Name: measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions at JoVE.com

V ח וו ר נתמכה על ידי מדעי הטבע מקגיל תוכנית אימונים הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC) ב- Bionanomachines. א ק מ ופי אי ג'יי נתמכו על ידי מענקים NSERC 327028-09 (א ק ז), 238562 (פי אי ג'יי).

1. הכנת הדוגמא
<ol><li>לטהר את biomolecule הרצוי13. הערה: זה פרוטוקול שימושים לרכוש קוקאין-איגוד ה-DNA aptamer MN4 לאחר החלפת נגד 2 M NaCl 3 פעמים ואחריו שלושה סבבי מים יונים באמצעות מסנן צנטריפוגלי עם קרום ניתוק משקל מולקולרי 3 kDa.</li>
	<li>לסנתז, לטהר, או לרכוש את הרצוי ליגנד thermolabile13. הערה: MN4 נקשר ליגנד thermolabile הקוקאין. MN4 נקשר גם כינין, אשר משמש פקד שלילי ליגנד thermolability בטמפרטורות אלה ניסיוני.</li>
	<li>להכין מאגרי דיאליזה של biomolecule מטוהרים והפירוק של ליגנדים (מאגר NaCl נתרן פוספט ו- 140 מ מ 20 מ מ, pH 7.4, MN4, את ליגנדים המשמש כאן).</li>
	<li>Dialyze את biomolecule נגד לפחות 2 L מאגר באמצעות דיאליזה אבובים עם 0.5 - 1.0 kDa ניתוק.</li>
	<li>לסנן המאגר הסופי (המכונה מאגר עובדים) דרך מסנן 0.2 µm יש כבר equilibrated ביסודיות עם מאגר.</li>
	<li>שוקל את ההמונים ליגנדים הרצוי, לפזר אותם במאגר העבודה מסוננים. אם הריכוזים ליגנד הרצוי לדרוש גושים קטנים מדי לשקול במדויק, ליצור פתרון מניות ליגנד מרוכז (10 x למשל). הערה: זה הכרחי כי כל הניסויים DSC לנצל את המאגר לעבוד באותו המדגם, ליגנד, קרי, לא לבצע ניסוי שבו ליגנד הוא מומס אצווה שונה מאגר עובדים מאשר biomolecule כמו זה יגרום מאגר חפצים אי התאמה של הנתונים.</li>
	<li>לסנן את הפתרון מניות biomolecule דרך מסנן 0.2 µm יש כבר equilibrated ביסודיות באמצעות מאגר עובדים.</li>
	<li>לקבוע את הריכוז biomolecule על ידי ספיגת מדידות (260 ננומטר עבור חומצות גרעין כמו MN4 ו- 280 ננומטר חלבונים).</li>
	<li>לאחסן את biomolecule מוכן ואת ליגנד במקרר 4 ° C (מתאים MN4 של ליגנדים המשמש כאן), או ב-20 או -80 ° C אם biomolecule ואת ליגנדים לסבול הקפאה ואחסון לטווח ארוך נדרש. דגה הפתרונות מאגר, biomolecule וליגנד מלמעלה בטבלה degasser (ראה טבלה של חומרים) לפני טעינה אל DSC. הערה: Degassing מסייעת למנוע היווצרות בועה ב DSC בטמפרטורות גבוהות יותר. בועות לגרום חפצים אות שמחשיך DSC שיא וצורות בסיסיות.</li>
</ol>2. DSC הכנה
<ol><li>לפרק ידית לחץ מ DSC (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>הפעל סיליקון אבובים מתוך המאגר עבודה ולחבר אותו מקורבות הקדמי (מתכת פתיחה) של נים ההפניה.</li>
	<li>ליצור גשר בין הנימים הפניה, לדוגמה על-ידי חיבור והסתיר את הפניית האחוריים והסתיר דגימת קבלה.</li>
	<li>צרף פיסת סיליקון אבובים מקורבות אחורי מדגם שפועל אל בקבוק פסולת עם קו ואקום מצורף.</li>
	<li>הפעל את הקו ואקום לרוקן את DSC עם 200 מ ל מאגר עובדים.</li>
	<li>לטעון את נימי הפניה של DSC עם מאגר עובדים. לצרף בערך 3-5 ס מ מקטעים של סיליקון אבובים flanges נימי ההפניה.</li>
	<li>להוסיף טיפ פיפטה 1 מ"ל סיליקון אבובים של מקורבות אחורי. לצייר 0.8 מ של מאגר עובדים עם פיפטה והכנס את הטיפ פיפטה עם מאגר לתוך צינורות סיליקון של מקורבות אסמכתא קבלה.</li>
	<li>לחץ בעדינות על הבוכנה פיפטה אל מעבר המאגר לעבוד דרך לאורך צינור סיליקון קבלה לתוך נימי הפניה ומצורפת למעלה לתוך של לכנף אחורית טיפ פיפטה. לחץ כלפי מטה הבוכנה פיפטה עד רמת מאגר עובדים מגיע בדיוק מעל לאורך צינור סיליקון הקבלה, ואז לשחרר את הבוכנה פיפטה עד רמת מאגר עובדים מגיע בדיוק מעל לאורך צינור אחורי סיליקון.<ol>
<li>חזור על העברת מאגר עובדים הלוך לטהר את עוצמת הקול נימי הפניה של בועות. הערה: בדרך כלל, עובר 10 של הפתרון הלוך מספיקים לנקות את כל הבועות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>קאפ הקצה האחורי פיפטה עם האגודל ומשוך בעדינות פיפטה אחורי עצה, פיפטה קבלה כדי להסיר אותם מן flanges ההפניה עם לאורך צינור סיליקון המצורפת.</li>
	<li>לטעון את נימי מדגם באמצעות מאגר עובדים כמו מדרגות 2.6 2.9. במקום כובע פלסטיק שחור על ההפניה אחורי, לטעום flanges, עוזב את אוגן קדמי חשפו.</li>
	<li>לצרף את הידית לחץ.</li>
