זה מרמז לנו, עם זאת, כי מחקרים מקיפים יותר של חלבונים כאלה עשויים לזהות תופעות מעניינות. ערכי הנתונים עבור קבוע דיסוציאציה שימוש בשיטה זו הם בדרך כלל באותו סדר כמו אלה המסופקים על ידי שיטות אחרות, כגון calorimetry טיטרציה הבידוד התרמי ותהודה plasmon פני השטח. עם זאת, הערכים מוחלטים שנצפו גבוהים יותר בתדירות גבוהה יותר מאשר נצפה באמצעות שיטות אלה. זה לפחות בחלקו מעובדה שקבוע דיסוציאציה הוא ציין בטמפרטורת ההתכה של החלבון עם ליגנד. ד K זה גבוה בדרך כלל מזו בטמפרטורות פיסיולוגיות. Dissociation קבוע קשור לטמפרטורה של התגובה על ידי המשוואות: <img alt="משוואת 1" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq1.jpg" /> [1] <img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq2.jpg" /> [2] (שבו θ c הוא ריכוז ההתייחסות הסטנדרטי, Δ r G הוא השינוי באנרגיה החופשי של גיבס של התגובה, R הוא קבוע גזים הטוחנות, Δ H הוא השינוי באנתלפיה בתגובה, וΔ S הוא שינוי אנטרופיה בתגובה .) תגובות עם קבועי דיסוציאציה בטווח המדידה של שיטה זו, בדרך כלל, יש לי G r Δ שלילי, ולכן ההשפעה של עלייה בטמפרטורה במשוואה [1] תהיה להגדיל את הניתוק מתמיד. שני מונחי Δ H וΔ S המהווים את האנרגיה החופשית של גיבס (משוואה [2]) הם temperaturדואר 27 תלויים, וההשפעה על קבוע דיסוציאציה יהיו תלוי בגודל ובסימן של תלות הטמפרטורה אלה, ובהכרח יהיו אינטראקציה תלויה. כתוצאה מכך, זה לא בלתי צפוי שקבועי דיסוציאציה נקבעו על ידי שיטה זו הם לעתים גדולים יותר מאלה שנקבעו על ידי שיטות הפועלות על RT. תלות בטמפרטורה גם היא, כמובן, אזהרה של שיטות רבות אחרות, שנוטים לספק את קבוע דיסוציאציה בטמפרטורות נמוכות מהטמפרטורה הפיזיולוגית. אזהרה נוספת של שיטת DSF היא שזה שיטה שכותרתו, בניגוד לITC. תווית הניאון משמשת (SYPRO Orange) היא הידרופובי, ולכן במקרים מסוימים יכולה להתחרות עם הכריכה של ליגנד הידרופובי לחלבונים. כתוצאה מכך, סביר להניח כי במקרים מסוימים, קבוע דיסוציאציה הושג יועלו באופן מלאכותי בשל תחרות עם התווית. עם זאת, לשם ההשוואה של הליגנדים מגוונים, (השימוש העיקרי שלDSF), ההבדלים צפויים להיות משמעותי מספיק כדי להשפיע על הדירוג של תרכובות על ידי זיקה. חסרון פוטנציאלי של שיטה זו הוא המגבלה של זיהוי שניתן להשיג. בעיקרון, זה לא אמור להיות אפשרי באופן מדויק למדידת ערך עבור ד K שאינו עולה על 50% מריכוז החלבון, ואפילו ערכים בטווח זה עשויים להיות דיוק מפוקפק. בעוד המגבלה של זיהוי בקצה הזה של הטווח ניתן להאריך מעט על ידי הפחתת הריכוזים של חלבון וצבע, הרגישות של המכשיר תהיה למנוע ירידה נוספת בריכוז חלבון. בדומה לכך, הקצה העליון של הרגישות שייקבע על ידי המסיסות של ליגנד. לקבלת אומדן מתמטי חזק לד K, חשוב ביותר לקבל נתונים עם 90% מהחלבון הנוכחי בצורה הנכנס ליגנד, אשר דורש ריכוז ליגנד להיות מקורבly עשר פעמים ד K (בהנחה שאין cooperativity). המגבלה של זיהוי ולכן תהיה בהכרח להיות עשירית מהמסיסות של ליגנד במאגר הרלוונטי. משמעות דבר היא כי גבולות זיהוי של השיטה ינועו בדרך כלל בין 1 מיקרומטר ובין 1 ו100 מ&quot;מ, בהתאם לחלבון ויגנד. לסיכום, fluorimetry סריקת ההפרש הוא טכניקה תכליתית החלים על מגוון רחב של חלבונים. שימוש בשיטות שהוצגו כאן, זה אפשרי במהירות ובזול כדי לקבוע את הזיקה של חלבון לליגנד שונה. זה יש פוטנציאל גדול לשימוש בטיהור חלבונים וייצוב, הבהרת הפונקציה או ספציפי של אנזימים מmetagenomes, ובגילוי תרופות, במיוחד במעבדות קטנות.