	<li>לפתוח את התוכנה DSC (ראה טבלה של חומרים), לדחוס את המכשיר על ידי לחיצה על החץ בחלק העליון של הממשק האדום העולה למעלה ברגע הקריאה כוח התייצב; הכוח DSC מסומן בתוך קופסה בחלק העליון הימני של הממשק יחד עם כלי טמפרטורה, קריאה לחץ. הערה: הצג הכוח לקרוא גם DSC הרמטי סיליקון. שינויים בשלטון של יותר מ ~ 10 µW מצביעים על היווצרות בועה הנימים, אשר יכול לגרום חפצים הנתונים. הפתרונות חייבים להיות הוסר, degassed נוסף לפני שתמשיך.</li>
	<li>Equilibrate על DSC עם מאגר עובדים על-ידי ביצוע סריקה ואחורה. בכרטיסיה "השיטה הניסיונית" בצד שמאל של המסך, ודא כי האפשרות "סריקה" נבחרה לנהל את DSC ב טמפרטורה ומצב סריקה. הערה: ניסיוני הפרמטרים הם הטמפרטורה סריקה טווח, קצב סריקה, חום נמוך וגבוה equilibration זמן ומספר של סריקות.<ol>
<li>שיבוץ "טמפרטורה פרמטרים" תחת הלשונית "השיטה הניסיונית", לחץ על הלחצן "חימום". הזן 1 ו- 100 ° C בטמפרטורות ניסיוני העליון והתחתון, 1 ° C/דקה את קצב הסריקה, 60 s עבור התקופה equilibration.</li>
		<li>לחץ על לחצן "הוסף סדרה" תחת השדה קלט עבור התקופה equilibration. הזן 2 לתוך השדה "להוסיף שלבים" בחלון מוקפץ (עבור אחד סריקה הקירור והחימום אחד) וסמן את התיבה "חלופי חימום/קירור". לחץ על "אישור"; הסריקות שנוספו מופיעים בחלק התחתון של הממשק. בדוק הפרמטרים עבור כל סריקה הם כמו הרצוי.</li>
		<li>להתחיל את הניסוי על-ידי לחיצה על הכפתור הירוק "לשחק" בחלק העליון של הממשק. נווט אל התיקיה הרצויה, קלט שם קובץ לשמירת הניסוי בחלון מוקפץ. להציג את התקדמות הניסוי על-ידי לחיצה על הכרטיסיה "נתונים" בצד ימין של הכרטיסייה "שיטת הניסוי".</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. איסוף Datasets DSC ליגנד Thermolabile
הערה: ההליך מינימלית כוללת חמישה ניסויים: מאגר ניסויים הפניה עם ובלי ליגנד (שימוש עבור חיסור בסיסית, ראה דיון), לטעום ניסויים עם biomolecule ללא תשלום, biomolecule מאוגד-ליגנד, ו ליגנד-מחויב biomolecule עם פרק זמן ארוך יותר equilibration בטמפרטורה גבוהה.
<ol><li>עורכים ניסויים הפניה עבור חיסור בסיסית של הנתונים לדוגמה. רענן את DSC עם מאגר עובדים בשני נימים ולאסוף מספר סריקות ואחורה על טווח טמפרטורה מתאימים ב- 1 ° C דקות-1 עם ממריץ (חום גבוה) equilibration הזמן של 120 s.<ol>
<li>למחוק את הסריקות equilibration מאגר קודמות בחלק התחתון של הממשק על-ידי סימון כל אחד בנפרד, לחיצה על ה-X האדום באמצע נכון של הממשק. הוסף את הסריקות החדש על ידי לחיצה על לחצן "הוסף סדרה", כניסה 20 את השדה "צעדים כדי להוסיף" סימון התיבה "חלופי חימום/קירור". לחץ על אישור והפעל את הניסוי על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה הירוקה כמפורט לעיל.</li>
		<li>חזור על שלבים 3.1 - 3.1.1 עם עבודה מאגר המכיל את הריכוז הרצויה של ליגנד ב שני נימים כדי להשיג את ההפניה ניסויים עבור ליגנד (לאסוף שני ניסויים נפרדים באמצעות 120 s ו- 600 s בטמפרטורה גבוהה equilibration פעמים בהתאמה, כדי לשמש להשגת על קצב קבוע עבור המרה ליגנד thermolabile). הערה: קצב הסריקה המשמש כאן מבטיח biomolecule בניסויים הבאים ב שיווי משקל תרמי סריקות ואחורה (ראה דיון). סרוק המחירים < 0.1-0.2 ° C דקות-1 להוביל thermograms רועש ו אינם ישימים בניסויים DSC. הטמפרטורות כדאי להאריך מן מתחת טמפרטורת ההיתוך biomolecule חינם טוב מעל טמפרטורת ההיתוך רווי-ליגנד biomolecule (~ 20-80 ° C עבור MN4). ודא הפארמצבטית של הסריקות (עבור דוגמה, קדימה 10 וסריקות הפוכה 10 20 הכולל מספיקה).</li>
		<li>אם משתמש ליגנדים מרובים (כגון קוקאין כינין), לרוקן את DSC עם 200 מ ל מאגר עובדים (אני חוזר משלב 2.5) בין פועל כדי להסיר ליגנד הנימים ולמנוע זיהום צולב. הערה: מומלץ לבצע ניסוי שכפל על biomolecule חינם לאחר ריצה ליגנד מאוגד על מנת לבדוק אם ליגנד הקודם adsorbs בחוזקה אל קירות נימי, אינו מוסר בצורה הולמת עם מאגר שטיפה. אם thermograms עבור biomolecule חינם מופיעה כדי להיות מוזז בסדר גודל גדול יותר, טמפרטורת דנטורציה גבוהה לאחר הניסוי ליגנד מכורך, סביר להניח כי ליגנד הקודם הוא עדיין נוכח קלורימטר לאחר שטיפה. הסר את ליגנד הספוחה על-ידי המקננת הנימים עם 20% Contrad-70 לשעה ב 60 מעלות צלזיוס עם מכסי פלסטיק, ידית לחץ. בתוכנה DSC, שנו את מצב ניסיוני כדי "איזותרמי" תחת הכרטיסיה השיטה הניסיונית 3,600 לבחור s עבור משך ו- 60 ° C עבור הטמפרטורה איזותרמי, עם אפס שהוזנו עבור הזמן equilibration. לחץ על "הוסף את השיטה הניסיונית". הניסוי איזותרמי מופיע בחלק התחתון של המסך. לאחר השלמת, לשטוף את המכשיר עם יונים 2 ל' מים וחזור מ שלב 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עורכים ניסויים מדגם באמצעות אותו DSC טעינת הליך ופרמטרים ניסיוני כמו סורק ההפניה. עבור ערכת הנתונים biomolecule חינם, ודא כי נימי הפניה מכיל מאגר עובדים בזמן נימי מדגם מכיל את biomolecule חינם-הריכוז הרצוי במאגר עבודה.<ol>
<li>לניסויים מאוגד-ליגנד, ודא ליגנד נמצאת במאגר לעבוד בנים הפניה, biomolecule בתוספת ליגנד נמצאים במאגר לעבוד בנים הדגימה. לרוקן את המערכת בין תוספות של ליגנדים שונים כמו שלב 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בצע אחד ניסוי נוסף עם biomolecule חייב ליגנד thermolabile איפה התקופה equilibration בטמפרטורה גבוהה מוגברת 600 s ו פרמטרים ניסיוני אחרים הם כמו שלב 3.2.1. הערה: משך תקופת equilibration בטמפרטורה גבוהה עבור הניסוי השני ליגנד מכורך פשוט נבחר כדי להבטיח ליגנד מדולדל במהירות רבה יותר מאשר הניסוי זמן קצר equilibration. אם הפסגות ליגנד מכורך מהראשון ניסוי דעיכה לאט כפונקציה של מספר סריקה (למשל, הבדלי שיא רצופים maxima נמצאים ≤ 0.5 ° C), הערכת 10 - עד 20 פי מגביר את תקופת equilibration בטמפרטורה גבוהה על מנת שלמאחה לרוקן את ליגנד במהלך הניסוי השני. חישוב מדויק קבוע קצב לגיור ליגנד דורש כי הניסוי השני יש דלדול מואץ ליגנד ביחס הראשון. הריכוזים ליגנד שחולצו מן הבדיקה הכללית של שני ניסויים יהיו דומים, ולכן בלתי שמיש אם דלדול ליגנד היא לא מספיק מואצת של הניסוי השני.</li>
</ol>4. עיבוד נתונים
<ol><li>פתח DSC ניסוי קבצים בתוכנת ניתוח נתונים DSC (ראה טבלה של חומרים) ולייצא את הנתונים בעצמתה כמו גליונות אלקטרוניים.</li>
	<li>לייבא את גליונות אלקטרוניים המכילה את נתוני כוח גולמי לתוך תוכנת עבור נתונים מתאים.</li>
	<li>בסיסית להחסיר את הנתונים לדוגמה על-ידי חיסור מאגר נתונים כוח מ חופשי וניסויים מאוגד-ליגנד biomolecule. הערה: עבור הניסוי ליגנד thermolabile, הריכוז של ליגנד הראשונית הולך ופוחת עם כל סריקה. לכן, הוא אידיאלי כדי לחסר את הסריקה מאגר 1 באמצעות סריקה מדגם 1, וכן הלאה. מצאנו כי הסריקות מאגר עם קוקאין אינם משתנים ניכרת ההמרה ליגנד התמורה, ולכן סריקת מאגר יחיד ליגנד thermolabile יכול לשמש כדי לחסר את כל הנתונים מאוגד-ליגנד thermolabile.</li>
	<li>המרת הנתונים כוח לדוגמה המופחת בסיסית קיבול חום. הערה: ההמרה מחייבת של biomolecule חלקי אחסון מסוים, אשר יכול להיות מוערך14,15,16. המשוואה לחישוב המרת כוח קיבול חום כבר שתוארה לעיל17.</li>
</ol>5. ניתוח נתונים
<ol><li>באופן כללי להתאים את equilibration קצר זמן thermolabile קיבול חום של ליגנד מאוגד נתונים (dataset) עם ערכה אחת של תוכנית בסיסית, ליגנד, קיפול לריכוז ליגנד תיחום פרמטרים כפי שתואר לעיל4.</li>
	<li>חזור על שהעולמי מתאים ערכת הנתונים זמן equilibration זמן כדי לחשב את שיעור קבוע לגיור ליגנד thermolabile כפי שתואר לעיל4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry+in+life+science:+thermodynamics,+stability,+molecular+recognition+and+application+in+drug+design.">Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design.</a> Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).</li><li>Privalov, P. L., Dragan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetry+of+biological+macromolecules.">Microcalorimetry of biological macromolecules.</a> Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).</li><li>Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+strong+to+ultratight+protein+interactions+using+differential+scanning+calorimetry.">Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry.</a> Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).</li><li>Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+characterization+of+folding+and+binding+interactions+with+thermolabile+ligands+by+DSC.">Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC.</a> Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).