כל החלבונים יהיו לאגד, עם זיקות שונות, למגוון רחב של מולקולות אחרות מיונים פשוטים למקרומולקולות הגדולה אחרת. במקרים רבים, חלבונים נקשרים לשותפי מולקולה קטנים, כחלק מהתפקוד התקין שלהם (למשל, קינאז מחייב ATP). אינטראקציות אחרות עשויות להיות קשורות לתפקוד, אך בניסוי שימושי כמו כלים (לדוגמא, מולקולות קטנות שמייצבות חלבונים כדי לשפר את הצלחת גיבוש, או לסייע בשמירה על חלבונים בפתרון); בעוד מולקולות קטנות אשר נקלטות על ידי אתרים פעילים ואתרי allosteric של חלבונים יכול לשמש כמעכבים, וכך לווסת את הפעילות של אנזימים. יש מגוון רחב של טכניקות שיכולים לשמש כדי לקבוע את הזיקה של חלבונים למולקולות שותף. calorimetry טיטרציה בידוד התרמי 1 נתפס נרחב כמו &quot;תקן זהב&quot;, כפי שהוא מספק מידע עשיר על תגובות, הוא תווית חופשית, והגביל הזדמנויות לrtifacts של הניסוי. עם זאת, למרות השיפורים אחרונים ברגישות של המכשור והאוטומציה של הגדרה ניסיונית, זה עדיין יקר יחסית במונחים של דרישות חלבון, יש במקרה הטוב תפוקה נמוכה עד בינוני, ומתאים ביותר לאינטראקציות עם בינוני עד זיקות גבוהות (10 ננומטר לד K 100 מיקרומטר) 2. שיטות תווית אחרות ללא תשלום, כגון תהודת plasmon פני השטח או הצעת אינטרפרומטריה 3 bilayer תפוקה גבוהה יותר, והשיג הרגישות לזיהוי מולקולות קטנות יותר נמוכות כמו 100 Da. עם זאת, מכשירי תפוקה גבוהים לשיטות אלה הם יחסית יקרים, מוצדקים רק בו יהיו תפוקה מתמשכת של פרויקטים רלוונטיים, ולכן הם עלולים להיות בלתי נגישים לרבים מעבדות אקדמיות. fluorimetry ההפרש הסריקה (DSF, או thermofluor) תואר לראשונה בשנת 2001 4 כשיטה לגילוי סמים. בmetho זהד, חלבונים מודגרת עם צבע פלואורסצנטי (צבעים תחילה נפטלין-sulfonic שמשו), המשנה הקרינה שלה על כריכה לאזורים הידרופובי של החלבונים. מדגם חלבון צבען הוא מחומם ואז, והקרינה במעקב כחום עולה. התגלגלות של החלבון, וחשיפה של חלקים ההידרופובי של החלבון, מולידה דפוס אופייני בקרינה כפונקציה של הטמפרטורה (איור 1 א). הניסוי יכול להתבצע בכמויות קטנות בכל מכשיר PCR כמו מסחרי, וכן בניסוי אחד, מספר גדול של דגימות ניתן לבדוק בו זמנית (בדרך כלל 48, 96 או 384 דגימות, בהתאם לדגם המכשיר). בדרך כלל ניתן לבצע ניסויים ברחבי שעה, מתן האפשרות לניתוח תפוקה הגבוה של הדגימות 5. שיפורים נוספים למתודולוגיה שראו אימוץ של צבעים עם תכונות ספקטרליות טובות יותר 6,7 </sup&gt;, כלים גנריים לניתוח נתונים, והציעו פרוטוקולים לסינון ראשוני 8,9. מגוון רחב של יישומים של השיטה הורחב, עם דגש מיוחד על קביעת תנאים אופטימליים לעריכה ולאחסון של חלבונים 10, ועל זיהוי שותפים המחייבים פוטנציאל לסייע התגבשות 11. התפוקה גבוהה יחסית של השיטה, עלות נמוכה יחסית בחלבון (~ 2 מיקרוגרם לתגובה), והתחולה ללימוד מולקולות מחייבות חלשות הפכה DSF כלי רב ערך עבור עיצוב סמים בר מבוסס, במיוחד בהקשר אקדמי 12-14. למרות היישום הרחב של DSF לחקר אינטראקציות חלבון ליגנד, כמה מחקרים שתיארו את נחישות של קבועי דיסוציאציה ממחקרים אלה. עם זאת, אלה נוטים לייצר משוואות מפורטות המתארות את התגלגלות של החלבון, עם פרמטרים רבים שצריכה להיות מצוידת לנתונים דלילים או בחלק דואר המקריםstimated 7,15-17. שיטות אלה הן רלוונטיים במיוחד במקרים מאתגרים, כגון תרכובות בחוזקה מחייבות, או חלבונים בו מוצגות מעברים יוצאות דופן. עם זאת, למעבדות רבות, ניתוחים מפורטים אלה הם מסורבלים מדי לשימוש שיגרתי. לפיכך, אנו מציעים טיפולים אלטרנטיביים לתרחישים שונים, ולהדגים כיצד אלה יכולים לשמש כדי להתאים נתונים כתוצאה מאינטראקציות חלבון ליגנד שונות. השיטה שלנו משתמשת במכשיר StepOne qPCR, שלתוכנת ניתוח הנתונים העידו זמינה; בעוד זו מאיצה את ניתוח הנתונים, תוצאות ממכשירים אחרים יכולות להיות מעובד בשיטות שפורסמו בעבר 9, ואת אותו הניתוח במורד הזרם יכול להתבצע.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">StepOne real time PCR instrument</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4376357</td>
			<td style="width:167px;">DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis.</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Protein thermal shift software v1.0</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4466037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">MicroAmp Fast optical 48-well plates&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4375816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">Optical sealing tape&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4375323</td>
			<td>Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">U-bottomed 96-well plates</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td align="right">11521943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">SYPRO Orange</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S6650</td>
			<td>For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SPSS statistics version 20</td>
			<td style="width:71px;">IBM</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Other statistics packages will provide similar functionality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GraphPad Prism 6.02</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Other statistics packages will provide similar functionality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hand applicator (PA1)</td>
			<td style="width:71px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">75-3454-4264-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Fisher scientific</td>
			<td align="right">10141520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry

מגוון רחב של שיטות זמינים כעת לקביעת הניתוק המתמיד בין חלבון ואינטראקציה מולקולות קטנות. עם זאת, רוב אלה דורשים גישה לציוד מומחה, ולעתים קרובות דורש מידה מסוימת של מומחיות להקים ביעילות ניסויים אמינות ולנתח נתונים. fluorimetry סריקת ההפרש (DSF) נמצא בשימוש יותר ויותר כשיטת חזקה לסינון ראשוני של חלבונים לאינטראקצית מולקולות קטנות, או לזיהוי שותפים פיסיולוגיים או לגילוי להיט. טכניקה זו יש יתרון בכך שהיא דורשת רק מכונה PCR מתאימה לPCR כמותי, וכל כך מתאימה מכשור זמין ברוב המוסדות; מגוון מצוין של פרוטוקולים זמינים כבר; ויש תקדימים חזקים בספרות לשימושים מרובים של השיטה. העבודה האחרונה הציעה מספר דרכי חישוב קבועי דיסוציאציה מנתוני DSF, אבל אלה הם מבחינה מתמטית תובעניים. כאן, אנו DEMonstrate שיטה להערכת קבועי דיסוציאציה מכמות מתונה של נתונים ניסיוניים DSF. בדרך כלל יכולים להיות שנאספו נתונים אלה וניתחו בתוך יום אחד. אנו מדגימים כיצד שונים מודלים יכולים לשמש כדי להתאים את הנתונים שנאספו מאירועים המחייבים פשוטים, ובו אתרי קישור או עצמאיים מחייב שיתופיים נוכחים. לבסוף, אנו מציגים דוגמא לניתוח נתונים במקרה שבו מודלים סטנדרטיים אינם חלים. שיטות אלו מאוירות עם נתונים שנאספו על חלבוני שליטה זמינים מסחרי, ושני חלבונים מתכנית המחקר שלנו. בסך הכל, השיטה שלנו מספקת דרך פשוטה לחוקרים כדי לקבל תובנה נוספת לתוך אינטראקציות חלבון ליגנד באמצעות DSF במהירות.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry at JoVE.com

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

נחישות של אינטראקציות חלבון ליגנד שימוש דיפרנציאל סריקת Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

determination-protein-ligand-interactions-using-differential-scanning

Research

JoVE Journal

Biology

61.3K Views.  University of Exeter. Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Video: Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

שלב ניגודיות הפרעות דיפרנציאלי ניגודיות (DIC) מיקרוסקופית

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

ריכוז חלבון Microvolume קביעת באמצעות 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

רקמות קביעת שווי שימוש בבעלי חיים להשתלות (ACT) Assay ב Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

שימוש Coculture לזהות אינטראקציות interspecies המתווכת כימית

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

גילוי אינטראקציות חלבון ואפיון תפקוד חלבון באמצעות HaloTag טכנולוגיה

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

קביעת פני התא יחסית והביטוי סה&quot;כ של תעלות יונים רקומביננטי שימוש cytometry זרימה

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

אוסף זרע באיכות דיפרנציאלית בעזרת צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...