</li><li>Garbett, N. C., Chaires, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+studies+for+drug+design+and+screening.">Thermodynamic studies for drug design and screening.</a> Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).</li><li>Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+binding+thermodynamics+in+drug+discovery.">Measurements of binding thermodynamics in drug discovery.</a> Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).</li><li>Plotnikov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions.">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li><li>Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics-based+drug+design:+strategies+for+inhibiting+protein-protein+interactions.">Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions.</a> Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).</li><li>Peri&#225;nez Parraga, L., G-L, A., Gam&#243;n Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado S&#225;nchez, O., Puigvent&#243;s Latorre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolabile+Drugs.+Operating+Procedure+In+the+Event+of+Cold+Chain+Failure.">Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure.</a> Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).</li><li>Murray, J. B., Alshora, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+Cocaine+in+Aqueous-Solution.">Stability of Cocaine in Aqueous-Solution.</a> J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).</li><li>Waterman, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+in+pharmaceutical+formulations.">Hydrolysis in pharmaceutical formulations.</a> Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).</li><li>Mergny, J. L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thermal+melting+curves.">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li><li>Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+a+stem+length-dependent+binding+mechanism+for+the+cocaine-binding+aptamer.+A+combined+NMR+and+calorimetry+study.">Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study.</a> Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).</li><li>Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+electrophoretic+and+hydrodynamic+properties+of+DNA+and+RNA+oligonucleotide+duplexes.">Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes.</a> Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).</li><li>Durchschlag, H., Hinz, H. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , 45-128 (1986).</li><li>Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomenological+partial-specific+volumes+for+G-quadruplex+DNAs.">Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs.</a> Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).</li><li>Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Protein+Folding+Cooperativity+by+Differential+Scanning+Calorimetry+and+NMR+Spectroscopy.">Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy.</a> J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).</li><li>Reinstein, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinine+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer.+Thermodynamic+and+hydrodynamic+analysis+of+high-affinity+binding+of+an+off-target+ligand.">Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand.</a> Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).</li><li>Tellinghuisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+error+propagation.">Statistical error propagation.</a> J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).</li><li>Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+thermodynamic+analysis+of+reversible+unfolding+processes.">Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes.</a> J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

שינויים ופתרון בעיות
הפרטים של הניתוח התאמה העולמית בשימוש איור 1 , איור 2 היה שתואר לעיל4. כאן, אנחנו חלוקה לרמות ההיבטים המעשיים של ביצוע וניתוח DSC מחייב בין ניסויים ליגנדים thermolabile. שימו לב כי תוכנית בסיסית DSC להשיג עבור ?...

דיפרנציאלית סריקה calorimetry (DSC) היא שיטה חזקה עבור איגוד למערכות ביולוגיות quantitating ומתקפלים אינטראקציות1,2,3. נקודות החוזק של DSC כוללים את יכולתו להבהיר מחייב וקיפול מנגנונים, תשואה של2,המקביל פרמטרים תרמודינמי3. יתר על כן, DSC יכול להתבצע בפתרון בתנאים ליד-פיזיולוגיים, לא דורשת תיוג של biomolecule או ליגנד, למשל, עם fluorophores, ספין-תוויות או גרעינית איזוטופים4. המכשיר סורק בטמפרטורה, מודדים את כמות החום הדרושה כדי denature את biomolecule, הנוכחות ואת היעדר ליגנד. Thermograms שנוצר משמשים כדי לחלץ את הפרמטרים תרמודינמי המסדירים את ליגנד מחייב וקיפול תהליכים. המידע שנמסר על ידי DSC או בטכניקות אחרות תרמודינמי חיוני המנחה את העיצוב של שהתרופות המתוות מולקולות1,5,6,7,8. עם זאת, סריקה חוזרת ונשנית לטמפרטורות גבוהות (~ 60-100 ° C) יכול להיות בעייתי. לדוגמה, תרכובות הם חשובים רבים עוברים סידור או ריקבון על חשיפה מתמשכת בטמפרטורות גבוהות9,10,11, קרי, הם thermolabile. בחינה של איגוד אינטראקציות על ידי DSC בדרך כלל דורש מספר סריקות ואחורה כדי לאמת את הפארמצבטית של תמוגרפיה ניתוח תרמודינמי12. המרה תרמי של ליגנד הראשונית בטופס משני עם איגוד שינו מאפיינים מוביל בולטת הבדלים הצורה והמיקום של thermograms רצופות, מאז ריכוז ליגנד הראשונית יורדת עם כל סריקה בזמן ההמרה התרמית מוצרים לצבור. אלה נתונים (datasets) נתונות לא ניתוח מסורתי.
לאחרונה פיתחנו שיטת המדידה הכללית datasets ליגנד thermolabile DSC המניבה את הערכה המלאה של פרמטרים תרמודינמי המסדירים את הקיפולים למערכות ביולוגיות ואיגוד אינטראקציות של ניסוי מאוגד-ליגנד אחד הפניה תמוגרפיה כנדרש עבור חינם biomolecule4. הניתוח מקטין את זמן הניסוי ואת מדגם הנדרש על-ידי ~ 10-fold בהשוואה הגישות DSC סטנדרטי. יש לנו פיתרון ליגנד ההמרה התרמית שייטול את זה קורה במהלך החלק בטמפרטורה גבוהה של כל סריקה איפה תמוגרפיה אינו תלוי בריכוז ליגנד. לכן, ריכוז ליגנד הוא קבוע בתוך החלק של תמוגרפיה המשמש כדי לחלץ תרמודינמי פרמטרים. בנוסף להדגים איך קצב קבוע לגיור תרמי ליגנד יכולה להיות מושגת על ידי ביצוע ניסוי משלים אחד עם פרק זמן ארוך יותר equilibration בטמפרטורה גבוהה. עבור מערכות ההמרה התרמית ליגנד איפה פחות תלוית טמפרטורה (קרי, המתרחשים ניכרת בטמפרטורות כל), הניתוח יכול להיות שונה כדי לכלול ריכוזים ליגנד משתנה. כאן אנחנו מוכיחים את הליך זה עבור aptamer DNA MN4 בנוכחות הקוקאין ליגנד thermolabile, אשר ממירה במהירות benzoylecgonine בטמפרטורות גבוהות (> 60 ° C). כינין משמש פקד שלילי ליגנד thermolability כיוון שהוא אינו עובר המרה בטמפרטורות אלה ניסיוני נקשר גם MN4. אנו מתארים הרכישה של ליגנד thermolabile DSC datasets וניתוח שלהם מניב פרמטרים תרמודינמי, קינטי של קיפול, איגוד, ליגנד תהליכי ההמרה.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Chem Impex</td><td>#00829</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71502</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Deioinized water for molecular biology</td><td>Millipore</td><td>H20MB1001</td><td></td></tr><tr><td>0.2 micron sterile syringe filters</td><td>VWR</td><td>CA28145-477</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa centrifugal filters</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>131048</td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td></td></tr><tr><td>Plastic DSC flange caps</td><td>TA Instruments</td><td>6111</td><td></td></tr><tr><td>DNA aptamer MN4</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td><td></td></tr><tr><td>Cocaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C008</td><td></td></tr><tr><td>Quinine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22620</td><td></td></tr><tr><td>NanoDSC-III microcalorimeter</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td><td></td></tr><tr><td>DSCRun software</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>NanoAnalyze software</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>Contrad-70</td><td>VWR</td><td>89233-152</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions

דיפרנציאלית סריקה calorimetry (DSC) היא טכניקה חזקה לכימות תנועת תרמודינמי פרמטרים הנוגעים למערכות ביולוגיות קיפול ואינטראקציות מחייב. מידע זה חיוני בעיצוב של תרכובות פרמצבטיות חדש. אולם, רבים ליגנדים הרלוונטיים הם הם לא יציב מבחינה כימית בטמפרטורות גבוהות בשימוש DSC ניתוחים. לפיכך, מדידת אינטראקציות מחייב הוא מאתגר כי הריכוזים של ליגנדים ומוצרים המרה תרמית משתנים ללא הרף בתוך התא קלורימטר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול באמצעות ליגנדים thermolabile ו DSC להשגת במהירות מידע תרמודינמי קינטי קיפול, האיגוד, לבין ליגנד תהליכי ההמרה. אנחנו החלת שיטת שלנו aptamer ה-DNA MN4 המאגד הקוקאין ליגנד thermolabile. באמצעות ניתוח כללי התאמה חדשים that חשבונות for ליגנד thermolabile ההמרה, הערכה המלאה של קיפול ופרמטרים איגוד מתקבלים מן זוג ניסויים DSC. בנוסף, נראה כי ניתן להשיג את קצב קבוע עבור המרה ליגנד thermolabile עם dataset DSC משלים אחד בלבד. ההנחיות לזיהוי וניתוח נתונים של מספר תרחישים יותר מסובך מוצגים, כולל צבירת בלתי הפיך של biomolecule, קיפול איטי, איגוד איטי, דלדול מהירה ליגנד thermolabile.

נציג נתונים עבור DSC ליגנד thermolabile מוצגים באיור1. המיקום ואת גובה הפסגה מאוגד-ליגנד thermolabile במרוכז משמרות לכיוון של biomolecule לא מאוגד כמו ליגנד thermolabile תיגמר עם כל סריקה (איור 1 א'). הפרופיל דנטורציה חינם משמש כייחוס עבור נקודת הקצה של ליגנד thermolabile...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions at JoVE.com

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

אנו מציגים פרוטוקול פלואורסנציה למערכות ביולוגיות קיפול ואיגוד אינטראקציות עם thermolabile ליגנדים שימוש דיפרנציאלי calorimetry סריקה מהירה.

מדידת למערכות ביולוגיות DSC פרופילים עם Thermolabile ליגנדים לאפיין במהירות קיפול ואיגוד אינטראקציות

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

measuring-biomolecular-dsc-profiles-with-thermolabile-ligands-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.2K Views.  McGill University. אנו מציגים פרוטוקול פלואורסנציה למערכות ביולוגיות קיפול ואיגוד אינטראקציות עם thermolabile ליגנדים שימוש דיפרנציאלי calorimetry סריקה מהירה.

Video: Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance. The abundance of membrane proteins in cells underlies the need for comprehensive study of the folding of this ubiquitous family of proteins. Additionally, advances in our ability to characterize diseases associated with misfolded proteins have motivated significant experimental and theoretical efforts in the field of protein folding. Rapid progress in this important field is unfortunately hindered by the inherent challenges associated with membrane proteins and the complexity of the folding mechanism. Here, we outline an experimental procedure for measuring the thermodynamic property of the Gibbs free energy of unfolding in the absence of denaturant, &Delta;G&deg;H2O, for a representative integral membrane protein from E. coli. This protocol focuses on the application of fluorescence spectroscopy to determine equilibrium populations of folded and unfolded states as a function of denaturant concentration. Experimental considerations for the preparation of synthetic lipid vesicles as well as key steps in the data analysis procedure are highlighted. This technique is versatile and may be pursued with different types of denaturant, including temperature and pH, as well as in various folding environments of lipids and micelles. The current protocol is one that can be generalized to any membrane or soluble protein that meets the set of criteria discussed below.

This video article details the experimental procedure for obtaining the Gibbs free energy of membrane protein folding by tryptophan fluorescence.

תרמודינמיקה של קיפול חלבונים ממברנה נמדד על ידי הקרינה ספקטרוסקופיה

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Bioengineering

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the case of protein samples, DSC profiles provide information about thermal stability, and to some extent serves as a structural &#8220;fingerprint&#8221; that can be used to assess structural conformation. It is performed using a differential scanning calorimeter that measures the thermal transition temperature (melting temperature; Tm) and the energy required to disrupt the interactions stabilizing the tertiary structure (enthalpy; &#8710;H) of proteins. Comparisons are made between formulations as well as production lots, and differences in derived values indicate differences in thermal stability and structural conformation. Data illustrating the use of DSC in an industrial setting for stability studies as well as monitoring key manufacturing steps are provided as proof of the effectiveness of this protocol. In comparison to other methods for assessing the thermal stability of protein conformations, DSC is cost-effective, requires few sample preparation steps, and also provides a complete thermodynamic profile of the protein unfolding process.

Differential scanning calorimetry measures the thermal transition temperature(s) and total heat energy required to denature a protein. Results obtained are used to assess the thermal stability of protein antigens in vaccine formulations.

Calorimetry סריקה דיפרנציאל - שיטה להערכת יציבות תרמית ומבנה של Antigen חלבון

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

מדידת אינטראקציות של חלבונים הכדוריים, Filamentous על ידי תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR) Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

שימוש בתרמופורזה מיקרומטרית למדידת אינטראקציות בין חלבון לליפיד

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer composition). The utility of TSA, and specifically of nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF), has been established over the years, both for finding conditions that help stabilize a specific protein and for looking at ligand binding by monitoring changes in the apparent Tm. This paper presents an efficient screening of the Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) fragment library (768 compounds) by the use of nano-DSF, monitoring Tm to identify potential fragment binding. The prerequisites regarding protein quality and concentration for performing nano-DSF experiments are briefly outlined followed by a step-by-step protocol that uses a nano-liter robotic dispenser commonly used in structural biology laboratories for preparing the required samples in 96-well plates. The protocol describes how the reagent mixtures are transferred to the capillaries needed for nano-DSF measurements. In addition, this paper provides protocols to measure thermal denaturation (monitoring intrinsic tryptophan fluorescence) and aggregation (monitoring light back-scattering) and the subsequent steps for data transfer and analysis. Finally, screening experiments with three different protein targets are discussed to illustrate the use of this procedure in the context of lead discovery campaigns. The overall principle of the method described can be easily transferred to other fragment libraries or adapted to other instruments.

Monitoring changes in the melting temperature of a target protein (i.e., thermal shift assay, TSA) is an efficient method for screening fragment libraries of a few hundred compounds. We present a TSA protocol implementing robotics-assisted nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) for monitoring intrinsic tryptophan fluorescence and light back-scattering for fragment screening.

פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית להקרנה בתגלית עופרת מבוססת שבר

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

<meta charset="utf8"></head><body>מבחני הזזה תרמית בתפוקה גבוהה עבור אינטראקציות חלבון-ליגנד

Utilizing Thermal Shift Assay to Probe Substrate Binding to Selenoprotein O

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although bioinformatic and structural predictions have contributed to the study of unknown proteins, in vitro experimental validations are often hampered by the optimal conditions and cofactors required for biochemical activity. Cofactor binding is not only essential for the activity of some enzymes but may also enhance the thermal stability of the protein. One practical application of this phenomenon lies in utilizing the change in thermal stability, as measured by alterations in the protein's melting temperature, to probe ligand binding. 
Thermal shift assay (TSA) can be used to analyze the binding of different ligands to the protein of interest or find a stabilizing condition to perform experiments such as X-ray crystallography. Here we will describe a protocol for TSA utilizing the pseudokinase, Selenoprotein O (SelO), for a simple and high-throughput method for testing metal and nucleotide binding. In contrast to canonical kinases, SelO binds ATP in an inverted orientation to catalyze the transfer of AMP to the hydroxyl side chains of proteins in a posttranslational modification known as protein AMPylation. By leveraging the shift in the melting temperatures, we provide crucial insights into the molecular interactions underlying SelO function.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: קידום מחקרים מבניים וביוכימיים של חלבונים באמצעות מבחני שינוי תרמי

Here, we present the thermal shift assay, a high-throughput, fluorescence-based technique used to investigate the binding of small molecules to proteins of interest.

שימוש בבדיקת הזזה תרמית לבדיקת קשירת מצע לסלנופרוטאין O

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although ...

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction. In biological sciences, macromolecular interactions are essential in understanding the machinery of the cell. Experimental conditions, such as buffer and temperature, can be tailored to the particular binding system being studied. However, careful planning is needed since certain ligand and macromolecule concentration ranges are necessary to obtain useful data. Concentrations of the macromolecule and ligand need to be accurately determined for reliable results. Care also needs to be taken when preparing the samples as impurities can significantly affect the experiment. When ITC experiments, along with controls, are performed properly, useful binding information, such as the stoichiometry, affinity and enthalpy, are obtained. By running additional experiments under different buffer or temperature conditions, more detailed information can be obtained about the system. A protocol for the basic setup of an ITC experiment is given.

A general protocol for the use of isothermal titration calorimetry to monitor the binding thermodynamics for biological systems with moderate binding affinities is presented.

טיטרציה Calorimetry מקורר באופן איזוטרמי עבור מדידת מקרומולקולה-ליגנד זיקה

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction.  In biological ...

Biology

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

מדידת למערכות ביולוגיות DSC פרופילים עם Thermolabile ליגנדים לאפיין במהירות קיפול ואיגוד אינטראקציות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

תרמודינמיקה של קיפול חלבונים ממברנה נמדד על ידי הקרינה ספקטרוסקופיה

Calorimetry סריקה דיפרנציאל - שיטה להערכת יציבות תרמית ומבנה של Antigen חלבון

מדידת אינטראקציות של חלבונים הכדוריים, Filamentous על ידי תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR) Microscale Thermophoresis (MST)

שימוש בתרמופורזה מיקרומטרית למדידת אינטראקציות בין חלבון לליפיד

פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית להקרנה בתגלית עופרת מבוססת שבר

שימוש בבדיקת הזזה תרמית לבדיקת קשירת מצע לסלנופרוטאין O

שימוש בבדיקת הזזה תרמית לבדיקת קשירת מצע לסלנופרוטאין O

שימוש בבדיקת הזזה תרמית לבדיקת קשירת מצע לסלנופרוטאין O

טיטרציה Calorimetry מקורר באופן איזוטרמי עבור מדידת מקרומולקולה-ליגנד זיקה

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale